抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的稳定性及对动物纤维蛋白的识别
作者：李文平 许 静 隋建华 宋增璇
单位：中国协和医科大学中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020
关键词：链亲和素；融合蛋白；抗纤维蛋白
中国免疫学杂志990903 摘 要 目的：探索抗人纤维蛋白单链抗体-链亲合素融合蛋白的应用前景。方法：构建抗人纤维蛋白单链抗体scFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-8E5，表达的融合蛋白可特异性识别人纤维蛋白，同时有生物素的结合位点。转化JM109后用IPTG诱导表达，ELISA观察融合蛋白的稳定性。结果：抗人纤维蛋白单链抗体-链亲合素融合蛋白稳定性好，可耐受至少2 w，4℃保存、数次反复冻融或一定时间的37℃孵育。它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合，而与猪纤维蛋白反应不明显。结论：抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白适用于大鼠或豚鼠血栓病模型，是临床前研究的有用材料。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.2
Stability of anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein and interaction with other animal fibrin
LI Wen-Ping，XU Jing, SUI Jian-Hua et al.
Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020
Abstract Objective: To explore the clinical use of anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein in the future. Methods:The author have constructed an anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein by combining the core-streptavidin sequence with the anti-human fibrin scFv-8E5 gene. The fusion protein expressed by the vector pSTE2-8E5 contained the biotin binding site which could be used for direct detection of fibrin in ELISA with biotinylated horseradish peroxidase. The transformed E. coli JM109 cells were propagated and induced by IPTG. Results:This fusion protein was rather stable; it could tolerate 4℃ storage for at least two weeks, freezing/thawing several times or incubation at 37℃ for a certain time. This fusion protein was also able to bind to rat or guinea pig fibrin, but not to pig fibrin. Conclusion:Anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein could be taken for developing reliable experimental animal models for the study of thrombus imaging and the targeting of thrombolytic agents.
, http://www.100md.com
Key words Streptavidin Fusion protein Anti-fibrin
血栓形成与动脉粥样硬化、栓塞等很多病理生理状态有关,发病率和死亡率均很高。据报道抗人纤维蛋白单链抗体与放射性核素或效应分子结合在血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗方面有很好的应用前景[1，2]。Rosebrough等用抗人纤维蛋白与链亲和素交联，产生的融合蛋白在两步法血栓显影中获得良好的效果[3]。本室用基因拼接方法构建了抗人纤维蛋白单链抗体分子与链亲和素融合蛋白表达载体，表达产物具有结合人纤维蛋白和生物素的双种功能。为了探索这个产物的应用前景，我们对其稳定性及与不同动物纤维蛋白的结合进行了研究。
1 材料与方法
1.1 表达载体 我室成功地克隆了鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链和轻链可变区基因，表达的抗人纤维蛋白单链抗体(scFv-8E5)具有特异性结合人纤维蛋白的活性[4]。随后构建了scFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-8E5(图1)。链亲和素基因位于scFv-8E5基因的3′端,构成嵌合基因。在嵌合基因的5′端有果胶酶先导序列，受控于上游的Lac启动子, 在IPTG的诱导下启动表达。嵌合基因3′末端的C-myc短肽密码子可作为表达产物的标记，6个组氨酸密码子用于表达产物的纯化。
, http://www.100md.com
图1 重组的表达载体pSTE2-8E5
Fig.1 Restriction map of recombinant expression vector pSTE2-8E5
1.2 scFv-8E5:core-streptavidin的表达和纯化 选取经酶切鉴定正确的阳性克隆用LBGA(含有50 μg/ml氨苄青霉素、100 mmol/L葡萄糖的LB)培养过夜，次日1∶40倒入新鲜LBGA，待OD600为0.8时加入100 μmol/L IPTG诱导，室温振摇3 h后收集菌体，超声裂解细胞收集包涵体,用含3 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.0的溶液洗涤后加入6 mol/L盐酸胍、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 7.0溶液溶解，经IMAC柱一步纯化[5]。用TEA缓冲液(0.4 ml精氨酸-HCl，0.1 mol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,pH 7.0)透析复性后分装保存备用。
