LPS对人胚胎胰岛分泌IL-6的调控效应
作者：孙 田志刚 杨贵贞 张建华
单位：山东省医科院基础所山东肿瘤生物治疗研究中心，济南 250062
关键词：人胚胎胰岛；IL-6；LPS
中国免疫学杂志990814 孙
田志刚 杨贵贞 张建华
摘 要 目的：为了探讨免疫介质LPS对胚胎胰岛分泌IL-6以及对胰岛功能的影响，以便为研究免疫系统与内分泌系统的内在联系提供依据。方法：采用常规消化方法分离人胚胎胰岛并对其进行原代培养，加入浓度为10 mg/L LPS，经不同时相收获上清，测定IL-6、胰岛素、胰高血糖素含量和IL-6 McAb中和试验，对LPS刺激和对照组胰岛RNA进行IL-6 RNA 斑点杂交。结果：人胚胎胰岛经LPS刺激分泌IL-6的能力明显加强，在体外培养8 d，IL-6含量达高峰，为对照组的145倍；人胚胎胰岛在换新鲜培养液后用LPS二次刺激，仍可继续分泌高效价的IL-6，高峰时相为对照组的25倍；IL-6 McAb对胰岛培养上清中IL-6有很强的中和效应；斑点杂交结果显示LPS刺激后胰岛RNA中IL-6 mRNA含量明显高于对照组；人胚胎胰岛受LPS刺激后胰岛素分泌能力加强，胰高血糖素分泌能力明显降低。结论：免疫介质LPS可能影响胰岛的分泌功能及产生IL-6的能力。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R335.6
Promotion of IL-6 production of human fetal
islets by LPS
SUN Rui,TIAN Zhi-Gang,YANG Gui-Zhen et al.Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062
Abstract Objective:To study the effects of LPS on fetal islet function and IL-6 production in vitro.Methods：The islets from fetal pancrease was separated by collagenase type V (0.5 mg/ml)and cultured with or without LPS(10 μg/ml)in vitro.The supernatants of primary culture and second culture of human fetal islets for different days were assayed for IL-6,insulin,glucogon.Results:The results showedIL-6 secretion was siginificantly chanced and was maximal by 8th day after exposure to LPS and increased 145 folds (50 vs 7 284 mU/islet);After renewal of new mediual and restimulating with LPS,IL-6 secretion was increased 25 folds(47 vs 1 175 mU/islet);IL-6 McAb significantly neutralized the IL-6 activity of islet supernatants from each group,indicating that the IL-6 bioassay is specific;IL-6 mRNA in human fetal islet exposed to LPS is higher than control in dot hybridization;Insulin released to supernatants was increased (0.69～0.86 IU/islet)and glucagon secretion was decreased(1.80～0.18 pg/islet)after exposuring to LPS.Conclusion： Pancreatic islets may produce IL-6 and is promoted by LPS.The importance of IL-6 and LPS in regulating insulin and glucagon is under investigation.
