FAS配体(FASL)在COS-7细胞中的表达
作者：罗振革 彭 虹 孔祥英 高杰英
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所, 北京100850
关键词：FASL；真核表达；程序性细胞死亡
中国免疫学杂志990901 摘 要 目的：获得FASL的真核细胞表达，并分析其功能。方法：将编码人FASL(FAS ligand)的全长cDNA插入真核细胞瞬时表达载体PSVL的SV40晚期启动子下游的XbaI位点，构建FASL的真核细胞表达载体PSVL-hFASL，用电击法将PSVL-hFASL转染COS-7细胞，转染后48 h，用Northern-blot法检测FASL的表达。结果：转染后COS-7细胞有FASL的mRNA的表达，在COS-7细胞上表达的重组FASL能诱导FAS阳性的U937细胞发生程序性死亡。结论：在COS-7细胞表面表达的重组FASL分子能用于进一步功能研究和FAS系统拮抗剂的筛选。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
Expression of recombinant FAS ligand in COS-7 cells
LUO Zhen-Ge,PENG Hong,KONG Xiang-Ying et al.
Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850
Abstract Objective：Obtain recombinant FASL molecules in COS-7 cell line and study the functions of FASL. Methods:The cDNA for human FAS ligand(FASL) was cloned into the downstream of SV40 late promoter of PSVL plasmid, which is a eukaryotic transient expressive vector. By electroporation, PSVL-hFASL was transfected into cos-7 cells.48 h after transfection,whole RNA of transfected cos-7 cells was prepared and analyzed by Northern-blot.Results:PSVL-hFASL transfected cells had the expression of human FAS ligand mRNA, PSVL mock transfected cells was negative. There is expression of FAS antigen on the surface of U937 cells. With U937 cell line as target, the activity of recombinant human FAS ligand (rhFASL) was assayed. After coculture of U937 cells with FASL transfected COS-7, the target cells appeared apoptosis phenomenom. Conclusion:Recombinant FasL on the surface of COS-7 cells can be used as functional study.
, 百拇医药
Key words FASL Eukaryotic expression Apoptosis
FAS是一个Ⅰ型跨膜受体分子,属于TNF/NGF受体超家族的成员,存在于多种细胞表面,FAS的配体(抗FAS抗体或其天然配体FASL)与FAS胞外区结合后，使其形成三聚体，通过FAS胞浆区中“death domain”间作用，传递死亡信号,引起靶细胞的程序性死亡[1]。FASL(FAS ligand)是FAS的天然配体,为与TNF同源的Ⅱ型穿膜分子，主要分布于活化的T细胞及一些免疫屏蔽器官[2，3]。FAS系统不仅参与免疫细胞发育,还能下调免疫反应,从而维持免疫平衡,介导CTL及NK细胞对靶细胞的杀伤作用[4，5]。最近还有人报道了FAS系统介导的CD4+的Th1细胞诱导B细胞凋亡的作用[6]。FAS系统还与自身免疫病、移植排斥、病毒感染和肿瘤发生有密切关系[7，8]。为了深入分析FAS系统的功能和作用机制及在某些疾病发生、发展和控制中的作用,本文报道了重组FAS配体在真核细胞中表达的研究。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 质粒 pBX-hFASL,含hFASL cDNA,由日本东京大学惠赠；PSVL,真核细胞瞬时高效表达载体,本室保存。
1.2 试剂和试剂盒 WizardTM Maxipreps DNA Purification System,用于提取转染细胞用的质粒DNA,购自Promega公司;所用限制性内切酶购自国内外各公司。
1.3 FASL表达载体的构建 用XbaI内切酶将hFASL cDNA从pBX-hFASL质粒上切出,与经同样酶切并经碱性磷酸酶(CIP)脱磷酸处理的PSVL连接,形成的重组质粒PSVL-hFASL即为FASL的真核细胞表达载体。
1.4 PSVL-hFASL转染COS-7细胞 用胰酶或0.025%的EDTA消化贴壁生长的COS-7细胞,取2×107细胞悬浮于0.5 ml PBS(pH7.2)缓冲液中,加入20 μg质粒DNA,用电击仪(GIBCO BRL)进行电击转染。
, http://www.100md.com
