抗重组人血管生长素单克隆抗体的制备及鉴定①
作者：杨太成 江悦华 冼 江 吴锦银 李 明
单位：广州军区总医院医学实验科，广州 510010
关键词：单克隆抗体；rhANG；鉴定
中国免疫学杂志990911 摘 要 目的：制备不同类型抗重组人血管生长素(Recombinantion Human Angiogenin,rhANG)的单克隆抗体，为进一步研究抗rhANG抗体对ANG的中和作用以及对ANG依赖型肿瘤的抑瘤实验打下基础。方法：利用杂交瘤技术以rhANG免疫Balb/c小鼠，制备二株(C6、C46)能够稳定分泌抗 rhANG抗体的杂交瘤，并对上清进行ELISA、双扩散、免疫印迹等鉴定。结果：该抗体类别C6为IgG1，C46为IgM，并特异地识别rhANG与其它细胞因子及血清蛋白无交叉反应，免疫印迹显示该抗体与分子量14.4 kD rhANG蛋白结合，不与宿主菌体蛋白反应。结论：经多种方法鉴定获得的二株杂交瘤细胞分泌的抗体为rhANG特异抗体。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
Preparation and identification of the anti-rhANG monoclonal antibodies
YANG Tai-Cheng,JIANG Yue-Hua,XIAN Jiang et al.
General Hospital of Guangzhou Military District,Guangzhou 510010
Abstract Objective: Different kinds of anti-human recombinant angiogenin(anti-rhANG)monoclonal antibodies were prepared in order to do further studies on the neutralization between ANG-dependant tumor.Methods:By applying hybridoma techniques,two cell lines(C6、C46)which can steadily secrete the anti-rhANG monoclonal antibodies were prepared from Balb/c mice immunized with rhANG、ELISA、two directions diffusion and Western blotting were applied to culture supernate identification.Results:One of the antibodies named as C6 is IgG1 and the other named as C46 is IgM.The antibodies could specifically recognized rhANG while had no crossing-reaction with other cytokines and serum proteins.The results of Western blotting showed that the antibodies could combine with rhANG protein whose MW is 14.4 kD,and had no reaction with host-thallus proteins.Conclusion:The antibodies secreted by two hybridoma cell lines identified by several methods were specific antibodies of rhANG.
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Key words Monoclonal antibody rhANG Identification
血管生长素(ANG)是一种存在于正常血浆及实体瘤组织中的14.4 kD，PI 9.5的碱性多肽，是由肿瘤分泌，基因定位于染色体14q11[1]，它具有很强的促血管生长作用，大量的研究表明，ANG与恶性肿瘤的快速生成和转移，损伤组织的修复均有密切关系。本实验旨在制备不同亚型的抗人ANG单克隆抗体，研究ANG的拮抗剂对肿瘤血管的生成及肿瘤增殖、转移的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 细胞因子 纯化rhANG，白细胞介素2(rhIL-2)由本室制备，rhGM-CSF，rhTNF-α及rhIFN-α国内产品。
1.2 抗体的制备 按常规方法[2]用纯化的rhANG免疫6周龄Balb/c小鼠，共3次，每次间隔3 w，200 μg/(次.只)。融合前3天腹腔注射rhANG 300 μg/只，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下融合，融合细胞置HAT选择培养液37℃，CO2培养箱培养。1 w后待细胞长至1/3孔时，用间接ELISA对杂交瘤细胞培养上清进行筛选。将阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆，当克隆孔的阳性率达100%时再扩大培养，冻存，制备腹水。
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1.3 ELISA测定 按常规方法[3]进行rhANG抗原的包被，浓度为1 μg/ml，其它细胞因子亦以相同浓度包被，以诱导前PBV220/ANG/JM103菌体裂解液蛋白做无关对照抗原。
