人参四物汤对成瘾动物胸腺T细胞亚群增殖及IL-2R的作用研究
作者：刘屏 李宾 王淑民 陈孟莉 陈世铭
单位：解放军总医院药理研究室，北京100853
关键词：吗啡依赖；人参四物汤；细胞增殖；IL-2R
中国免疫学杂志990811 摘 要 目的：观察吗啡对胸腺细胞CD4，CD8细胞周期增殖、IL-2 的影响及人参四物汤对其调节作用。方法：小剂量递增给药建立吗啡成瘾动物模型后，采用流式细胞仪分析各组小鼠胸腺CD4、CD8细胞DNA含量、增殖指数以及IL-2R的情况。结果：吗啡成瘾组小鼠CD4、CD8细胞S，G2+M期和增殖指数显著低于正常组和人参四物汤组动物，而G0/G1期高于后二者；吗啡依赖小鼠IL-2R表达下降，人参四物汤组动物的T细胞表面IL-2R表达有明显增加。结论：吗啡使胸腺细胞DNA复制受阻导致功能细胞减少，IL-2R表达下降，人参四物汤可对抗吗啡的上述作用。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.1
The relationship between IL-2R and proliferation of cell in morphine dependent mice and potential effect of Chinese medicine
LIU Ping, LI Bin, WANG Shu-Min et al. Department of Clinical Pharmacology of 301 Hospital,Beijing 100853
Abstract Objective:To observe the affect of morphine on proliferation of cyclic cells and IL-2R in mice, and effect of Ginseng SiWu decoction. Method:Kunming mice model for chronic dependence was developed by s. c. morphine, by flow cytometry the proliferation of cyclic cells and the levels of IL-2R were assay, and the activity of Ginseng SiWu decoction was investigated. Result:The G0/G1 phase of T subsets(CD4,CD8) were significantly higher and S, G2+M phase lower, and IL-2R expression in morphine-dependence mice than Ns and Ginseng SiWu group. Conclusion:Morphine inhibited the DNA copy of cell cycle of thymus lymphocyte subsets and IL-2R expression, Ginseng SiWu decoction was able to regulate it.
, 百拇医药
Key words IL-2R T cell subsets proliferation Chinese medicine Morphine dependent
研究表明，吗啡明显损伤动物和人类的免疫功能[1]，人参四物汤可对抗吗啡的免疫抑制作用[2]。本文采用流式细胞仪观察人参四物汤对吗啡成瘾小鼠胸腺细胞亚群DNA含量、增殖指数和IL-2R的变化以及人参四物汤的作用，进一步了解其作用环节和作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物 昆明种小鼠,雄性,7周龄，体重18～22 g，军事医学科学院实验动物中心提供。
1.2 药品 盐酸吗啡粉为本院药库提供。盐酸钠络酮粉为军事医学科学院药物毒物所提供。RNase为Sigma公司产品。CD4，CD8单抗为pharmigen公司提供。人参由本院临床医学基础研究所免疫室提供。碘化丙啶(PI)由本院临床医学基础研究所免疫室提供，四物汤为本室提取制作(1 ml相当于生药2 g)。
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1.3 仪器 流式细胞测定仪为FACS-Calib型，解放军总医院仪器中心。
1.4 吗啡成瘾小鼠模型的建立、胸腺淋巴细胞CD4，CD8亚群及细胞周期分析 建立吗啡成瘾小鼠模型[3]，人参四物汤组动物从注射吗啡第1天起，即开始灌胃给药(2次/日，0.1 ml/10 g)。小鼠成瘾后处死小鼠，制备胸腺细胞悬液(细胞计数1×106)，上流式细胞仪分析[4]，每份样本获取分析测定1×104个细胞，增殖指数(PI)按下式计算： PI=(S+G2-M)/(G0/G1+S+G2-M)。