, 百拇医药
Key words Human fetal islet IL-6 LPS
IL-6是一种免疫调节因子，可由多种细胞产生，具有多种生物学功能。LPS是细菌脂多糖，作为一种丝裂原，有明显的非特异免疫刺激作用。1993年我们初步观察到人胚胎胰岛可自发分泌IL-6[1]，为了进一步观察人胚胎胰岛细胞在产生IL-6方面是否可以受免疫刺激剂LPS的调控，又直接观察了人胚胎胰岛细胞在受LPS刺激后，IL-6的分泌状况。
1 材料与方法
1.1 样本的采取和胰岛细胞的分离培养 实验所用标本为自然死亡2 h以内的早产胎儿。按常规方法，无菌取出胰腺，胰岛细胞的制备同文献[1]。
1.2 人胚胎胰岛细胞培养上清的制备 将胰岛细胞悬液调为5×105 ml-1，种入24孔板，加入LPS使其终浓度为10 mg/L，分不同时间收获上清，每次2孔，受LPS刺激后的胰岛，收上清后换取新鲜培养液，再加入LPS进行两次刺激，分不同时相收获上清，测定上清中IL-6、胰岛素和胰高血糖素的含量。
, 百拇医药
1.3 IL-6生物活性检测 IL-6生物活性检测按文献[1]进行。IL-6依赖细胞株MH60.BSF-2由日本大阪大学细胞工学中心惠赠。rhIL-6为本室产品，已用IL-6标准品(美国NIH产品)进行标定。
1.4 胰岛素和胰高血糖素测定 用北京原子能研究所提供的125I-胰岛素放射免疫分析药盒和胰高血糖素放射免疫测定盒测定。胰岛素的标定单位为mIU/ml，胰高血糖素的标定单位为pg/ml。
1.5 IL-6单克隆抗体中和活性测定 IL-6单抗为经实验证明与rhTNF、rhIFN、rhGM-CSF、rhG-CSF和rhIL-2均无交叉反应。用LPS刺激的胰岛培养上清，加入不同浓度的IL-6 McAb(0.85～12.50 μg/ml)，同时设rhIL-6 40 U/ml作为阳性对照。每个样品设3个平行孔，用MTT法测定中和活性，中和活性以中和百分数(%)表示。
, 百拇医药 1.6 胰岛细胞IL-6 RNA斑点杂交 IL-6cDNA探针(本室产品)的制备及标记，胰岛细胞RNA的提取及RNA斑点杂交均按文献[1]进行。
2 结果
2.1 LPS对原代培养的人胚胎胰岛分泌功能的影响 如图1A所示，人胚胎胰岛细胞受LPS刺激后，分泌IL-6的能力明显增加，在第8天达高峰，IL-6含量为对照组的145倍，连续培养10 d，仍具有很强的IL-6活性(3 656 mU/islet)。如图1B所示，LPS刺激组胰岛素的含量基本保持比较平稳的状态，与对照组相比，LPS组d4～9胰岛素含量均高于对照组，d10与对照组含量基本相同。如图1C所示，胰高血糖素的变化和IL-6、胰岛素相反，LPS刺激组胰高血糖素含量明显低于对照组，在d7～9含量升高，但仍低于对照组。
, 百拇医药
图1 LPS刺激后人胚胎胰岛IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况
Fig.1 Effects of primary culture with LPS on human fetal islets IL-6 production,insulin release and glucogon secretion
图2 LPS两次刺激后人胚胎IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况
Fig.2 Effects of second culture with LPS on human fetal islets IL-6 production,insulin release and glucogon secretion
, 百拇医药
2.2 两次LPS刺激对人胚胎胰岛分泌功能的影响 受LPS刺激后的胰岛细胞，进行两次LPS刺激。图2A所示，IL-6的分泌在对照组d1为最低，d5达高峰(47 mU/islet)。LPS组与对照组表现出相似的趋势，但含量明显高于对照组，在高峰期IL-6的含量为对照组高峰期的25倍。图2B所示，两次LPS刺激组胰岛素含量明显升高。在d2、d4和d7出现3次分泌高峰，两次LPS刺激胰岛素的含量升高的幅度明显高于一次LPS刺激。图2C所示，两次LPS刺激组胰高血糖的含量明显低于对照组。
2.3 IL-6 McAb对胰岛上清的中和效应(表1) 在原代培养的胰岛和LPS刺激的胰岛样本中分别选择了d0～4，d0～7,d0～10 的样品进行IL-6 McAb对胰岛上清的中和试验，以确认IL-6测活的特异性。表1所示，IL-6McAb对IL-6活性的中和效应呈剂量依赖关系。
表1 IL-6McAb对原代培养的胰岛和LPS刺激的胰岛培养上清中IL-6的中和效应(%)
, 百拇医药
Tab.1 Neutralization of IL-6 in islets supernatant by IL-6 McAb(%) IL-6
McAb
(μg/ml)
rhIL-6
(40 U/ml)
Control
LPS-treated
d0～4
d0～7
d0～10
