乙型肝炎后肝硬化病人的辅助-诱导和抑制-诱导T淋巴细胞亚群分析
作者：郭树彬 张曼娜 宋国培
单位：白求恩医科大学第一临床医学院消化内科，长春130021
关键词：
中国免疫学杂志991015 乙型肝炎后肝硬化病人体内长期有乙型肝炎病毒存在，肝功能损害反复出现，病情不断进展，其机理被认为是机体对病毒感染的免疫应答所致。为了研究乙型肝炎后肝硬化病人T淋巴细胞亚群的变化与机体免疫紊乱的关系，我们采用单抗致敏花环-PAP双染色法及间接免疫荧光法对乙型肝炎后肝硬化病人外周血中的不同T细胞亚群进行检测，从亚群数目变化的角度对肝功能的损害及细胞、体液免疫的异常进行了解释，以指导临床治疗。
中国图书分类号 R575.1 R575.2
1 对象与方法
1.1 检测对象 所有病人组均经临床明确诊断为乙型肝炎后肝硬化；对照组为健康成人，均无慢性疾病和免疫病史。
, http://www.100md.com
1.2 检测方法
1.2.1 淋巴细胞分离及计数 常规采外周血进行。
1.2.2 间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群 CD3、CD1、CD8及CD25抗CD3、CD4、CD8、CD23鼠单抗由德国MPG协会风湿/免疫研究所提供，FITC标记的兔抗鼠IgG购自武汉生物制品研究所。将淋巴细胞悬液与鼠单抗混匀，4℃反应1 h，洗涤3次，加FITC标记的兔抗鼠IgG，4℃反应1 h，洗涤3次，重悬至原体积，取样滴于玻片镜检。用普通光计数视野中淋巴细胞，后用紫外光计数同一视野中有荧光的细胞数，计算荧光阳性细胞百分率。
1.2.3 PAP双染色法检测T淋巴细胞亚群 鼠PAP及羊抗鼠IgG购自中国军事医学科学院。取淋巴细胞悬液与致敏CD4红细胞混匀，涂片，固定，除酶，封闭，洗片，加鼠单抗，室温1 h，加羊抗鼠IgG，室温反应1 h，DAB遮光染色6～12 min，洗片，甲基绿染核1 min以上，梯度酒精脱水，二甲苯透明后滴加拿大树胶，盖片封固。镜下计数阳性花环，膜着色为橙红色的细胞为CD4+CD45 RO+和CD4+CD45 RA+T细胞，计算相对百分率和绝对数。
, 百拇医药
1.3 统计学方法 采用显著性t检验。
2 结果
乙型肝炎后肝硬化病人T淋巴细胞亚群变化见表1、2。
表1 乙型肝炎后肝硬化病人外周血T淋巴细胞亚群变化(
±s)
Tab.1 Changes of T lymphocyte subpopulations in peripheral blood from patients with HBsAg-positive hepatocirrhosis(±s) T lymphocyte
subpopulation
, http://www.100md.com
Patients
group(%)
Control(%)
P
CD3+
61.0±4.58
55.0±8.50
<0.01
CD4+
40.1±7.50
43.8±9.00
<0.05
, 百拇医药
CD8+
35.5±6.20
32.0±7.10
<0.05
CD25+
3.8±2.60
5.8±2.20
<0.01
CD4+CD45 RA+
21.2±5.60
22.4±4.20
, http://www.100md.com
>0.05
CD4+CD45 RO+
35.6±7.20
29.0±6.10
<0.01
表2 乙型肝炎后肝硬化病人外周血淋巴细胞绝对数的变化
Tab.2 Changes of absolute number of T lymphocyte in peripheral blood from patients with HBsAg-positive hepatocirrhosis Cell type
Patients group
, http://www.100md.com
Control
P
(cells/μl)
(cells/μl)
Total T cell
1 250±178
1 810±125
0.001
CD4+CD45 RA+T cell
320±78
510±60
, http://www.100md.com
0.05
CD4+CD45 RO+T cell
468±76
467±72
0.05
3 讨论
两种新的抗淋巴细胞膜表面抗原的单克隆抗体，将CD4+T细胞分为CD4+CD45 RA+和CD4+CD45 RO+两大的互补亚群：①前者对诱导CD8+T细胞在美洲商陆为丝裂原刺激时产生IgG和特异性抗原抗体系统两方面具有抑制功能；②后者对B细胞产生的免疫球蛋白提供辅助诱导作用，同CD8+T细胞(抑制性/细胞毒性T细胞)类似，可以引起细胞毒作用。这两种T细胞功能亚群的失衡，在一定程度上可以解释乙型肝炎后肝硬化病人的细胞免疫及体液免疫变化。本实验亦证实了肝硬化病人外周血淋巴细胞绝对数降低，CD4/CD8比率降低，与其它报道一致。乙型肝炎后肝硬化病人的CD4亚群中CD4+CD45 RA+和CD4+CD45 RO+亚群的变化尚少见报道。国外采用双色荧光、IgG Panning等技术分离这两种亚群，所需设备及试剂较昂贵。我们采用单抗致敏花环-PAP双染色使这两种亚群的检测简单易行，结果显示CD4+CD45 RA+T细胞减少，CD4+CD45 RO+T细胞相对增多，但因为淋巴细胞总数的减少，其绝对数并不比对照组增多。
