MTT比色法改进的研究①
作者：潘兴瑜 付京晶 薛欣 孙伟
单位：锦州医学院免疫与微生物学教研室，锦州 121001
关键词：
中国免疫学杂志991211 中国图书分类号 R392-33
Mosmann于1983年首创MTT比色法用于检测IL-2的生物学活性[1] 。MTT比色法操作简便，比3H-TdR掺入法便于开展，原方法测定因素复杂，虽然多家已做了一定的改进[2，3] ，尚有不足之处，使MTT比色法的应用受到多种非处理因素的影响和局限而失去应有的价值。因此，对MTT比色法进行相应的改进，以求最大限度地去除非处理因素的影响，提高MTT比色法的灵敏度和稳定性，扩大它的应用范围。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 Balb/c小鼠，由辽宁省基础研究所提供；rIL-2，日本，由钱振超教授惠赠；ConA,Sigma；MTT，Fluka;3H-TdR，中国原子能科学院。
1.2 方法
1.2.1 rIL-2靶细胞的诱导 取Balb/c小鼠脾细胞按文献[4]的方法诱导。
1.2.2 洗涤对细胞流失的影响 样品为rIL-2靶细胞0.1 ml加rIL-2 0.1 ml的24 h培养物。样品加MTT 0.01 ml，3 h后2 000 r/min离心10 min，逐次吸出上清，镜检有无细胞流失。
1.2.3 Formazan最大吸收峰的测定 样品加MTT 3 h后洗涤3次，干燥后加正丁醇用岛津U V-365分光光度计测其最大吸收峰。
, 百拇医药 1.2.4 改进的MTT比色法与 3H-TdR掺入法的对比 样品分别加MTT和 3H-TdR处理后分别测OD值和cpm，计算增殖指数。
2 结果
2.1 洗涤对细胞流失的影响 洗涤后样品去上清≤0.16 ml无细胞流失。
2.2 Formazan最大吸收峰的测定 Formazan最大吸收峰高浓度为562～582 nm，低浓度为580～584 nm。
2.3 改进的MTT比色法与 3H-TdR掺入法的对比 两者具有非常显著的相关性(r＝0.997,P<0.01)。
3 讨论
Formazan在细胞内形成结晶，或其针状结晶穿过细胞膜外，细胞不流失，Formazan亦不流失。通过洗涤，除细胞外非处理因素几乎全部去除，扩大了应用范围，也不受孔间颜色差异的影响，适合于对中草药的研究。干燥是使Formazan充分溶解，既提高灵敏度，又方便保存。采用560～590 nm之间任何波长对检测样品的OD值几乎没有差异。用正丁醇代替异丙醇，可减慢蒸发速度，减少操作误差。改进的MTT比色法优于其他改进的MTT比色法，在应用范围和灵敏度上等同于 3H-TdR掺入法，完全可以代替3 H-TdR掺入法[5] 检测细胞增殖，具有重要推广价值。
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资金项目：辽宁省教委资助
作者简介：潘兴瑜，男，47岁，硕士，副教授，主要从事中药免疫和肿瘤免疫等研究
参考文献
1 Mosmann T.Rapid colorimetic assay for celluar growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assay.J Immunol Methods,1983;65:55
2 Tada H, Shiho O, Kuroshima K et al.An improved colorimetric assay for interleukin 2.J Immunol Methods,1986;93:157
3 Denizot F,Lang R.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.J Immunol Methods,1986;89:271
4 丁桂凤,席宏丽,邓玉兰et al.用活化的小鼠脾细胞测定IL-2. 上海免疫学杂志，1988;8(1):64
5 杨贵贞主编. 免疫生物工程纲要与技术. 长春：吉林科学技术出版社，1991:47-48
收稿1999-02-05 修回1999-05-21
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单位：锦州医学院免疫与微生物学教研室，锦州 121001
关键词：
中国免疫学杂志991211 中国图书分类号 R392-33
Mosmann于1983年首创MTT比色法用于检测IL-2的生物学活性[1] 。MTT比色法操作简便，比3H-TdR掺入法便于开展，原方法测定因素复杂，虽然多家已做了一定的改进[2，3] ，尚有不足之处，使MTT比色法的应用受到多种非处理因素的影响和局限而失去应有的价值。因此，对MTT比色法进行相应的改进，以求最大限度地去除非处理因素的影响，提高MTT比色法的灵敏度和稳定性，扩大它的应用范围。
1 材料与方法
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1.1 材料 Balb/c小鼠，由辽宁省基础研究所提供；rIL-2，日本，由钱振超教授惠赠；ConA,Sigma；MTT，Fluka;3H-TdR，中国原子能科学院。
1.2 方法
1.2.1 rIL-2靶细胞的诱导 取Balb/c小鼠脾细胞按文献[4]的方法诱导。
1.2.2 洗涤对细胞流失的影响 样品为rIL-2靶细胞0.1 ml加rIL-2 0.1 ml的24 h培养物。样品加MTT 0.01 ml，3 h后2 000 r/min离心10 min，逐次吸出上清，镜检有无细胞流失。
1.2.3 Formazan最大吸收峰的测定 样品加MTT 3 h后洗涤3次，干燥后加正丁醇用岛津U V-365分光光度计测其最大吸收峰。
, 百拇医药 1.2.4 改进的MTT比色法与 3H-TdR掺入法的对比 样品分别加MTT和 3H-TdR处理后分别测OD值和cpm，计算增殖指数。
2 结果
2.1 洗涤对细胞流失的影响 洗涤后样品去上清≤0.16 ml无细胞流失。
2.2 Formazan最大吸收峰的测定 Formazan最大吸收峰高浓度为562～582 nm，低浓度为580～584 nm。
2.3 改进的MTT比色法与 3H-TdR掺入法的对比 两者具有非常显著的相关性(r＝0.997,P<0.01)。
3 讨论
Formazan在细胞内形成结晶，或其针状结晶穿过细胞膜外，细胞不流失，Formazan亦不流失。通过洗涤，除细胞外非处理因素几乎全部去除，扩大了应用范围，也不受孔间颜色差异的影响，适合于对中草药的研究。干燥是使Formazan充分溶解，既提高灵敏度，又方便保存。采用560～590 nm之间任何波长对检测样品的OD值几乎没有差异。用正丁醇代替异丙醇，可减慢蒸发速度，减少操作误差。改进的MTT比色法优于其他改进的MTT比色法，在应用范围和灵敏度上等同于 3H-TdR掺入法，完全可以代替3 H-TdR掺入法[5] 检测细胞增殖，具有重要推广价值。
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资金项目：辽宁省教委资助
作者简介：潘兴瑜，男，47岁，硕士，副教授，主要从事中药免疫和肿瘤免疫等研究
参考文献
1 Mosmann T.Rapid colorimetic assay for celluar growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assay.J Immunol Methods,1983;65:55
2 Tada H, Shiho O, Kuroshima K et al.An improved colorimetric assay for interleukin 2.J Immunol Methods,1986;93:157
3 Denizot F,Lang R.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.J Immunol Methods,1986;89:271
4 丁桂凤,席宏丽,邓玉兰et al.用活化的小鼠脾细胞测定IL-2. 上海免疫学杂志，1988;8(1):64
5 杨贵贞主编. 免疫生物工程纲要与技术. 长春：吉林科学技术出版社，1991:47-48
收稿1999-02-05 修回1999-05-21
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