, 百拇医药
1.3 SDS-PAGE电泳 100 μmol/L IPTG诱导组菌体总蛋白及经IMAC柱纯化的包涵体蛋白用10% 聚丙烯酰胺还原电泳,考马斯亮蓝染色后观察。
1.4 scFv-8E5:core-streptavidin 融合蛋白的活性分析 用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)观察 IMAC 柱纯化的scFv-8E5: core-streptavidin对各种纤维蛋白的识别[4]。用各种纤维蛋白原分别包被96孔板，37 ℃烤干，用含15%牛血清的DMEM培养液活化纤维蛋白原为纤维蛋白，加入相同剂量纯化的scFv-8E5:core-streptavidin，再加入1∶150生物素标记的辣根过氧化物酶(购自华美)， 用四甲基联苯胺(TMB)为底物。2 mol/L H2SO4终止反应后用酶标仪检测450 nm处的光吸收值。待测 OD值/阴性对照≥2.1判为阳性，<2.1判为阴性。ELISA中所用融合蛋白浓度为37.7 μg/ml(为与40 μg/ml人纤维蛋白结合的平台剂量)。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 scFv-8E5:core-streptavidin的表达 100 μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE电泳表明， scFv-8E5: core-streptavidin融合蛋白单体的分子量约45 kD左右。经IMAC柱纯化后融合蛋白成为主带，纯度高，见图2。
图2 总蛋白和包涵体的SDS-PAGE电泳
Fig.2 SDS-PAGE of total cell extracts and inclusion bodies
Note:M. Protein molecular weight markers; Lane 1. E. coli JM109 transfected with pSTE2-8E5 induced with 100 μmol/L IPTG; Lane 2. E. coli JM109 transfected with pSTE2-8E5 without IPTG; Lane 3. Protein from inclusion bodies purified by IMAC
, 百拇医药
2.2 scFv-8E5:core-streptavidin的稳定性 ELISA检测IMAC柱纯化后的融合蛋白与人纤维蛋白的结合，以0℃保存的融合蛋白为阳性对照，阴性对照用PBS代替融合蛋白。融合蛋白冻融1～3次、4℃保存1～2 w或37℃孵育1 h后其与纤维蛋白的结合活性无明显变化，37℃孵育2 h活性下降约1/3，室温放置1 w后基本无活性，见图3。
图3 scFv-8E5: core-streptavidin 的稳定性
Fig.3 The stability of scFv-8E5: core-streptavidin
Note:R.T. room temperature; F./T. freezing/thawing; t. time
, 百拇医药
2.3 scFv-8E5:core-streptavidin对纤维蛋白的识别 ELISA检测IMAC柱纯化后的融合蛋白与不同动物纤维蛋白的结合， 以人纤维蛋白为阳性对照，阴性对照用包被液(BBS,0.05 mol/L,pH 9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液)。 融合蛋白与低浓度(10 μg/ml)的大鼠纤维蛋白即有结合活性，与较高浓度(20～40 μg/ml) 的豚鼠纤维蛋白有结合活性，不与猪纤维蛋白结合。融合蛋白与大鼠、豚鼠纤维蛋白的结合活性约为与人纤维蛋白结合活性的70%，结果见表1。
表1 融合蛋白与不同动物纤维蛋白的抗原结合力分析
Tab.1 The binding of fusion protein to fibrin originating from four different species Species
, 百拇医药
Concentration of fibrin
10 μg/ml
20 μg/ml
40 μg/ml
Human
0.411
0.628
0.832
Rat
0.470
0.491
0.452
, http://www.100md.com
Guinea pig
0.235
0.405
0.487
Pig
0.1691)
0.1391)
0.188
Note:Negative control OD450=0.081， 1) negative， the others are positive
3 讨 论
, http://www.100md.com
链亲和素(streptavidin)由4个相同的约15 kD 亚单位构成， 天然配基是生物素(Biotin)。去除链亲和素的N-和 C-末端几个氨基酸后形成的核心链亲和素仍不失其生物素结合活性[6]。本文报道的嵌合基因表达产物scFv-8E5:core-streptavidin融合蛋白能与人纤维蛋白结合，又获得结合生物素的功能， 表明结构正确。这种拼接方法的成功为scFv-8E5拼接其它效应分子用于血栓显影或溶栓治疗提供了可行性依据。链亲和素单体间的聚合可以使融合蛋白形成四聚体结构[6]，有助于提高抗原结合力。Rosebrough等采用交联方法制备抗纤维蛋白单抗-链亲和素融合蛋白，利用其结合纤维蛋白和生物素的功能作两步法血栓显影，提示具有同样双功能的scFv-8E5:core-streptavidin可用于血栓显影研究[3]。
scFv-8E5:core-streptavidin融合蛋白的稳定性好，反复冻融及短期4 ℃保存后对其抗原结合活性影响不大，37 ℃ 1 h活性下降不明显，37 ℃ 2 h活性降低约1/3，说明此融合蛋白容易保存，又可耐受一定时间的体温，失活前有充分的时间与血栓结合。为了在动物体内进行血栓显影和抗血栓研究，观察了scFv-8E5-链亲和素与不同动物纤维蛋白的反应，发现它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合，适用于大鼠或豚鼠血栓病模型，是作为临床前研究的有用材料。
, 百拇医药
作者简介：李文平，女，28岁，博士研究生；
宋增璇，女，61岁，博士生导师，主要研究造血调控