1.4 双向扩散法测Ig亚类 杂交瘤培养上清装入透析袋置40%，分子量8 000的PEG中浓缩至6倍，与抗鼠亚类血清作双扩实验。
1.5 免疫转印 纯化的ANG，PBV220/ANG/JM103诱导前和诱导后菌体裂解液经SDS-PAGE分离[4]。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移至硝酸纤维膜上，依次用10%小牛血清封闭，杂交上清为一抗，羊抗鼠标记辣根过氧化物酶IgG为二抗，以DAB系统显色。
2 结 果
2.1 细胞融合及筛选 免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合后，分别培养在96孔板和24孔板各2块，1 w后60%孔有杂交瘤细胞生长，用ELISA筛选，ANG阳性3孔，经3次亚克隆有2株能稳定地分泌抗体，分别命名为C46、C6，另1株C1分泌不稳定。
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2.2 抗体类别及亚型 C6和C46杂交瘤细胞株分泌抗体的免疫球蛋白类型分别为IgG1、IgM。
2.3 单抗的特异性鉴定 两株抗人ANG单抗与多种人细胞因子，人及动物血清和诱导前宿主菌蛋白无反应，而只与纯化的ANG和诱导后的菌体裂解液蛋白反应。结果见表1、表2。
表1 抗人ANG单克隆抗体的特异性反应
Tab.1 Specific reaction of anti-human ANG monoclonal antibodies
GM-CSF
TNFα
IFN
, 百拇医药
IL-2
ANG
C46
-
-
-
-
+
C6
-
-
-
-
, 百拇医药
+
表2 抗人ANG单克隆抗体与不同血清及菌体的反应
Tab.2 The reaction of anti-human ANG monoclonal antibodies with different serums and thalluses
Serum
Thallus proteins
Human
Bovine
Rabbit
Before inducement
After inducement
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C46
-
-
-
-
+
C6
-
-
-
-
+
2.4 SDS-PAGE 电泳及免疫转印结果 纯化重组人ANG，SDS-PAGE结果显示其分子量为14.4 kD，诱导后菌体蛋白与纯化的ANG相应位置出现沉淀线，见图1A。免疫转印结果显示，2个抗体识别14.4 kD的rhANG而不和诱导前的菌体裂解液蛋白反应，见图1B。
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图1 SDS-PAGE电泳图谱和SDS-PAGE免疫转印
Fig.1 The result of SDS-PAGE and SDS-PAGE immuno-blotting
Note:1.standard proteins,2.purification,3.thallus proteins before inducement,4.thallus proteins after inducement
3 讨 论
目前国外对ANG进行了大量研究，其基因定位、理化性质、生物活性和作用机理比较清楚[5]。但国内ANG单克隆抗体的研究未见报道。本实验制备ANG拮抗剂-单克隆抗体，旨在研究ANG单克隆抗体在ANG依赖型恶性肿瘤的治疗作用。综合上述实验结果，作者认为本实验所制备的二株抗ANG单抗均有较强的特异性，与多种基因工程产生的细胞因子无交叉反应，不与正常人血清、兔血清及小牛血清反应，双扩及免疫转印实验证实抗体不与诱导前PBV220/ANG/JM103菌体蛋白反应，仅识别14.4 kD的ANG。此单抗的制备为今后对ANG依赖型恶性肿瘤的研究提供条件。
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①受广东省自然科学基金资助课题(NO 960668)和军队自然科学基金资助课题(NO 96D033)
作者简介：杨太成，男，50岁，副主任技师，主要从事单克隆抗体及免疫学研究；
江悦华，女，54岁，主任医师，硕士研究生导师，主要从事医学遗传学研究
4 参考文献
1 Chen B Q.Purification and characterization of angiogenic factor from human bladder cancer.Chung Hua Wai ko Tsa Chih,1993;31(6):333
2 杨太成，陈 勇，孙瑛勋 et al .抗脲激酶单克隆抗体的研制.生物工程学报，1987；3(3)：203
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3 朱培坤.免疫酶技术.济南：山东科学技术出版社，1983：101
4 Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T eds.金冬雁译.分子克隆.第2版.北京：科技出版社，1993：888
5 Newton D L,Xue Y,Olson K A et al.Angiogenin single-chain immunofusion:influence of peptide linkers and spacers between fusion protein domains.Biochemistry,1996;35(2):545
〔收稿日期：1998-07-05 修稿日期：1998-10-26〕, 百拇医药
单位：广州军区总医院医学实验科，广州 510010