d0～4
, 百拇医药
d0～7
d0～10
12.50
100.0
100.0
100.0
100.0
98.9±3.3
90.1±8.8
100.0
6.25
82.4±6.5
97.9±3.9
, http://www.100md.com
89.2±7.6
93.8±6.4
85.2±5.4
89.2±6.9
82.4±5.4
3.10
73.2±5.4
85.2±4.1
79.6±6.7
81.2±4.9
66.0±7.1
59.2±4.9
, http://www.100md.com
68.2±4.6
1.55
59.2±7.3
51.0±6.3
57.5±4.8
68.7±7.3
52.7±4.2
37.6±2.1
41.3±3.1
0.85
38.7±2.1
31.0±3.6
, 百拇医药
36.5±1.5
32.3±3.3
27.8±3.5
18.6±2.4
21.4±1.2
图3 生物素标记的IL-6 cDNA探针与胰岛细胞RNA和LPS刺激后的胰岛细胞RNA的斑点杂交
Fig.3 Dot hybridization of human fetal islets with IL-6 cDNA probe
Note:A.IL-6 cDNA,0.5 μg;B.human fetal islet RNA,10 μg;C.LPS-treated islet RNA,10 μg;D.Yac-l cell RNA,5 μg
, 百拇医药
2.4 IL-6cDNA斑点杂交 图3结果显示LPS刺激的胰岛RNA中含有高浓度的IL-6mRNA，含量明显高于对照组，进一步提示在LPS刺激情况下胰岛细胞转录IL-6 mRNA的量明显增高。
3 讨论
1993年我们选用人胚胎期胰岛进行原代培养，发现胚胎胰岛可自发分泌IL-6，而IL-6又可以促进胰岛素分泌，提示IL-6在维持胰岛内分泌代谢的平衡中发挥作用[1，2]。LPS是一种免疫刺激剂，可以促进淋巴细胞的分裂和增殖，产生多种细胞因子(IL-1β、TNFα、IL-6等)。本研究中发现LPS可以明显促进胰岛细胞分泌IL-6，IL-6 McAb中和试验和斑点杂交进一步证实了此结果。此外，发现LPS对胰岛内不同类型细胞有不同作用，对胰岛β细胞产生胰岛素的能力有促进作用，对胰岛α细胞产生胰高血糖素的能力有抑制作用。
已有研究表明在小鼠体内和体外培养的人单核细胞和U937细胞，IL-6均可抑制由LPS诱导的TNFα和IL-1β的产生[3，4]。同时有实验证明胰岛素可抑制由LPS诱导的小鼠脾细胞产生IL-1β和TNFα，提示IL-6和胰岛素均具有抑制IL-1β和TNFα产生的能力[5]。TNFα和IL-1β均参与糖尿病的自身免疫过程，这两种细胞因子又可刺激胰岛细胞分泌IL-6，提示IL-6可能是机体保护胰岛的一种生理反应因素[6]。本研究采用LPS为刺激剂进一步观察了这种网络调节的存在。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助项目(39370638)
白求恩医科大学基础医学院免疫学研究室，长春130021
作者简介：孙 ，女，39岁，研究员，主要从事内分泌免疫学研究；
田志刚，男，42岁，研究员，博士生导师，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
1 孙 ，田志刚，张建华 et al.人胚胎胰岛IL-6基因表达与胰岛素分泌的关系.中华医学杂志，1993；73(9)：524
2 孙 ，田志刚，崔树龄et al.白细胞介素6对人胚胎胰岛分泌胰岛素的促进效应.中华器官移植杂志，1993；14(4)：154
, http://www.100md.com
3 Tilg H,Trehu E,Atkins M B et al.Interleukin-6(IL-6)as an anti-inflammatory cytokine:induction of circulating IL-1 receptor antagonist and soluble tumour necrosis factor receptor p55.Blood,1994;183(1):113
4 Schindler R,Mancilla J,Endres S et al.Correlations and interactions in the production of IL-6，IL-1 and TNF in human blood mononuclear cells:IL-6 suppresses IL-1 and TNF.Blood,1990;75(1):40
5 Vitiello M,Scarfogliero P,Galdiero M et al.Prolactin and insulin regulate the release of IL-1-alpha and IFN-gamma from murine splenocytes activated with porins or LPS of Salmonella typhimurium.Immunol Cell Biol,1995;73(5):452