1.5 Northern-blot检测FASLmRNA的表达 转染后48 h用异硫氰酸胍一步法提取COS-7细胞的总RNA,取15 μg总RNA进行甲醛变性电泳,毛细法转移到硝酸纤维素膜上,与32P标记的FASL探针进行杂交,放射自显影。PSVL空载体转染的细胞作为对照。
1.6 重组FASL的活性检测 转染后48 h,吸去培养液,用新鲜培养液洗去死细胞,加入FAS+的U937细胞作为靶细胞(靶效比为1∶1),37℃作用不同时间,按文献[9]提取悬浮细胞(即靶细胞)的DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中染色体断裂形成的阶梯状带型,用此种方法分析COS-7表达的FASL的活性。
2 结 果
2.1 FASL真核细胞表达载体的构建 将FASL的cDNA插入PSVL的SV40晚期启动子下游,构成表达载体PSVL-hFASL,用BglII和EcoRV对重组质粒进行酶切鉴定,图1为鉴定结果,切出5.02和0.84 kb两个片段为正向插入,切出1.61和4.26 kb两个片段为反向插入。
, 百拇医药
图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant plasmids by restriction enzyme digestion
Note:1～6.PSVL-hFASL+BglII/EcoRV(1,2,6.Right direction，3,4,5.Reverse direction);7.DNA molecule weight marker
2.2 COS-7细胞的转染及Northern-blot检测 Northern杂交显示从PSVL-hFASL转染的COS-7细胞提取的总RNA与hFASL cDNA探针杂交呈阳性,而PSVL空载体转染的细胞呈阴性(图2),说明转染后COS-7细胞在mRNA转录水平上获得了FASL的表达,可进行功能及活性研究。
, http://www.100md.com
图2 Northern-blot检测hFASL mRNA的表达
Fig.2 Detection of hFASL mRNA by Northern-blot
Note:1.Whole RNA from COS-7 cells transfected with PSVL-hFASL；2.Whole RNA from PSVL mock transfected COS-7 cells as negative control
2.3 重组FASL诱导靶细胞U937产生程序性细胞死亡 COS-7细胞经hFASL表达载体转染,培养48 h后,加入U937细胞作为靶细胞,作用1～5 h,取悬浮的U937细胞进行Giemsa染色观察细胞形态,同时提取U937靶细胞的DNA,进行电泳检测,结果显示:作用4 h后,光镜下可见有些细胞核深染、固缩,有些细胞核呈碎裂状,出现很多泡状颗粒,可能为凋亡小体;作用1 h,电泳显示U937细胞的DNA开始出现阶梯状带型,3 h时梯状条带最为明显,作用5 h后梯状条带消失,染色体DNA断裂形成的片段大小为180～200 bp的倍数,为具有凋亡特征性的阶梯状带型(图3)。
, http://www.100md.com
图3 DNA的琼脂糖凝胶电泳显示DNA阶梯状带型
Fig.3 DNA degration was analyzed by agarose gel electrophoresis
Note:1.DNA molecule weight markers;2.DNA from U937 cells not treated by recombinant hFASL as negative control; 3～7.DNA from U937 cells treated by recombinant hFASL for 1 to 5 h
3 讨 论
FASL是一个40 kD的Ⅱ型跨膜蛋白，在氨基酸水平上人和小鼠的FASL有76.9%的同源,人的和小鼠的FAS及FASL的作用完全交叉[2]。为了深入分析FAS系统在免疫细胞发育、免疫反应中的作用，探索FAS系统介入移植排斥、自身免疫病、恶性肿瘤、病毒感染等疾病的机理，探讨这些疾病预防与治疗的新途径，进行重组FASL表达研究是必要的。
, http://www.100md.com
已有证据表明FASL是以三聚体的形式发挥作用的，因此在原核细胞中很难获得有生物活性的FASL分子，因此我们在COS-7细胞中进行重组FASL
的表达，有多篇文献报道人前单核白血病细胞系U937具有FAS分子的表达，抗FAS抗体能诱导U937细胞产生程序性细胞死亡 ，本文用U937作为靶细胞分析重组FASL的活性。凋亡细胞往往发生一些形态学和结构上的变化，最具特征性的改变是其细胞核的改变，核膜皱褶扭曲,核内DNA含量降低,另外一个显著特点是凋亡细胞的染色质以核小体为单位被裂解，由于每个核小体缠绕的DNA长度约为200 bp,染色质断裂形成的DNA片段大小为200 bp的倍数，在电泳时显示出所谓“阶梯状带型(DNA ladder)” [3] 。将FASL转染COS-7细胞,培养48h即检测到FASL的mRNA的表达，此时在贴壁生长的转染细胞上加入悬浮培养的U937细胞，作用1 h,靶细胞U937的染色体DNA即出现“DNA ladder”,3 h时最为明显,随着核酸酶类的作用,4 h时,DNA“梯状”带型变弱,作用5 h,DNA完全被酶解。以上结果表明我们在真核细胞里获得了有活性FASL的表达,为FAS系统的功能研究奠定了基础。
, 百拇医药
作者简介:罗振革,男,31岁,博士,主要从事感染免疫和分子免疫研究
4 参考文献
1 Nagata S.FAS-mediated apoptosis.Adv Exp Med Bio,1996;406:119
2 Suda T,Takahashi T, Golstein P et al.Molecular cloning and expression of the FAS ligand,the novel member of the tumor necrosis factor family.Cell,1993;75:1169