4 参考文献
1 Bode C, Hanson S R, Schmedtje J F et al. Antithrombotic potency of hirudin is increased in nonhuman primates by fibrin targeting. Circulation, 1997；95:800
2 Sung C，Van Osdol W W. Pharmacokinetic comparison of direct antibody targeting protocols based on streptavidin-biotin. J Nucl Med, 1995;36:867
, 百拇医药
3 Rosebrough S F，Hashmi M. Galactose-modified streptavidin-GC4 antifibrin monoclonal antibody conjugates:application for two-step thrombus/embolus imaging. J Pharmacol Exp Ther, 1996；276:770
4 Song Z X, Cai Y L, Song D Y et al. Primary structure and functional expression of heavy- and light-chain variable region genes of a monoclonal antibody specific for human fibrin. Hybridoma, 1997；16(3)：235
5 Kipriyanov S M, Dubel S, Breitling F et al. Recombinant single- chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent an biotinylated miniantibodies. Mol Immunol, 1994；31:1047
6 Dubel S, Breitling F, Kontermann R et al. Bifunctional and multimeric complexes of streptavidin fused to single chain antibodies(scFv). J Immunol Meth, 1995；178:201
〔收稿日期：1998-07-29 修稿日期：1998-09-07〕, 百拇医药
单位：中国协和医科大学中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020
关键词：链亲和素；融合蛋白；抗纤维蛋白
中国免疫学杂志990903 摘 要 目的：探索抗人纤维蛋白单链抗体-链亲合素融合蛋白的应用前景。方法：构建抗人纤维蛋白单链抗体scFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-8E5，表达的融合蛋白可特异性识别人纤维蛋白，同时有生物素的结合位点。转化JM109后用IPTG诱导表达，ELISA观察融合蛋白的稳定性。结果：抗人纤维蛋白单链抗体-链亲合素融合蛋白稳定性好，可耐受至少2 w，4℃保存、数次反复冻融或一定时间的37℃孵育。它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合，而与猪纤维蛋白反应不明显。结论：抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白适用于大鼠或豚鼠血栓病模型，是临床前研究的有用材料。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.2
Stability of anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein and interaction with other animal fibrin
LI Wen-Ping，XU Jing, SUI Jian-Hua et al.
Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020
Abstract Objective: To explore the clinical use of anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein in the future. Methods:The author have constructed an anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein by combining the core-streptavidin sequence with the anti-human fibrin scFv-8E5 gene. The fusion protein expressed by the vector pSTE2-8E5 contained the biotin binding site which could be used for direct detection of fibrin in ELISA with biotinylated horseradish peroxidase. The transformed E. coli JM109 cells were propagated and induced by IPTG. Results:This fusion protein was rather stable; it could tolerate 4℃ storage for at least two weeks, freezing/thawing several times or incubation at 37℃ for a certain time. This fusion protein was also able to bind to rat or guinea pig fibrin, but not to pig fibrin. Conclusion:Anti-human fibrin single-chain antibody: core-streptavidin fusion protein could be taken for developing reliable experimental animal models for the study of thrombus imaging and the targeting of thrombolytic agents.