6 Campbell I L,Cutri A,Wilson A et al.Evidence for IL-6 production by and effects on the pancreatic beta cell.J Immunol,1989;143:1188
〔收稿 1999-01-01 修回 1999-03-31〕, 百拇医药
单位：山东省医科院基础所山东肿瘤生物治疗研究中心，济南 250062
关键词：人胚胎胰岛；IL-6；LPS
中国免疫学杂志990814 孙
田志刚 杨贵贞 张建华摘 要 目的：为了探讨免疫介质LPS对胚胎胰岛分泌IL-6以及对胰岛功能的影响，以便为研究免疫系统与内分泌系统的内在联系提供依据。方法：采用常规消化方法分离人胚胎胰岛并对其进行原代培养，加入浓度为10 mg/L LPS，经不同时相收获上清，测定IL-6、胰岛素、胰高血糖素含量和IL-6 McAb中和试验，对LPS刺激和对照组胰岛RNA进行IL-6 RNA 斑点杂交。结果：人胚胎胰岛经LPS刺激分泌IL-6的能力明显加强，在体外培养8 d，IL-6含量达高峰，为对照组的145倍；人胚胎胰岛在换新鲜培养液后用LPS二次刺激，仍可继续分泌高效价的IL-6，高峰时相为对照组的25倍；IL-6 McAb对胰岛培养上清中IL-6有很强的中和效应；斑点杂交结果显示LPS刺激后胰岛RNA中IL-6 mRNA含量明显高于对照组；人胚胎胰岛受LPS刺激后胰岛素分泌能力加强，胰高血糖素分泌能力明显降低。结论：免疫介质LPS可能影响胰岛的分泌功能及产生IL-6的能力。
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中国图书分类号 R335.6
Promotion of IL-6 production of human fetal
islets by LPS
SUN Rui,TIAN Zhi-Gang,YANG Gui-Zhen et al.Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062
Abstract Objective:To study the effects of LPS on fetal islet function and IL-6 production in vitro.Methods：The islets from fetal pancrease was separated by collagenase type V (0.5 mg/ml)and cultured with or without LPS(10 μg/ml)in vitro.The supernatants of primary culture and second culture of human fetal islets for different days were assayed for IL-6,insulin,glucogon.Results:The results showedIL-6 secretion was siginificantly chanced and was maximal by 8th day after exposure to LPS and increased 145 folds (50 vs 7 284 mU/islet);After renewal of new mediual and restimulating with LPS,IL-6 secretion was increased 25 folds(47 vs 1 175 mU/islet);IL-6 McAb significantly neutralized the IL-6 activity of islet supernatants from each group,indicating that the IL-6 bioassay is specific;IL-6 mRNA in human fetal islet exposed to LPS is higher than control in dot hybridization;Insulin released to supernatants was increased (0.69～0.86 IU/islet)and glucagon secretion was decreased(1.80～0.18 pg/islet)after exposuring to LPS.Conclusion： Pancreatic islets may produce IL-6 and is promoted by LPS.The importance of IL-6 and LPS in regulating insulin and glucagon is under investigation.
