一种新的共刺激信号CD137在人T细胞及其亚群中的表达特点①
作者：张利宁 曹英林 马春红 宋静 赵文璞 朱长军 孙汶生
单位：
关键词：T细胞；共刺激信号，,CD137；免疫细胞化学；流式细胞术
中国免疫学杂志991005 摘 要 目的：为了分析CD137在正常人静止状态和受PHA刺激后不同时间T淋巴细胞及其亚群上的表达特点和规律。方法：采用免疫细胞化学和流式细胞术。结果：发现未刺激的淋巴细胞上无CD137表达。经PHA刺激后(仅T细胞发生转化),24 h已有表达,以后表达率逐渐增高。免疫细胞化学法显示,24、48、72 h CD137的表达率分别为(10.0±2.0)%、(13.0±2.0)%、(20.0±4.0)%，CD137表达在细胞膜表面,细胞浆、细胞核无表达。流式细胞仪测定结果与免疫细胞化学法相吻合，PHA刺激24、48、72 h的表达率分别为(8.16±1.28)%、(12.39±2.15)%、(21.60±4.30)%。CD4+T细胞和CD8+细胞均可表达，但在CD4+T细胞上的表达率高于CD8+细胞。结论：CD137仅表达于活化T细胞表面，CD4+和CD8+细胞均可表达。静止T细胞无CD137表达。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392
Expression feature of CD137(human 4-1BB),a new co-stimulatory signal
on T cells and T cell subsets
ZHANG Li-Ning,CAO Ying-Lin,MA Chun-Hong et al.
Department of Microbiology and Immunology,Shandong Medical University，Jinan 250012
Abstract Objective：In order to study the expression feature of CD137 on T cells and T cell subsets.Methods：Immunohistochemistry and flow cytometry.Results：CD137 was not expressed on resting T cells.The expression rates of CD137 on T cells activated by PHA for 24,48,72 h were (10.0±2.0)%、(13.0±2.0)%、(20.0±4.0)% respectively by methods of immunohistochemistry and (8.16±1.28)%、(12.39±2.15)%、(21.60±4.30)% respectively by flow cytometry analysis.CD137 can be expressed on both CD4+ and CD8+ T cells and expression rate on CD4+ was higher than that on CD8+ T cells.Conclusion：CD137 was only expressed on activated T cell but not on resting T cells.CD137 can be expressed on both activated CD4+ and CD8+ T cells.
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Key words T cell Co-stimulatory signal/CD137 Immunohistochemistry Flow cytometry
T细胞的活化需要双信号刺激,如果T细胞仅接受第一信号刺激,而无第二信号刺激,则进入无能状态,失去免疫效能。目前公认的第二刺激信号是CD28和B7。90年代后,发现除CD28/B7外,尚存在其他共刺激信号。最近研究发现CD137和CD137配体(CD137L)为CD28/B7之外的另一对关键的共刺激信号,开始引起人们注意。目前有关CD137的研究主要来自小鼠,有关人的方面研究尚少。我们在国内率先用免疫细胞化学方法和流式细胞仪分析了CD137在T细胞及其亚群的表达特点,将为CD137的进一步研究奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料 CD137单抗购自美国PHARMINGEN公司,APAAP试剂盒购自中国军事医学科学院,PHA为Sigma公司产品。流式细胞仪为Becton Dickinson产品。
1.2 方法
1.2.1 T细胞的分离纯化 从8例正常人取静脉血,肝素抗凝,按常规用Ficoll淋巴细胞分离液,分离单个核细胞。然后经尼龙棉柱过滤法纯化T细胞。
1.2.2 T淋巴细胞的活化 将分离的T细胞用RPMI-1640培养液(含10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素)稀释成1×106个/ml。按100 μl/孔的量加入96孔培养板,实验孔每孔加50 μl PHA(终浓度100 μg/ml),对照组每孔加50 μl 1640培养液。37℃,5%CO2条件下培养,分别于24、48、72 h取出培养细胞进行免疫细胞化学和流式细胞仪检测。