1.5 IL-2R测定 小鼠眼球取血100 μl，加入IL-2R单抗(FITC)，置4℃保持30 min，加入红细胞裂解液，5 min后去除上清液，用PBS液洗涤2次后上机。每份样本平均测定1×104个细胞[5]。
, 百拇医药
2 结果
2.1 各组小鼠CD4、CD8亚群细胞各期DNA含量和增殖活性结果见表1和表2。吗啡成瘾组小鼠CD4、CD8亚群G0/G1期显著高于正常组和人参四物汤组动物，而S期、G2-M期含量和增殖指数则显著低于后二组。
表1 各组动物胸腺淋巴细胞亚群CD4细胞周期DNA含量、增殖指数(n=10)
Tab.1 The proliferation of cyclic cells and PI of CD4 subsets in morphine dependence mice (n=10) Groups
G0/G1
, 百拇医药
G2+M
S
PI
NS
79.07±6.90
5.42±0.83
19.60±7.02
0.22±0.07
Morphine
92.16±1.581)
0.21±0.031)2)
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8.43±3.601)2)
0.07±0.011)2)
Mor.+Gineng SiWu
81.44±8.29
4.56±0.68
12.69±4.39
0.19±0.02
Note:1) P<0.01 compared with NS group; 2) P<0.01， compared with Ginseng SiWu group表2 各组动物胸腺淋巴细胞亚群CD8细胞周期DNA含量、增殖指数(n=10)
, 百拇医药
Tab.2 The proliferation of cyclic cells and PI of CD8 subsets in morphine dependence mice (n=10) Groups
G0/G1
G2+M
S
PI
NS
86.13±3.48
6.96±0.33
13.19±5.50
, 百拇医药
0.14±0.04
Morphine
91.42±1.621)
0.17±0.061)2)
5.17±1.301)2)
0.05±0.0091)2)
Ginseng SiWu
85.21±2.16
4.79±1.16
9.46±1.60
, http://www.100md.com
0.13±0.06
Note:P<0.01 compared with NS group; 2) P<0.01, compared with Ginseng SiWu group2.2 各组小鼠淋巴细胞表面IL-2R表达 吗啡依赖小鼠T细胞IL-2R的表达显著下降，与正常动物相比有明显差异，人参四物汤组动物的T细胞表面IL-2R表达与吗啡组相比有明显差异，见表3。
表3 各组动物淋巴细胞表面IL-2R表达(n=10)
Tab.3 The expression of IL-2R in morphine dependence mice (n=10) Groups
IL-2R-FITC
NS
, http://www.100md.com
8.08±1.09
Morphine
3.84±0.491)2)
Mor.+Ginseng
5.21±1.401)
Note:1)P<0.01 compared with NS group; 2) P<0.01，compared with Ginseng SiWu group3 讨论
处于增殖期的细胞按DNA合成前期(G1)-DNA合成期(S)-合成后期(G2)-有丝分裂期(M)完成一次分裂。另有部分细胞暂时处于休止状态，遇到适当信息刺激后再进入增殖周期(G0)，增殖指数可反映细胞增殖分裂的趋势[6]。本实验结果表明吗啡可引起细胞DNA复制障碍，使胸腺CD4，CD8亚群细胞阻滞于G0/G1期，仅有少量细胞进入S期和G2-M期。有研究认为，吗啡引起的胸腺淋巴细胞亚群数目减少，是由于胸腺细胞死亡所致[7]，根据本实验结果，我们认为除上述机制外，吗啡对它们有直接的损伤作用，抑制了胸腺CD4，CD8亚群细胞的DNA复制，亦可导致功能细胞减少。此外，本实验中吗啡依赖小鼠细胞的IL-2R表达显著下降，可能是由于吗啡抑制了胸腺CD4，CD8亚群细胞的DNA复制，导致外周血中功能细胞减少，因而T淋巴细胞的IL-2R表达量也减少。
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本研究结果表明，人参四物汤可促进成瘾动物胸腺CD4，CD8亚群细胞从G0/G1期进入S/G2-M期，该组动物增殖指数与正常组动物相比无显著差异，且T细胞表面IL-2R表达有明显增加，虽不及正常动物，但与吗啡组相比有明显差异，这些结果提示人参四物汤通过促进淋巴细胞亚群DNA合成和细胞分化而促进吗啡成瘾动物胸腺CD4，CD8亚群细胞的增殖和分化，这是其增加T细胞亚群数目、对抗吗啡细胞免疫抑制作用的机制之一[8]。