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Key words Human fetal islet IL-6 LPS
IL-6是一种免疫调节因子，可由多种细胞产生，具有多种生物学功能。LPS是细菌脂多糖，作为一种丝裂原，有明显的非特异免疫刺激作用。1993年我们初步观察到人胚胎胰岛可自发分泌IL-6[1]，为了进一步观察人胚胎胰岛细胞在产生IL-6方面是否可以受免疫刺激剂LPS的调控，又直接观察了人胚胎胰岛细胞在受LPS刺激后，IL-6的分泌状况。
1 材料与方法
1.1 样本的采取和胰岛细胞的分离培养 实验所用标本为自然死亡2 h以内的早产胎儿。按常规方法，无菌取出胰腺，胰岛细胞的制备同文献[1]。
1.2 人胚胎胰岛细胞培养上清的制备 将胰岛细胞悬液调为5×105 ml-1，种入24孔板，加入LPS使其终浓度为10 mg/L，分不同时间收获上清，每次2孔，受LPS刺激后的胰岛，收上清后换取新鲜培养液，再加入LPS进行两次刺激，分不同时相收获上清，测定上清中IL-6、胰岛素和胰高血糖素的含量。
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1.3 IL-6生物活性检测 IL-6生物活性检测按文献[1]进行。IL-6依赖细胞株MH60.BSF-2由日本大阪大学细胞工学中心惠赠。rhIL-6为本室产品，已用IL-6标准品(美国NIH产品)进行标定。
1.4 胰岛素和胰高血糖素测定 用北京原子能研究所提供的125I-胰岛素放射免疫分析药盒和胰高血糖素放射免疫测定盒测定。胰岛素的标定单位为mIU/ml，胰高血糖素的标定单位为pg/ml。
1.5 IL-6单克隆抗体中和活性测定 IL-6单抗为经实验证明与rhTNF、rhIFN、rhGM-CSF、rhG-CSF和rhIL-2均无交叉反应。用LPS刺激的胰岛培养上清，加入不同浓度的IL-6 McAb(0.85～12.50 μg/ml)，同时设rhIL-6 40 U/ml作为阳性对照。每个样品设3个平行孔，用MTT法测定中和活性，中和活性以中和百分数(%)表示。
, 百拇医药 1.6 胰岛细胞IL-6 RNA斑点杂交 IL-6cDNA探针(本室产品)的制备及标记，胰岛细胞RNA的提取及RNA斑点杂交均按文献[1]进行。
2 结果
2.1 LPS对原代培养的人胚胎胰岛分泌功能的影响 如图1A所示，人胚胎胰岛细胞受LPS刺激后，分泌IL-6的能力明显增加，在第8天达高峰，IL-6含量为对照组的145倍，连续培养10 d，仍具有很强的IL-6活性(3 656 mU/islet)。如图1B所示，LPS刺激组胰岛素的含量基本保持比较平稳的状态，与对照组相比，LPS组d4～9胰岛素含量均高于对照组，d10与对照组含量基本相同。如图1C所示，胰高血糖素的变化和IL-6、胰岛素相反，LPS刺激组胰高血糖素含量明显低于对照组，在d7～9含量升高，但仍低于对照组。
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图1 LPS刺激后人胚胎胰岛IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况
Fig.1 Effects of primary culture with LPS on human fetal islets IL-6 production,insulin release and glucogon secretion
图2 LPS两次刺激后人胚胎IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况
Fig.2 Effects of second culture with LPS on human fetal islets IL-6 production,insulin release and glucogon secretion
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2.2 两次LPS刺激对人胚胎胰岛分泌功能的影响 受LPS刺激后的胰岛细胞，进行两次LPS刺激。图2A所示，IL-6的分泌在对照组d1为最低，d5达高峰(47 mU/islet)。LPS组与对照组表现出相似的趋势，但含量明显高于对照组，在高峰期IL-6的含量为对照组高峰期的25倍。图2B所示，两次LPS刺激组胰岛素含量明显升高。在d2、d4和d7出现3次分泌高峰，两次LPS刺激胰岛素的含量升高的幅度明显高于一次LPS刺激。图2C所示，两次LPS刺激组胰高血糖的含量明显低于对照组。
2.3 IL-6 McAb对胰岛上清的中和效应(表1) 在原代培养的胰岛和LPS刺激的胰岛样本中分别选择了d0～4，d0～7,d0～10 的样品进行IL-6 McAb对胰岛上清的中和试验，以确认IL-6测活的特异性。表1所示，IL-6McAb对IL-6活性的中和效应呈剂量依赖关系。
表1 IL-6McAb对原代培养的胰岛和LPS刺激的胰岛培养上清中IL-6的中和效应(%)
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Tab.1 Neutralization of IL-6 in islets supernatant by IL-6 McAb(%) IL-6
McAb
(μg/ml)
rhIL-6
(40 U/ml)
Control
LPS-treated
d0～4
d0～7
d0～10
d0～4
, 百拇医药
d0～7
d0～10
12.50
100.0
100.0
100.0
100.0
98.9±3.3
90.1±8.8
100.0
6.25