, http://www.100md.com
Key words Streptavidin Fusion protein Anti-fibrin
血栓形成与动脉粥样硬化、栓塞等很多病理生理状态有关,发病率和死亡率均很高。据报道抗人纤维蛋白单链抗体与放射性核素或效应分子结合在血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗方面有很好的应用前景[1，2]。Rosebrough等用抗人纤维蛋白与链亲和素交联，产生的融合蛋白在两步法血栓显影中获得良好的效果[3]。本室用基因拼接方法构建了抗人纤维蛋白单链抗体分子与链亲和素融合蛋白表达载体，表达产物具有结合人纤维蛋白和生物素的双种功能。为了探索这个产物的应用前景，我们对其稳定性及与不同动物纤维蛋白的结合进行了研究。
1 材料与方法
1.1 表达载体 我室成功地克隆了鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链和轻链可变区基因，表达的抗人纤维蛋白单链抗体(scFv-8E5)具有特异性结合人纤维蛋白的活性[4]。随后构建了scFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-8E5(图1)。链亲和素基因位于scFv-8E5基因的3′端,构成嵌合基因。在嵌合基因的5′端有果胶酶先导序列，受控于上游的Lac启动子, 在IPTG的诱导下启动表达。嵌合基因3′末端的C-myc短肽密码子可作为表达产物的标记，6个组氨酸密码子用于表达产物的纯化。
, http://www.100md.com
图1 重组的表达载体pSTE2-8E5
Fig.1 Restriction map of recombinant expression vector pSTE2-8E5
1.2 scFv-8E5:core-streptavidin的表达和纯化 选取经酶切鉴定正确的阳性克隆用LBGA(含有50 μg/ml氨苄青霉素、100 mmol/L葡萄糖的LB)培养过夜，次日1∶40倒入新鲜LBGA，待OD600为0.8时加入100 μmol/L IPTG诱导，室温振摇3 h后收集菌体，超声裂解细胞收集包涵体,用含3 mol/L尿素、50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.0的溶液洗涤后加入6 mol/L盐酸胍、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 7.0溶液溶解，经IMAC柱一步纯化[5]。用TEA缓冲液(0.4 ml精氨酸-HCl，0.1 mol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,pH 7.0)透析复性后分装保存备用。
, 百拇医药
1.3 SDS-PAGE电泳 100 μmol/L IPTG诱导组菌体总蛋白及经IMAC柱纯化的包涵体蛋白用10% 聚丙烯酰胺还原电泳,考马斯亮蓝染色后观察。
1.4 scFv-8E5:core-streptavidin 融合蛋白的活性分析 用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)观察 IMAC 柱纯化的scFv-8E5: core-streptavidin对各种纤维蛋白的识别[4]。用各种纤维蛋白原分别包被96孔板，37 ℃烤干，用含15%牛血清的DMEM培养液活化纤维蛋白原为纤维蛋白，加入相同剂量纯化的scFv-8E5:core-streptavidin，再加入1∶150生物素标记的辣根过氧化物酶(购自华美)， 用四甲基联苯胺(TMB)为底物。2 mol/L H2SO4终止反应后用酶标仪检测450 nm处的光吸收值。待测 OD值/阴性对照≥2.1判为阳性，<2.1判为阴性。ELISA中所用融合蛋白浓度为37.7 μg/ml(为与40 μg/ml人纤维蛋白结合的平台剂量)。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 scFv-8E5:core-streptavidin的表达 100 μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE电泳表明， scFv-8E5: core-streptavidin融合蛋白单体的分子量约45 kD左右。经IMAC柱纯化后融合蛋白成为主带，纯度高，见图2。
图2 总蛋白和包涵体的SDS-PAGE电泳
Fig.2 SDS-PAGE of total cell extracts and inclusion bodies
Note:M. Protein molecular weight markers; Lane 1. E. coli JM109 transfected with pSTE2-8E5 induced with 100 μmol/L IPTG; Lane 2. E. coli JM109 transfected with pSTE2-8E5 without IPTG; Lane 3. Protein from inclusion bodies purified by IMAC
, 百拇医药
2.2 scFv-8E5:core-streptavidin的稳定性 ELISA检测IMAC柱纯化后的融合蛋白与人纤维蛋白的结合，以0℃保存的融合蛋白为阳性对照，阴性对照用PBS代替融合蛋白。融合蛋白冻融1～3次、4℃保存1～2 w或37℃孵育1 h后其与纤维蛋白的结合活性无明显变化，37℃孵育2 h活性下降约1/3，室温放置1 w后基本无活性，见图3。
图3 scFv-8E5: core-streptavidin 的稳定性