国家中医药管理局科研基金资助项目95B155
解放军总医院实验仪器中心，北京 100853
北京同仁医院临床药理室，北京 100000
, 百拇医药 作者简介：刘 屏，女，43岁，副研究员，硕士生导师，主要从事中药药理研究
4 参考文献
1 陆正武，吴 涛，林志斌.吗啡的免疫抑制作用.中国药物依赖性通报，1993；2(3)：164
2 刘 屏，张遵一，李 涛 et al. 吗啡对小鼠免疫功能的影响及人参四物汤的缓解作用.中国免疫学杂志，1994；10(增)：142
3 刘 屏，陈世铭，陈慧瑛 et al. 吗啡成瘾动物模型建立及钙阻滞剂作用研究.中国药物依赖性通报，1996；5(1)：16
4 胡智勇，朱圣禾.流式细胞仪分析淋巴细胞亚群含量.中国免疫学杂志，1994；10(增刊)：98
5 Diamantsein T, Osawa H, Mouzaki A et al. Regulattion of IL-2R expression and receptor release. Mole Immunol, 1986;23:1165
6 Renato B. 细胞周期中的生化事件.北京：北京师范大学出版社，1985：172
7 Sei Y, Yoshimoto K, Mcintyre T et al. Morphine-induced thymic hypopla-sia is glucocorticoid-dependent. J Immunology, 1991;146:194
8 邓文龙主编.中医方剂的药理与应用.重庆：重庆出版社，1990：40-46
〔收稿1998-01-26 二次修回1999-02-10〕, 百拇医药
单位：解放军总医院药理研究室，北京100853
关键词：吗啡依赖；人参四物汤；细胞增殖；IL-2R
中国免疫学杂志990811 摘 要 目的：观察吗啡对胸腺细胞CD4，CD8细胞周期增殖、IL-2 的影响及人参四物汤对其调节作用。方法：小剂量递增给药建立吗啡成瘾动物模型后，采用流式细胞仪分析各组小鼠胸腺CD4、CD8细胞DNA含量、增殖指数以及IL-2R的情况。结果：吗啡成瘾组小鼠CD4、CD8细胞S，G2+M期和增殖指数显著低于正常组和人参四物汤组动物，而G0/G1期高于后二者；吗啡依赖小鼠IL-2R表达下降，人参四物汤组动物的T细胞表面IL-2R表达有明显增加。结论：吗啡使胸腺细胞DNA复制受阻导致功能细胞减少，IL-2R表达下降，人参四物汤可对抗吗啡的上述作用。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.1
The relationship between IL-2R and proliferation of cell in morphine dependent mice and potential effect of Chinese medicine
LIU Ping, LI Bin, WANG Shu-Min et al. Department of Clinical Pharmacology of 301 Hospital,Beijing 100853
Abstract Objective:To observe the affect of morphine on proliferation of cyclic cells and IL-2R in mice, and effect of Ginseng SiWu decoction. Method:Kunming mice model for chronic dependence was developed by s. c. morphine, by flow cytometry the proliferation of cyclic cells and the levels of IL-2R were assay, and the activity of Ginseng SiWu decoction was investigated. Result:The G0/G1 phase of T subsets(CD4,CD8) were significantly higher and S, G2+M phase lower, and IL-2R expression in morphine-dependence mice than Ns and Ginseng SiWu group. Conclusion:Morphine inhibited the DNA copy of cell cycle of thymus lymphocyte subsets and IL-2R expression, Ginseng SiWu decoction was able to regulate it.