, 百拇医药
CD4+T辅助细胞与有抗原存在的辅助细胞或丝裂原接触后可被激活。研究显示无记忆的、未接触抗原、未被激活的CD4+细胞表面的白细胞共同抗原CD45 RA决定簇具有诱导抗原特异或非特异性T抑制细胞(即CD8+CD11b+)的能力。激活的CD4+T细胞转化为记忆细胞，并失去CD45 RA而获得另一白细胞共同抗原—CD45 RO抗原决定簇。该细胞(即CD4+CD45 RO+T细胞)被认为辅助性作用于B细胞增殖，免疫球蛋白分泌及杀伤细胞(CD8+CD11b细胞)。乙型肝炎后肝硬化病人这一亚群升高，同肝硬化病人B细胞功能亢进， IgG分泌增多及肝功能损伤，肝细胞坏死呈正相关(结果未列出)，同T抑制细胞亚群CD4+CD45 RA+T细胞的减少相平行。我们认为CD4+CD45 RO+T细胞在乙型肝炎后肝硬化病人的外周血中相对增多是乙肝病毒抗原慢性刺激积累的结果。
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作者简介：郭树彬，男，36岁，博士生，主要从事肝炎、肝硬化免疫及临床研究；
指导老师，宋国培，男，64岁，主要从事胃肠道疾病研究
参考文献
1 ZI X M,XIU M L,Lennox J et al. Immunophenotyping of lymphocytes in liver tissue of patients with chronic liver diseases by flow cytometry.Hepatology, 1991;14(1)：121
2 Charles R， Mackay .T-cell memory:the connection between fuction,pheuotype and migration pathways. Immunology Today, 1991; 12:6
3 Matmew Z T.The leukocyte common antigen family.Ann Rev Immunol,1989;7:339
4 Martin E,Sanders ,Nancy G et al.Human naive and memory T cells.Immunology Today,1998; 9：7
收稿1999-01-11 修回1999-06-14
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单位：白求恩医科大学第一临床医学院消化内科，长春130021
关键词：
中国免疫学杂志991015 乙型肝炎后肝硬化病人体内长期有乙型肝炎病毒存在，肝功能损害反复出现，病情不断进展，其机理被认为是机体对病毒感染的免疫应答所致。为了研究乙型肝炎后肝硬化病人T淋巴细胞亚群的变化与机体免疫紊乱的关系，我们采用单抗致敏花环-PAP双染色法及间接免疫荧光法对乙型肝炎后肝硬化病人外周血中的不同T细胞亚群进行检测，从亚群数目变化的角度对肝功能的损害及细胞、体液免疫的异常进行了解释，以指导临床治疗。
中国图书分类号 R575.1 R575.2
1 对象与方法
1.1 检测对象 所有病人组均经临床明确诊断为乙型肝炎后肝硬化；对照组为健康成人，均无慢性疾病和免疫病史。
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1.2 检测方法
1.2.1 淋巴细胞分离及计数 常规采外周血进行。
1.2.2 间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群 CD3、CD1、CD8及CD25抗CD3、CD4、CD8、CD23鼠单抗由德国MPG协会风湿/免疫研究所提供，FITC标记的兔抗鼠IgG购自武汉生物制品研究所。将淋巴细胞悬液与鼠单抗混匀，4℃反应1 h，洗涤3次，加FITC标记的兔抗鼠IgG，4℃反应1 h，洗涤3次，重悬至原体积，取样滴于玻片镜检。用普通光计数视野中淋巴细胞，后用紫外光计数同一视野中有荧光的细胞数，计算荧光阳性细胞百分率。
1.2.3 PAP双染色法检测T淋巴细胞亚群 鼠PAP及羊抗鼠IgG购自中国军事医学科学院。取淋巴细胞悬液与致敏CD4红细胞混匀，涂片，固定，除酶，封闭，洗片，加鼠单抗，室温1 h，加羊抗鼠IgG，室温反应1 h，DAB遮光染色6～12 min，洗片，甲基绿染核1 min以上，梯度酒精脱水，二甲苯透明后滴加拿大树胶，盖片封固。镜下计数阳性花环，膜着色为橙红色的细胞为CD4+CD45 RO+和CD4+CD45 RA+T细胞，计算相对百分率和绝对数。
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1.3 统计学方法 采用显著性t检验。
2 结果
乙型肝炎后肝硬化病人T淋巴细胞亚群变化见表1、2。
表1 乙型肝炎后肝硬化病人外周血T淋巴细胞亚群变化(
±s)Tab.1 Changes of T lymphocyte subpopulations in peripheral blood from patients with HBsAg-positive hepatocirrhosis(
±s) T lymphocytesubpopulation