82.4±6.5
97.9±3.9
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89.2±7.6
93.8±6.4
85.2±5.4
89.2±6.9
82.4±5.4
3.10
73.2±5.4
85.2±4.1
79.6±6.7
81.2±4.9
66.0±7.1
59.2±4.9
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68.2±4.6
1.55
59.2±7.3
51.0±6.3
57.5±4.8
68.7±7.3
52.7±4.2
37.6±2.1
41.3±3.1
0.85
38.7±2.1
31.0±3.6
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36.5±1.5
32.3±3.3
27.8±3.5
18.6±2.4
21.4±1.2
图3 生物素标记的IL-6 cDNA探针与胰岛细胞RNA和LPS刺激后的胰岛细胞RNA的斑点杂交
Fig.3 Dot hybridization of human fetal islets with IL-6 cDNA probe
Note:A.IL-6 cDNA,0.5 μg;B.human fetal islet RNA,10 μg;C.LPS-treated islet RNA,10 μg;D.Yac-l cell RNA,5 μg
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2.4 IL-6cDNA斑点杂交 图3结果显示LPS刺激的胰岛RNA中含有高浓度的IL-6mRNA，含量明显高于对照组，进一步提示在LPS刺激情况下胰岛细胞转录IL-6 mRNA的量明显增高。
3 讨论
1993年我们选用人胚胎期胰岛进行原代培养，发现胚胎胰岛可自发分泌IL-6，而IL-6又可以促进胰岛素分泌，提示IL-6在维持胰岛内分泌代谢的平衡中发挥作用[1，2]。LPS是一种免疫刺激剂，可以促进淋巴细胞的分裂和增殖，产生多种细胞因子(IL-1β、TNFα、IL-6等)。本研究中发现LPS可以明显促进胰岛细胞分泌IL-6，IL-6 McAb中和试验和斑点杂交进一步证实了此结果。此外，发现LPS对胰岛内不同类型细胞有不同作用，对胰岛β细胞产生胰岛素的能力有促进作用，对胰岛α细胞产生胰高血糖素的能力有抑制作用。
已有研究表明在小鼠体内和体外培养的人单核细胞和U937细胞，IL-6均可抑制由LPS诱导的TNFα和IL-1β的产生[3，4]。同时有实验证明胰岛素可抑制由LPS诱导的小鼠脾细胞产生IL-1β和TNFα，提示IL-6和胰岛素均具有抑制IL-1β和TNFα产生的能力[5]。TNFα和IL-1β均参与糖尿病的自身免疫过程，这两种细胞因子又可刺激胰岛细胞分泌IL-6，提示IL-6可能是机体保护胰岛的一种生理反应因素[6]。本研究采用LPS为刺激剂进一步观察了这种网络调节的存在。
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本课题受国家自然科学基金资助项目(39370638)
白求恩医科大学基础医学院免疫学研究室，长春130021
作者简介：孙
，女，39岁，研究员，主要从事内分泌免疫学研究；田志刚，男，42岁，研究员，博士生导师，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
1 孙
，田志刚，张建华 et al.人胚胎胰岛IL-6基因表达与胰岛素分泌的关系.中华医学杂志，1993；73(9)：5242 孙
，田志刚，崔树龄et al.白细胞介素6对人胚胎胰岛分泌胰岛素的促进效应.中华器官移植杂志，1993；14(4)：154, http://www.100md.com
3 Tilg H,Trehu E,Atkins M B et al.Interleukin-6(IL-6)as an anti-inflammatory cytokine:induction of circulating IL-1 receptor antagonist and soluble tumour necrosis factor receptor p55.Blood,1994;183(1):113
4 Schindler R,Mancilla J,Endres S et al.Correlations and interactions in the production of IL-6，IL-1 and TNF in human blood mononuclear cells:IL-6 suppresses IL-1 and TNF.Blood,1990;75(1):40
5 Vitiello M,Scarfogliero P,Galdiero M et al.Prolactin and insulin regulate the release of IL-1-alpha and IFN-gamma from murine splenocytes activated with porins or LPS of Salmonella typhimurium.Immunol Cell Biol,1995;73(5):452
6 Campbell I L,Cutri A,Wilson A et al.Evidence for IL-6 production by and effects on the pancreatic beta cell.J Immunol,1989;143:1188
〔收稿 1999-01-01 修回 1999-03-31〕, 百拇医药