, 百拇医药
1.2.3 免疫细胞化学染色(APAAP法) 从96孔板刮取培养细胞放入Eppendorf管中,8 000 r/min,离心5 min,弃上清,细胞沉淀用生理盐水洗2遍。弃上清,沉淀用100 μl小牛血清悬浮,常规滴片,丙酮固定。然后依次加入CD137单抗(1∶400)、羊抗鼠IgG(1∶100)及APAAP复合物(1∶100),最后用坚固红显色,显微镜观察。
1.2.4 流式细胞术 将培养细胞收集于Eppendorf离心管中,每份标本分两管,每管细胞数不少于5×105,一管加10 μl CD137单抗(0.5 mg/ml)和FITC-CD4+单抗,另一管加CD137单抗和FITC-CD8+单抗,室温30 min,PBS洗3次,加100 μl FITC-羊抗鼠Ig(1∶50),室温30 min,PBS洗3次,用流式细胞仪测定。
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2 结果
2.1 免疫细胞化学检测结果 未经刺激的T淋巴细胞无CD137表达,经PHA刺激24 h后 CD137已开始表达,随时间的延长,表达率逐渐增加,24、48、72 h的表达率分别为(10.0±2.0)%、(13.0±2.0)%、(20.0±4.0)%(见表1)。CD137仅表达于细胞膜表面,细胞浆、细胞核无表达。
表1 CD137在T细胞上的表达(%)
Tab.1 Expression of CD137 on T cells(%) Methods
Resting T cells
Activated T cells by PHA
, 百拇医药
24 h
48 h
72 h
Immunohistochemistry
0
10.0±2.0
13.0±2.0
20.0±4.0
Flow cytometry analysis
0.64±0.05
8.16±1.28%
12.39±2.15
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21.61±4.30
2.2 流式细胞仪的检测结果 与免疫细胞化学的结果相吻合。PHA刺激后24、48、72 h的表达率分别为(8.16±1.28)%、(12.39±2.15)%、(21.61±4.30)%(见图1)。T细胞亚群分析显示CD4+细胞和CD8+T细胞上均有CD137表达(见表2),并发现在CD4+T细胞上的表达多于CD8+T细胞。
图1 CD137在T细胞上的表达(流式细胞术)
Fig.1 Expression of CD137on T cells(flow cytometry analysis)
, 百拇医药
Note:A.resting T cell(0.64±0.05)%;B～D activated T cells by PHA;B.24 h(8.16±1.28)%;C.48 h(12.39±2.15)%;D.72 h(21.61±4.30)%
表2 CD137在CD4+和CD8+T细胞亚群的表达(%)
Tab.2 Expression of CD137 on CD4+ and CD8+ T subsets(%) PHA Stimulated time
(h)
CD4+T cell
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CD8+T cell
Un-stimulated
0.12
0.12
24
5.1±1.23
2±1.14
48
8.2±1.56
4.0±1.25
72
10.2±2.0
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5.6±1.67
3 讨论
1989年Kwon等人从活化的鼠T细胞中分离出一种新的膜表面抗原,命名为4-1BB〔1〕。此后许多学者对它及其配体(4-1BBL)的生物活性进行了研究,发现4-1BB属于肿瘤坏死因子受体超家族,其配体属于肿瘤坏死因子超家族,此二者可能是除CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号,在T细胞的活化过程中起重要作用〔2〕。后来,Schwarz H(1993)从人的活化T细胞中分离出与鼠4-1BB具有同源性的人4-1BB〔3〕,紧接着Alderson M R(1994)等又克隆出了人4-1BB配体(hu4-1BBL)并研究其生物活性,发现它与鼠的不完全相同,人4-1BB对不同状态T细胞具有增殖和凋亡双重调节作用〔4〕,引起人们极大兴趣。1996年在日本召开的国际CD命名大会上统一命名为CD137。本研究在国内率先用免疫组织化学和流式细胞仪研究了CD137在正常人外周血静止和活化淋巴细胞表面的表达情况,发现CD137仅表达于活化的T细胞表面,静止的淋巴细胞不表达,用流式细胞仪进一步分析发现CD137在CD4+和CD8+T细胞上均表达,且在CD4+T细胞上的表达高于CD8+T细胞。这一结果将为进一步研究CD137在自身免疫病、某些肿瘤细胞中的表达及T细胞亚群的改变奠定了基础。
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资金项目：本项目为山东省自然科学基金课题(批准号:431769)
作者简介：张利宁,女,38岁,副教授,主要从事T细胞共刺激信号的研究；曹英林 马春红 宋 静 赵文璞 朱长军 孙汶生 山东医科大学微生物与免疫学教研室，济南250012