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Key words IL-2R T cell subsets proliferation Chinese medicine Morphine dependent
研究表明，吗啡明显损伤动物和人类的免疫功能[1]，人参四物汤可对抗吗啡的免疫抑制作用[2]。本文采用流式细胞仪观察人参四物汤对吗啡成瘾小鼠胸腺细胞亚群DNA含量、增殖指数和IL-2R的变化以及人参四物汤的作用，进一步了解其作用环节和作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物 昆明种小鼠,雄性,7周龄，体重18～22 g，军事医学科学院实验动物中心提供。
1.2 药品 盐酸吗啡粉为本院药库提供。盐酸钠络酮粉为军事医学科学院药物毒物所提供。RNase为Sigma公司产品。CD4，CD8单抗为pharmigen公司提供。人参由本院临床医学基础研究所免疫室提供。碘化丙啶(PI)由本院临床医学基础研究所免疫室提供，四物汤为本室提取制作(1 ml相当于生药2 g)。
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1.3 仪器 流式细胞测定仪为FACS-Calib型，解放军总医院仪器中心。
1.4 吗啡成瘾小鼠模型的建立、胸腺淋巴细胞CD4，CD8亚群及细胞周期分析 建立吗啡成瘾小鼠模型[3]，人参四物汤组动物从注射吗啡第1天起，即开始灌胃给药(2次/日，0.1 ml/10 g)。小鼠成瘾后处死小鼠，制备胸腺细胞悬液(细胞计数1×106)，上流式细胞仪分析[4]，每份样本获取分析测定1×104个细胞，增殖指数(PI)按下式计算： PI=(S+G2-M)/(G0/G1+S+G2-M)。
1.5 IL-2R测定 小鼠眼球取血100 μl，加入IL-2R单抗(FITC)，置4℃保持30 min，加入红细胞裂解液，5 min后去除上清液，用PBS液洗涤2次后上机。每份样本平均测定1×104个细胞[5]。
, 百拇医药
2 结果
2.1 各组小鼠CD4、CD8亚群细胞各期DNA含量和增殖活性结果见表1和表2。吗啡成瘾组小鼠CD4、CD8亚群G0/G1期显著高于正常组和人参四物汤组动物，而S期、G2-M期含量和增殖指数则显著低于后二组。
表1 各组动物胸腺淋巴细胞亚群CD4细胞周期DNA含量、增殖指数(n=10)
Tab.1 The proliferation of cyclic cells and PI of CD4 subsets in morphine dependence mice (n=10) Groups
G0/G1
, 百拇医药
G2+M
S
PI
NS
79.07±6.90
5.42±0.83
19.60±7.02
0.22±0.07
Morphine
92.16±1.581)
0.21±0.031)2)
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8.43±3.601)2)
0.07±0.011)2)
Mor.+Gineng SiWu
81.44±8.29
4.56±0.68
12.69±4.39
0.19±0.02
Note:1) P<0.01 compared with NS group; 2) P<0.01， compared with Ginseng SiWu group表2 各组动物胸腺淋巴细胞亚群CD8细胞周期DNA含量、增殖指数(n=10)
, 百拇医药
Tab.2 The proliferation of cyclic cells and PI of CD8 subsets in morphine dependence mice (n=10) Groups
G0/G1
G2+M
S
PI
NS
86.13±3.48
6.96±0.33
13.19±5.50
, 百拇医药
0.14±0.04
Morphine
91.42±1.621)
0.17±0.061)2)
5.17±1.301)2)
0.05±0.0091)2)
Ginseng SiWu
85.21±2.16
4.79±1.16
9.46±1.60
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0.13±0.06