3 Griffith T S,Rrunner T,Fletcher S M et al.Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege.Science,1995;270:1189
, http://www.100md.com
4 Esser M T , Dinglasan R D，Krishnamurthy B et al.IL-2 induces Fas ligand/Fas (CD95L/CD95) cytotoxicity in CD8+ and CD4+ T lymphocyte clones.J Immunol，1997; 158:5612
5 Lenardo M J.FAS and the art of lymphocyte maintenance .J Exp Med.1996;183:721.
6 Schattner E,Friedman S M.FAS expression and apoptosis in human B cells.Immunol Res，1996;15:246
7 Sakai T, Kimura Y, Inagaki-Ohara K et al.Fas-mediated cytotoxicity by intestinal intraepithelial lymphocytes during acute graft-versus-host disease in mice. Gastroenterology， 1997; 113:168
, 百拇医药
8 Nishio A, Katakai T, Oshima C et al. Possible involvement of Fas-Fas ligand signaling in the pathogenesis of murine autoimmune gastritis.Gastroenterology, 1996 ; 111: 959
9 Laird P W,Zijderveld A,Linders K et al.Simplified mammalian DNA isolation procedure.Nucl Acid Res，1991;19:4293
〔收稿日期：1998-02-20 修稿日期：1998-08-17〕, 百拇医药
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所, 北京100850
关键词：FASL；真核表达；程序性细胞死亡
中国免疫学杂志990901 摘 要 目的：获得FASL的真核细胞表达，并分析其功能。方法：将编码人FASL(FAS ligand)的全长cDNA插入真核细胞瞬时表达载体PSVL的SV40晚期启动子下游的XbaI位点，构建FASL的真核细胞表达载体PSVL-hFASL，用电击法将PSVL-hFASL转染COS-7细胞，转染后48 h，用Northern-blot法检测FASL的表达。结果：转染后COS-7细胞有FASL的mRNA的表达，在COS-7细胞上表达的重组FASL能诱导FAS阳性的U937细胞发生程序性死亡。结论：在COS-7细胞表面表达的重组FASL分子能用于进一步功能研究和FAS系统拮抗剂的筛选。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
Expression of recombinant FAS ligand in COS-7 cells
LUO Zhen-Ge,PENG Hong,KONG Xiang-Ying et al.
Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850
Abstract Objective：Obtain recombinant FASL molecules in COS-7 cell line and study the functions of FASL. Methods:The cDNA for human FAS ligand(FASL) was cloned into the downstream of SV40 late promoter of PSVL plasmid, which is a eukaryotic transient expressive vector. By electroporation, PSVL-hFASL was transfected into cos-7 cells.48 h after transfection,whole RNA of transfected cos-7 cells was prepared and analyzed by Northern-blot.Results:PSVL-hFASL transfected cells had the expression of human FAS ligand mRNA, PSVL mock transfected cells was negative. There is expression of FAS antigen on the surface of U937 cells. With U937 cell line as target, the activity of recombinant human FAS ligand (rhFASL) was assayed. After coculture of U937 cells with FASL transfected COS-7, the target cells appeared apoptosis phenomenom. Conclusion:Recombinant FasL on the surface of COS-7 cells can be used as functional study.