通讯人地址：张利宁 济南市文化西路44号,济南250012
参考文献
1 Kwon B S, Kestler D P,Eshhar Z et al.Expression characteristics of two potential T cell mediator gene.Cell Immunol,1989;121(2):414
2 Pollok K S, Kim Y J,Zhou Z et al.Inducible T cell antigen 4-1BB.Analysis of expression and function.J Immunol,1993;150(3):771
, 百拇医药
3 Schwarz H, Tuckwell J,Lotz M et al.A receptor induced by lymphocyte activator (ILA):a new member of human nerve-growth-factor/tumor necrosis-factor receptor family.Gene,1993;134(2):295
4 Alderson M R,Smith C A,Tough T W et al.Molecular and biological characterization of human 4-1BB and its ligand.Eur J Immunol,1994;24:2219
5 Schwarz H,Blanco T J,Von kempis J et al. ILA,a member of the human nerve growth factor/tumor nerosis factor receptor family,regulates T-lymphocyte proliferation and survival.Blood,1996；87(7)：2839
收稿1998-12-30 修回1999-01-25, 百拇医药
单位：
关键词：T细胞；共刺激信号，,CD137；免疫细胞化学；流式细胞术
中国免疫学杂志991005 摘 要 目的：为了分析CD137在正常人静止状态和受PHA刺激后不同时间T淋巴细胞及其亚群上的表达特点和规律。方法：采用免疫细胞化学和流式细胞术。结果：发现未刺激的淋巴细胞上无CD137表达。经PHA刺激后(仅T细胞发生转化),24 h已有表达,以后表达率逐渐增高。免疫细胞化学法显示,24、48、72 h CD137的表达率分别为(10.0±2.0)%、(13.0±2.0)%、(20.0±4.0)%，CD137表达在细胞膜表面,细胞浆、细胞核无表达。流式细胞仪测定结果与免疫细胞化学法相吻合，PHA刺激24、48、72 h的表达率分别为(8.16±1.28)%、(12.39±2.15)%、(21.60±4.30)%。CD4+T细胞和CD8+细胞均可表达，但在CD4+T细胞上的表达率高于CD8+细胞。结论：CD137仅表达于活化T细胞表面，CD4+和CD8+细胞均可表达。静止T细胞无CD137表达。
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中国图书分类号 R392
Expression feature of CD137(human 4-1BB),a new co-stimulatory signal
on T cells and T cell subsets
ZHANG Li-Ning,CAO Ying-Lin,MA Chun-Hong et al.
Department of Microbiology and Immunology,Shandong Medical University，Jinan 250012
Abstract Objective：In order to study the expression feature of CD137 on T cells and T cell subsets.Methods：Immunohistochemistry and flow cytometry.Results：CD137 was not expressed on resting T cells.The expression rates of CD137 on T cells activated by PHA for 24,48,72 h were (10.0±2.0)%、(13.0±2.0)%、(20.0±4.0)% respectively by methods of immunohistochemistry and (8.16±1.28)%、(12.39±2.15)%、(21.60±4.30)% respectively by flow cytometry analysis.CD137 can be expressed on both CD4+ and CD8+ T cells and expression rate on CD4+ was higher than that on CD8+ T cells.Conclusion：CD137 was only expressed on activated T cell but not on resting T cells.CD137 can be expressed on both activated CD4+ and CD8+ T cells.