关键词：单克隆抗体；rhANG；鉴定
中国免疫学杂志990911 摘 要 目的：制备不同类型抗重组人血管生长素(Recombinantion Human Angiogenin,rhANG)的单克隆抗体，为进一步研究抗rhANG抗体对ANG的中和作用以及对ANG依赖型肿瘤的抑瘤实验打下基础。方法：利用杂交瘤技术以rhANG免疫Balb/c小鼠，制备二株(C6、C46)能够稳定分泌抗 rhANG抗体的杂交瘤，并对上清进行ELISA、双扩散、免疫印迹等鉴定。结果：该抗体类别C6为IgG1，C46为IgM，并特异地识别rhANG与其它细胞因子及血清蛋白无交叉反应，免疫印迹显示该抗体与分子量14.4 kD rhANG蛋白结合，不与宿主菌体蛋白反应。结论：经多种方法鉴定获得的二株杂交瘤细胞分泌的抗体为rhANG特异抗体。
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中国图书分类号 R392.12
Preparation and identification of the anti-rhANG monoclonal antibodies
YANG Tai-Cheng,JIANG Yue-Hua,XIAN Jiang et al.
General Hospital of Guangzhou Military District,Guangzhou 510010
Abstract Objective: Different kinds of anti-human recombinant angiogenin(anti-rhANG)monoclonal antibodies were prepared in order to do further studies on the neutralization between ANG-dependant tumor.Methods:By applying hybridoma techniques,two cell lines(C6、C46)which can steadily secrete the anti-rhANG monoclonal antibodies were prepared from Balb/c mice immunized with rhANG、ELISA、two directions diffusion and Western blotting were applied to culture supernate identification.Results:One of the antibodies named as C6 is IgG1 and the other named as C46 is IgM.The antibodies could specifically recognized rhANG while had no crossing-reaction with other cytokines and serum proteins.The results of Western blotting showed that the antibodies could combine with rhANG protein whose MW is 14.4 kD,and had no reaction with host-thallus proteins.Conclusion:The antibodies secreted by two hybridoma cell lines identified by several methods were specific antibodies of rhANG.
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Key words Monoclonal antibody rhANG Identification
血管生长素(ANG)是一种存在于正常血浆及实体瘤组织中的14.4 kD，PI 9.5的碱性多肽，是由肿瘤分泌，基因定位于染色体14q11[1]，它具有很强的促血管生长作用，大量的研究表明，ANG与恶性肿瘤的快速生成和转移，损伤组织的修复均有密切关系。本实验旨在制备不同亚型的抗人ANG单克隆抗体，研究ANG的拮抗剂对肿瘤血管的生成及肿瘤增殖、转移的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 细胞因子 纯化rhANG，白细胞介素2(rhIL-2)由本室制备，rhGM-CSF，rhTNF-α及rhIFN-α国内产品。
1.2 抗体的制备 按常规方法[2]用纯化的rhANG免疫6周龄Balb/c小鼠，共3次，每次间隔3 w，200 μg/(次.只)。融合前3天腹腔注射rhANG 300 μg/只，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下融合，融合细胞置HAT选择培养液37℃，CO2培养箱培养。1 w后待细胞长至1/3孔时，用间接ELISA对杂交瘤细胞培养上清进行筛选。将阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆，当克隆孔的阳性率达100%时再扩大培养，冻存，制备腹水。
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1.3 ELISA测定 按常规方法[3]进行rhANG抗原的包被，浓度为1 μg/ml，其它细胞因子亦以相同浓度包被，以诱导前PBV220/ANG/JM103菌体裂解液蛋白做无关对照抗原。
1.4 双向扩散法测Ig亚类 杂交瘤培养上清装入透析袋置40%，分子量8 000的PEG中浓缩至6倍，与抗鼠亚类血清作双扩实验。