Note:P<0.01 compared with NS group; 2) P<0.01, compared with Ginseng SiWu group2.2 各组小鼠淋巴细胞表面IL-2R表达 吗啡依赖小鼠T细胞IL-2R的表达显著下降，与正常动物相比有明显差异，人参四物汤组动物的T细胞表面IL-2R表达与吗啡组相比有明显差异，见表3。
表3 各组动物淋巴细胞表面IL-2R表达(n=10)
Tab.3 The expression of IL-2R in morphine dependence mice (n=10) Groups
IL-2R-FITC
NS
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8.08±1.09
Morphine
3.84±0.491)2)
Mor.+Ginseng
5.21±1.401)
Note:1)P<0.01 compared with NS group; 2) P<0.01，compared with Ginseng SiWu group3 讨论
处于增殖期的细胞按DNA合成前期(G1)-DNA合成期(S)-合成后期(G2)-有丝分裂期(M)完成一次分裂。另有部分细胞暂时处于休止状态，遇到适当信息刺激后再进入增殖周期(G0)，增殖指数可反映细胞增殖分裂的趋势[6]。本实验结果表明吗啡可引起细胞DNA复制障碍，使胸腺CD4，CD8亚群细胞阻滞于G0/G1期，仅有少量细胞进入S期和G2-M期。有研究认为，吗啡引起的胸腺淋巴细胞亚群数目减少，是由于胸腺细胞死亡所致[7]，根据本实验结果，我们认为除上述机制外，吗啡对它们有直接的损伤作用，抑制了胸腺CD4，CD8亚群细胞的DNA复制，亦可导致功能细胞减少。此外，本实验中吗啡依赖小鼠细胞的IL-2R表达显著下降，可能是由于吗啡抑制了胸腺CD4，CD8亚群细胞的DNA复制，导致外周血中功能细胞减少，因而T淋巴细胞的IL-2R表达量也减少。
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本研究结果表明，人参四物汤可促进成瘾动物胸腺CD4，CD8亚群细胞从G0/G1期进入S/G2-M期，该组动物增殖指数与正常组动物相比无显著差异，且T细胞表面IL-2R表达有明显增加，虽不及正常动物，但与吗啡组相比有明显差异，这些结果提示人参四物汤通过促进淋巴细胞亚群DNA合成和细胞分化而促进吗啡成瘾动物胸腺CD4，CD8亚群细胞的增殖和分化，这是其增加T细胞亚群数目、对抗吗啡细胞免疫抑制作用的机制之一[8]。
国家中医药管理局科研基金资助项目95B155
解放军总医院实验仪器中心，北京 100853
北京同仁医院临床药理室，北京 100000
, 百拇医药 作者简介：刘 屏，女，43岁，副研究员，硕士生导师，主要从事中药药理研究
4 参考文献
1 陆正武，吴 涛，林志斌.吗啡的免疫抑制作用.中国药物依赖性通报，1993；2(3)：164
2 刘 屏，张遵一，李 涛 et al. 吗啡对小鼠免疫功能的影响及人参四物汤的缓解作用.中国免疫学杂志，1994；10(增)：142
3 刘 屏，陈世铭，陈慧瑛 et al. 吗啡成瘾动物模型建立及钙阻滞剂作用研究.中国药物依赖性通报，1996；5(1)：16
4 胡智勇，朱圣禾.流式细胞仪分析淋巴细胞亚群含量.中国免疫学杂志，1994；10(增刊)：98
5 Diamantsein T, Osawa H, Mouzaki A et al. Regulattion of IL-2R expression and receptor release. Mole Immunol, 1986;23:1165
6 Renato B. 细胞周期中的生化事件.北京：北京师范大学出版社，1985：172
7 Sei Y, Yoshimoto K, Mcintyre T et al. Morphine-induced thymic hypopla-sia is glucocorticoid-dependent. J Immunology, 1991;146:194
8 邓文龙主编.中医方剂的药理与应用.重庆：重庆出版社，1990：40-46
〔收稿1998-01-26 二次修回1999-02-10〕, 百拇医药