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Key words T cell Co-stimulatory signal/CD137 Immunohistochemistry Flow cytometry
T细胞的活化需要双信号刺激,如果T细胞仅接受第一信号刺激,而无第二信号刺激,则进入无能状态,失去免疫效能。目前公认的第二刺激信号是CD28和B7。90年代后,发现除CD28/B7外,尚存在其他共刺激信号。最近研究发现CD137和CD137配体(CD137L)为CD28/B7之外的另一对关键的共刺激信号,开始引起人们注意。目前有关CD137的研究主要来自小鼠,有关人的方面研究尚少。我们在国内率先用免疫细胞化学方法和流式细胞仪分析了CD137在T细胞及其亚群的表达特点,将为CD137的进一步研究奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料 CD137单抗购自美国PHARMINGEN公司,APAAP试剂盒购自中国军事医学科学院,PHA为Sigma公司产品。流式细胞仪为Becton Dickinson产品。
1.2 方法
1.2.1 T细胞的分离纯化 从8例正常人取静脉血,肝素抗凝,按常规用Ficoll淋巴细胞分离液,分离单个核细胞。然后经尼龙棉柱过滤法纯化T细胞。
1.2.2 T淋巴细胞的活化 将分离的T细胞用RPMI-1640培养液(含10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素)稀释成1×106个/ml。按100 μl/孔的量加入96孔培养板,实验孔每孔加50 μl PHA(终浓度100 μg/ml),对照组每孔加50 μl 1640培养液。37℃,5%CO2条件下培养,分别于24、48、72 h取出培养细胞进行免疫细胞化学和流式细胞仪检测。
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1.2.3 免疫细胞化学染色(APAAP法) 从96孔板刮取培养细胞放入Eppendorf管中,8 000 r/min,离心5 min,弃上清,细胞沉淀用生理盐水洗2遍。弃上清,沉淀用100 μl小牛血清悬浮,常规滴片,丙酮固定。然后依次加入CD137单抗(1∶400)、羊抗鼠IgG(1∶100)及APAAP复合物(1∶100),最后用坚固红显色,显微镜观察。
1.2.4 流式细胞术 将培养细胞收集于Eppendorf离心管中,每份标本分两管,每管细胞数不少于5×105,一管加10 μl CD137单抗(0.5 mg/ml)和FITC-CD4+单抗,另一管加CD137单抗和FITC-CD8+单抗,室温30 min,PBS洗3次,加100 μl FITC-羊抗鼠Ig(1∶50),室温30 min,PBS洗3次,用流式细胞仪测定。
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2 结果
2.1 免疫细胞化学检测结果 未经刺激的T淋巴细胞无CD137表达,经PHA刺激24 h后 CD137已开始表达,随时间的延长,表达率逐渐增加,24、48、72 h的表达率分别为(10.0±2.0)%、(13.0±2.0)%、(20.0±4.0)%(见表1)。CD137仅表达于细胞膜表面,细胞浆、细胞核无表达。
表1 CD137在T细胞上的表达(%)
Tab.1 Expression of CD137 on T cells(%) Methods
Resting T cells
Activated T cells by PHA
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24 h
48 h
72 h
Immunohistochemistry
0
10.0±2.0
13.0±2.0
20.0±4.0
Flow cytometry analysis
0.64±0.05
8.16±1.28%
12.39±2.15
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21.61±4.30
2.2 流式细胞仪的检测结果 与免疫细胞化学的结果相吻合。PHA刺激后24、48、72 h的表达率分别为(8.16±1.28)%、(12.39±2.15)%、(21.61±4.30)%(见图1)。T细胞亚群分析显示CD4+细胞和CD8+T细胞上均有CD137表达(见表2),并发现在CD4+T细胞上的表达多于CD8+T细胞。
图1 CD137在T细胞上的表达(流式细胞术)
Fig.1 Expression of CD137on T cells(flow cytometry analysis)