Fig.3 The stability of scFv-8E5: core-streptavidin
Note:R.T. room temperature; F./T. freezing/thawing; t. time
, 百拇医药
2.3 scFv-8E5:core-streptavidin对纤维蛋白的识别 ELISA检测IMAC柱纯化后的融合蛋白与不同动物纤维蛋白的结合， 以人纤维蛋白为阳性对照，阴性对照用包被液(BBS,0.05 mol/L,pH 9.6 Na2CO3-NaHCO3缓冲液)。 融合蛋白与低浓度(10 μg/ml)的大鼠纤维蛋白即有结合活性，与较高浓度(20～40 μg/ml) 的豚鼠纤维蛋白有结合活性，不与猪纤维蛋白结合。融合蛋白与大鼠、豚鼠纤维蛋白的结合活性约为与人纤维蛋白结合活性的70%，结果见表1。
表1 融合蛋白与不同动物纤维蛋白的抗原结合力分析
Tab.1 The binding of fusion protein to fibrin originating from four different species Species
, 百拇医药
Concentration of fibrin
10 μg/ml
20 μg/ml
40 μg/ml
Human
0.411
0.628
0.832
Rat
0.470
0.491
0.452
, http://www.100md.com
Guinea pig
0.235
0.405
0.487
Pig
0.1691)
0.1391)
0.188
Note:Negative control OD450=0.081， 1) negative， the others are positive
3 讨 论
, http://www.100md.com
链亲和素(streptavidin)由4个相同的约15 kD 亚单位构成， 天然配基是生物素(Biotin)。去除链亲和素的N-和 C-末端几个氨基酸后形成的核心链亲和素仍不失其生物素结合活性[6]。本文报道的嵌合基因表达产物scFv-8E5:core-streptavidin融合蛋白能与人纤维蛋白结合，又获得结合生物素的功能， 表明结构正确。这种拼接方法的成功为scFv-8E5拼接其它效应分子用于血栓显影或溶栓治疗提供了可行性依据。链亲和素单体间的聚合可以使融合蛋白形成四聚体结构[6]，有助于提高抗原结合力。Rosebrough等采用交联方法制备抗纤维蛋白单抗-链亲和素融合蛋白，利用其结合纤维蛋白和生物素的功能作两步法血栓显影，提示具有同样双功能的scFv-8E5:core-streptavidin可用于血栓显影研究[3]。
scFv-8E5:core-streptavidin融合蛋白的稳定性好，反复冻融及短期4 ℃保存后对其抗原结合活性影响不大，37 ℃ 1 h活性下降不明显，37 ℃ 2 h活性降低约1/3，说明此融合蛋白容易保存，又可耐受一定时间的体温，失活前有充分的时间与血栓结合。为了在动物体内进行血栓显影和抗血栓研究，观察了scFv-8E5-链亲和素与不同动物纤维蛋白的反应，发现它能与大鼠和豚鼠的纤维蛋白结合，适用于大鼠或豚鼠血栓病模型，是作为临床前研究的有用材料。
, 百拇医药
作者简介：李文平，女，28岁，博士研究生；
宋增璇，女，61岁，博士生导师，主要研究造血调控
4 参考文献
1 Bode C, Hanson S R, Schmedtje J F et al. Antithrombotic potency of hirudin is increased in nonhuman primates by fibrin targeting. Circulation, 1997；95:800
2 Sung C，Van Osdol W W. Pharmacokinetic comparison of direct antibody targeting protocols based on streptavidin-biotin. J Nucl Med, 1995;36:867
, 百拇医药
3 Rosebrough S F，Hashmi M. Galactose-modified streptavidin-GC4 antifibrin monoclonal antibody conjugates:application for two-step thrombus/embolus imaging. J Pharmacol Exp Ther, 1996；276:770
4 Song Z X, Cai Y L, Song D Y et al. Primary structure and functional expression of heavy- and light-chain variable region genes of a monoclonal antibody specific for human fibrin. Hybridoma, 1997；16(3)：235
5 Kipriyanov S M, Dubel S, Breitling F et al. Recombinant single- chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent an biotinylated miniantibodies. Mol Immunol, 1994；31:1047
6 Dubel S, Breitling F, Kontermann R et al. Bifunctional and multimeric complexes of streptavidin fused to single chain antibodies(scFv). J Immunol Meth, 1995；178:201
〔收稿日期：1998-07-29 修稿日期：1998-09-07〕, 百拇医药