, 百拇医药
Key words FASL Eukaryotic expression Apoptosis
FAS是一个Ⅰ型跨膜受体分子,属于TNF/NGF受体超家族的成员,存在于多种细胞表面,FAS的配体(抗FAS抗体或其天然配体FASL)与FAS胞外区结合后，使其形成三聚体，通过FAS胞浆区中“death domain”间作用，传递死亡信号,引起靶细胞的程序性死亡[1]。FASL(FAS ligand)是FAS的天然配体,为与TNF同源的Ⅱ型穿膜分子，主要分布于活化的T细胞及一些免疫屏蔽器官[2，3]。FAS系统不仅参与免疫细胞发育,还能下调免疫反应,从而维持免疫平衡,介导CTL及NK细胞对靶细胞的杀伤作用[4，5]。最近还有人报道了FAS系统介导的CD4+的Th1细胞诱导B细胞凋亡的作用[6]。FAS系统还与自身免疫病、移植排斥、病毒感染和肿瘤发生有密切关系[7，8]。为了深入分析FAS系统的功能和作用机制及在某些疾病发生、发展和控制中的作用,本文报道了重组FAS配体在真核细胞中表达的研究。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 质粒 pBX-hFASL,含hFASL cDNA,由日本东京大学惠赠；PSVL,真核细胞瞬时高效表达载体,本室保存。
1.2 试剂和试剂盒 WizardTM Maxipreps DNA Purification System,用于提取转染细胞用的质粒DNA,购自Promega公司;所用限制性内切酶购自国内外各公司。
1.3 FASL表达载体的构建 用XbaI内切酶将hFASL cDNA从pBX-hFASL质粒上切出,与经同样酶切并经碱性磷酸酶(CIP)脱磷酸处理的PSVL连接,形成的重组质粒PSVL-hFASL即为FASL的真核细胞表达载体。
1.4 PSVL-hFASL转染COS-7细胞 用胰酶或0.025%的EDTA消化贴壁生长的COS-7细胞,取2×107细胞悬浮于0.5 ml PBS(pH7.2)缓冲液中,加入20 μg质粒DNA,用电击仪(GIBCO BRL)进行电击转染。
, http://www.100md.com
1.5 Northern-blot检测FASLmRNA的表达 转染后48 h用异硫氰酸胍一步法提取COS-7细胞的总RNA,取15 μg总RNA进行甲醛变性电泳,毛细法转移到硝酸纤维素膜上,与32P标记的FASL探针进行杂交,放射自显影。PSVL空载体转染的细胞作为对照。
1.6 重组FASL的活性检测 转染后48 h,吸去培养液,用新鲜培养液洗去死细胞,加入FAS+的U937细胞作为靶细胞(靶效比为1∶1),37℃作用不同时间,按文献[9]提取悬浮细胞(即靶细胞)的DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中染色体断裂形成的阶梯状带型,用此种方法分析COS-7表达的FASL的活性。
2 结 果
2.1 FASL真核细胞表达载体的构建 将FASL的cDNA插入PSVL的SV40晚期启动子下游,构成表达载体PSVL-hFASL,用BglII和EcoRV对重组质粒进行酶切鉴定,图1为鉴定结果,切出5.02和0.84 kb两个片段为正向插入,切出1.61和4.26 kb两个片段为反向插入。
, 百拇医药
图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 Identification of recombinant plasmids by restriction enzyme digestion
Note:1～6.PSVL-hFASL+BglII/EcoRV(1,2,6.Right direction，3,4,5.Reverse direction);7.DNA molecule weight marker
2.2 COS-7细胞的转染及Northern-blot检测 Northern杂交显示从PSVL-hFASL转染的COS-7细胞提取的总RNA与hFASL cDNA探针杂交呈阳性,而PSVL空载体转染的细胞呈阴性(图2),说明转染后COS-7细胞在mRNA转录水平上获得了FASL的表达,可进行功能及活性研究。
, http://www.100md.com
图2 Northern-blot检测hFASL mRNA的表达
Fig.2 Detection of hFASL mRNA by Northern-blot
Note:1.Whole RNA from COS-7 cells transfected with PSVL-hFASL；2.Whole RNA from PSVL mock transfected COS-7 cells as negative control
2.3 重组FASL诱导靶细胞U937产生程序性细胞死亡 COS-7细胞经hFASL表达载体转染,培养48 h后,加入U937细胞作为靶细胞,作用1～5 h,取悬浮的U937细胞进行Giemsa染色观察细胞形态,同时提取U937靶细胞的DNA,进行电泳检测,结果显示:作用4 h后,光镜下可见有些细胞核深染、固缩,有些细胞核呈碎裂状,出现很多泡状颗粒,可能为凋亡小体;作用1 h,电泳显示U937细胞的DNA开始出现阶梯状带型,3 h时梯状条带最为明显,作用5 h后梯状条带消失,染色体DNA断裂形成的片段大小为180～200 bp的倍数,为具有凋亡特征性的阶梯状带型(图3)。