1.5 免疫转印 纯化的ANG，PBV220/ANG/JM103诱导前和诱导后菌体裂解液经SDS-PAGE分离[4]。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移至硝酸纤维膜上，依次用10%小牛血清封闭，杂交上清为一抗，羊抗鼠标记辣根过氧化物酶IgG为二抗，以DAB系统显色。
2 结 果
2.1 细胞融合及筛选 免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合后，分别培养在96孔板和24孔板各2块，1 w后60%孔有杂交瘤细胞生长，用ELISA筛选，ANG阳性3孔，经3次亚克隆有2株能稳定地分泌抗体，分别命名为C46、C6，另1株C1分泌不稳定。
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2.2 抗体类别及亚型 C6和C46杂交瘤细胞株分泌抗体的免疫球蛋白类型分别为IgG1、IgM。
2.3 单抗的特异性鉴定 两株抗人ANG单抗与多种人细胞因子，人及动物血清和诱导前宿主菌蛋白无反应，而只与纯化的ANG和诱导后的菌体裂解液蛋白反应。结果见表1、表2。
表1 抗人ANG单克隆抗体的特异性反应
Tab.1 Specific reaction of anti-human ANG monoclonal antibodies
GM-CSF
TNFα
IFN
, 百拇医药
IL-2
ANG
C46
-
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+
C6
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表2 抗人ANG单克隆抗体与不同血清及菌体的反应
Tab.2 The reaction of anti-human ANG monoclonal antibodies with different serums and thalluses
Serum
Thallus proteins
Human
Bovine
Rabbit
Before inducement
After inducement
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C46
-
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C6
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2.4 SDS-PAGE 电泳及免疫转印结果 纯化重组人ANG，SDS-PAGE结果显示其分子量为14.4 kD，诱导后菌体蛋白与纯化的ANG相应位置出现沉淀线，见图1A。免疫转印结果显示，2个抗体识别14.4 kD的rhANG而不和诱导前的菌体裂解液蛋白反应，见图1B。
, http://www.100md.com
图1 SDS-PAGE电泳图谱和SDS-PAGE免疫转印
Fig.1 The result of SDS-PAGE and SDS-PAGE immuno-blotting
Note:1.standard proteins,2.purification,3.thallus proteins before inducement,4.thallus proteins after inducement
3 讨 论
目前国外对ANG进行了大量研究，其基因定位、理化性质、生物活性和作用机理比较清楚[5]。但国内ANG单克隆抗体的研究未见报道。本实验制备ANG拮抗剂-单克隆抗体，旨在研究ANG单克隆抗体在ANG依赖型恶性肿瘤的治疗作用。综合上述实验结果，作者认为本实验所制备的二株抗ANG单抗均有较强的特异性，与多种基因工程产生的细胞因子无交叉反应，不与正常人血清、兔血清及小牛血清反应，双扩及免疫转印实验证实抗体不与诱导前PBV220/ANG/JM103菌体蛋白反应，仅识别14.4 kD的ANG。此单抗的制备为今后对ANG依赖型恶性肿瘤的研究提供条件。
, 百拇医药
①受广东省自然科学基金资助课题(NO 960668)和军队自然科学基金资助课题(NO 96D033)
作者简介：杨太成，男，50岁，副主任技师，主要从事单克隆抗体及免疫学研究；
江悦华，女，54岁，主任医师，硕士研究生导师，主要从事医学遗传学研究
4 参考文献
1 Chen B Q.Purification and characterization of angiogenic factor from human bladder cancer.Chung Hua Wai ko Tsa Chih,1993;31(6):333
2 杨太成，陈 勇，孙瑛勋 et al .抗脲激酶单克隆抗体的研制.生物工程学报，1987；3(3)：203
, http://www.100md.com
3 朱培坤.免疫酶技术.济南：山东科学技术出版社，1983：101
4 Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T eds.金冬雁译.分子克隆.第2版.北京：科技出版社，1993：888
5 Newton D L,Xue Y,Olson K A et al.Angiogenin single-chain immunofusion:influence of peptide linkers and spacers between fusion protein domains.Biochemistry,1996;35(2):545
〔收稿日期：1998-07-05 修稿日期：1998-10-26〕, 百拇医药