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Patients
group(%)
Control(%)
P
CD3+
61.0±4.58
55.0±8.50
<0.01
CD4+
40.1±7.50
43.8±9.00
<0.05
, 百拇医药
CD8+
35.5±6.20
32.0±7.10
<0.05
CD25+
3.8±2.60
5.8±2.20
<0.01
CD4+CD45 RA+
21.2±5.60
22.4±4.20
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>0.05
CD4+CD45 RO+
35.6±7.20
29.0±6.10
<0.01
表2 乙型肝炎后肝硬化病人外周血淋巴细胞绝对数的变化
Tab.2 Changes of absolute number of T lymphocyte in peripheral blood from patients with HBsAg-positive hepatocirrhosis Cell type
Patients group
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Control
P
(cells/μl)
(cells/μl)
Total T cell
1 250±178
1 810±125
0.001
CD4+CD45 RA+T cell
320±78
510±60
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0.05
CD4+CD45 RO+T cell
468±76
467±72
0.05
3 讨论
两种新的抗淋巴细胞膜表面抗原的单克隆抗体，将CD4+T细胞分为CD4+CD45 RA+和CD4+CD45 RO+两大的互补亚群：①前者对诱导CD8+T细胞在美洲商陆为丝裂原刺激时产生IgG和特异性抗原抗体系统两方面具有抑制功能；②后者对B细胞产生的免疫球蛋白提供辅助诱导作用，同CD8+T细胞(抑制性/细胞毒性T细胞)类似，可以引起细胞毒作用。这两种T细胞功能亚群的失衡，在一定程度上可以解释乙型肝炎后肝硬化病人的细胞免疫及体液免疫变化。本实验亦证实了肝硬化病人外周血淋巴细胞绝对数降低，CD4/CD8比率降低，与其它报道一致。乙型肝炎后肝硬化病人的CD4亚群中CD4+CD45 RA+和CD4+CD45 RO+亚群的变化尚少见报道。国外采用双色荧光、IgG Panning等技术分离这两种亚群，所需设备及试剂较昂贵。我们采用单抗致敏花环-PAP双染色使这两种亚群的检测简单易行，结果显示CD4+CD45 RA+T细胞减少，CD4+CD45 RO+T细胞相对增多，但因为淋巴细胞总数的减少，其绝对数并不比对照组增多。
, 百拇医药
CD4+T辅助细胞与有抗原存在的辅助细胞或丝裂原接触后可被激活。研究显示无记忆的、未接触抗原、未被激活的CD4+细胞表面的白细胞共同抗原CD45 RA决定簇具有诱导抗原特异或非特异性T抑制细胞(即CD8+CD11b+)的能力。激活的CD4+T细胞转化为记忆细胞，并失去CD45 RA而获得另一白细胞共同抗原—CD45 RO抗原决定簇。该细胞(即CD4+CD45 RO+T细胞)被认为辅助性作用于B细胞增殖，免疫球蛋白分泌及杀伤细胞(CD8+CD11b细胞)。乙型肝炎后肝硬化病人这一亚群升高，同肝硬化病人B细胞功能亢进， IgG分泌增多及肝功能损伤，肝细胞坏死呈正相关(结果未列出)，同T抑制细胞亚群CD4+CD45 RA+T细胞的减少相平行。我们认为CD4+CD45 RO+T细胞在乙型肝炎后肝硬化病人的外周血中相对增多是乙肝病毒抗原慢性刺激积累的结果。
, http://www.100md.com
作者简介：郭树彬，男，36岁，博士生，主要从事肝炎、肝硬化免疫及临床研究；
指导老师，宋国培，男，64岁，主要从事胃肠道疾病研究
参考文献
1 ZI X M,XIU M L,Lennox J et al. Immunophenotyping of lymphocytes in liver tissue of patients with chronic liver diseases by flow cytometry.Hepatology, 1991;14(1)：121
2 Charles R， Mackay .T-cell memory:the connection between fuction,pheuotype and migration pathways. Immunology Today, 1991; 12:6
3 Matmew Z T.The leukocyte common antigen family.Ann Rev Immunol,1989;7:339
4 Martin E,Sanders ,Nancy G et al.Human naive and memory T cells.Immunology Today,1998; 9：7
收稿1999-01-11 修回1999-06-14
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