, http://www.100md.com
图3 DNA的琼脂糖凝胶电泳显示DNA阶梯状带型
Fig.3 DNA degration was analyzed by agarose gel electrophoresis
Note:1.DNA molecule weight markers;2.DNA from U937 cells not treated by recombinant hFASL as negative control; 3～7.DNA from U937 cells treated by recombinant hFASL for 1 to 5 h
3 讨 论
FASL是一个40 kD的Ⅱ型跨膜蛋白，在氨基酸水平上人和小鼠的FASL有76.9%的同源,人的和小鼠的FAS及FASL的作用完全交叉[2]。为了深入分析FAS系统在免疫细胞发育、免疫反应中的作用，探索FAS系统介入移植排斥、自身免疫病、恶性肿瘤、病毒感染等疾病的机理，探讨这些疾病预防与治疗的新途径，进行重组FASL表达研究是必要的。
, http://www.100md.com
已有证据表明FASL是以三聚体的形式发挥作用的，因此在原核细胞中很难获得有生物活性的FASL分子，因此我们在COS-7细胞中进行重组FASL
的表达，有多篇文献报道人前单核白血病细胞系U937具有FAS分子的表达，抗FAS抗体能诱导U937细胞产生程序性细胞死亡 ，本文用U937作为靶细胞分析重组FASL的活性。凋亡细胞往往发生一些形态学和结构上的变化，最具特征性的改变是其细胞核的改变，核膜皱褶扭曲,核内DNA含量降低,另外一个显著特点是凋亡细胞的染色质以核小体为单位被裂解，由于每个核小体缠绕的DNA长度约为200 bp,染色质断裂形成的DNA片段大小为200 bp的倍数，在电泳时显示出所谓“阶梯状带型(DNA ladder)” [3] 。将FASL转染COS-7细胞,培养48h即检测到FASL的mRNA的表达，此时在贴壁生长的转染细胞上加入悬浮培养的U937细胞，作用1 h,靶细胞U937的染色体DNA即出现“DNA ladder”,3 h时最为明显,随着核酸酶类的作用,4 h时,DNA“梯状”带型变弱,作用5 h,DNA完全被酶解。以上结果表明我们在真核细胞里获得了有活性FASL的表达,为FAS系统的功能研究奠定了基础。
, 百拇医药
作者简介:罗振革,男,31岁,博士,主要从事感染免疫和分子免疫研究
4 参考文献
1 Nagata S.FAS-mediated apoptosis.Adv Exp Med Bio,1996;406:119
2 Suda T,Takahashi T, Golstein P et al.Molecular cloning and expression of the FAS ligand,the novel member of the tumor necrosis factor family.Cell,1993;75:1169
3 Griffith T S,Rrunner T,Fletcher S M et al.Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege.Science,1995;270:1189
, http://www.100md.com
4 Esser M T , Dinglasan R D，Krishnamurthy B et al.IL-2 induces Fas ligand/Fas (CD95L/CD95) cytotoxicity in CD8+ and CD4+ T lymphocyte clones.J Immunol，1997; 158:5612
5 Lenardo M J.FAS and the art of lymphocyte maintenance .J Exp Med.1996;183:721.
6 Schattner E,Friedman S M.FAS expression and apoptosis in human B cells.Immunol Res，1996;15:246
7 Sakai T, Kimura Y, Inagaki-Ohara K et al.Fas-mediated cytotoxicity by intestinal intraepithelial lymphocytes during acute graft-versus-host disease in mice. Gastroenterology， 1997; 113:168
, 百拇医药
8 Nishio A, Katakai T, Oshima C et al. Possible involvement of Fas-Fas ligand signaling in the pathogenesis of murine autoimmune gastritis.Gastroenterology, 1996 ; 111: 959
9 Laird P W,Zijderveld A,Linders K et al.Simplified mammalian DNA isolation procedure.Nucl Acid Res，1991;19:4293
〔收稿日期：1998-02-20 修稿日期：1998-08-17〕, 百拇医药