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Note:A.resting T cell(0.64±0.05)%;B～D activated T cells by PHA;B.24 h(8.16±1.28)%;C.48 h(12.39±2.15)%;D.72 h(21.61±4.30)%
表2 CD137在CD4+和CD8+T细胞亚群的表达(%)
Tab.2 Expression of CD137 on CD4+ and CD8+ T subsets(%) PHA Stimulated time
(h)
CD4+T cell
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CD8+T cell
Un-stimulated
0.12
0.12
24
5.1±1.23
2±1.14
48
8.2±1.56
4.0±1.25
72
10.2±2.0
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5.6±1.67
3 讨论
1989年Kwon等人从活化的鼠T细胞中分离出一种新的膜表面抗原,命名为4-1BB〔1〕。此后许多学者对它及其配体(4-1BBL)的生物活性进行了研究,发现4-1BB属于肿瘤坏死因子受体超家族,其配体属于肿瘤坏死因子超家族,此二者可能是除CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号,在T细胞的活化过程中起重要作用〔2〕。后来,Schwarz H(1993)从人的活化T细胞中分离出与鼠4-1BB具有同源性的人4-1BB〔3〕,紧接着Alderson M R(1994)等又克隆出了人4-1BB配体(hu4-1BBL)并研究其生物活性,发现它与鼠的不完全相同,人4-1BB对不同状态T细胞具有增殖和凋亡双重调节作用〔4〕,引起人们极大兴趣。1996年在日本召开的国际CD命名大会上统一命名为CD137。本研究在国内率先用免疫组织化学和流式细胞仪研究了CD137在正常人外周血静止和活化淋巴细胞表面的表达情况,发现CD137仅表达于活化的T细胞表面,静止的淋巴细胞不表达,用流式细胞仪进一步分析发现CD137在CD4+和CD8+T细胞上均表达,且在CD4+T细胞上的表达高于CD8+T细胞。这一结果将为进一步研究CD137在自身免疫病、某些肿瘤细胞中的表达及T细胞亚群的改变奠定了基础。
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资金项目：本项目为山东省自然科学基金课题(批准号:431769)
作者简介：张利宁,女,38岁,副教授,主要从事T细胞共刺激信号的研究；曹英林 马春红 宋 静 赵文璞 朱长军 孙汶生 山东医科大学微生物与免疫学教研室，济南250012
通讯人地址：张利宁 济南市文化西路44号,济南250012
参考文献
1 Kwon B S, Kestler D P,Eshhar Z et al.Expression characteristics of two potential T cell mediator gene.Cell Immunol,1989;121(2):414
2 Pollok K S, Kim Y J,Zhou Z et al.Inducible T cell antigen 4-1BB.Analysis of expression and function.J Immunol,1993;150(3):771
, 百拇医药
3 Schwarz H, Tuckwell J,Lotz M et al.A receptor induced by lymphocyte activator (ILA):a new member of human nerve-growth-factor/tumor necrosis-factor receptor family.Gene,1993;134(2):295
4 Alderson M R,Smith C A,Tough T W et al.Molecular and biological characterization of human 4-1BB and its ligand.Eur J Immunol,1994;24:2219
5 Schwarz H,Blanco T J,Von kempis J et al. ILA,a member of the human nerve growth factor/tumor nerosis factor receptor family,regulates T-lymphocyte proliferation and survival.Blood,1996；87(7)：2839
收稿1998-12-30 修回1999-01-25, 百拇医药