RhD基因外显子多态性观察
作者：兰炯采 陈强 孙倩 武大林 丁红 张志梅 彭道波
单位：兰炯采(第一军医大学南方医院，广州510515)；陈强(中国医学科学院输血研究所，成都610041)；孙倩(中国医学科学院输血研究所，成都610041)；武大林(第一军医大学南方医院，广州510515)；丁红(第一军医大学南方医院，广州510515)
关键词：RhD；外显子；多态性
中国免疫学杂志000520 摘 要 目的：观察中国人RhD基因。方法： 采用P CR-SSP技术，检测32例血清学试验RhD阳性，44例RhD阴性者的D基因外显子。结 果：RhD阳性者D基因外显子无缺失，RhD阴性者D基因外显子有完全缺失(61.4%)、 部 分缺失(18.2%)与无缺失(20.4%)3种类型。结论：中国人RhD基因外显子 具有多态性。
中国图书分类号 R457.1+1
, 百拇医药
Observation on polymorphisms of RhD gene exon
LAN Jiong-Cai CHEN Qiang SUN Qian
(Nanfang Hosp ital,First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Abstract Objective：To observe RhD gene in Chinese.Methods：RhD gene among 32 cases of serological RhD positi ve and 44 cases serological RhD negative were tested by PCR-SSP.Results：Exons of RhD positive subject were intact.Exons of RhD negative subject showed total deletion(61.4%),partly deletion(18.2%) and in tact(20.1%).Conclusion：RhD gene exons are morphisms in Chinese.
, 百拇医药
Key words RhD Exon Polymorphisms
Rh血型在红细胞血型系统中最为复杂，其临床意义仅次于ABO血型。Rh血型系统的 抗原 已发现40多个，但有临床意义的主要是D、C、c、E、e，其中D最重要。RhD阴性个体接受D阳 性血液后可能产生抗-D，导致溶血性输血反应甚至有致死的报告。RhD阴性妇女妊娠D阳性 胎 儿，可能发生新生儿溶血病，影响优生优育。目前RhD检测多采用血清学方法，虽快速简便 ，但有局限性。采用基因检测技术，可以分析构成RhD基因的外显子。现将我们对RhD基因外 显子多态性的观察报道如下。
1 材料与方法
1.1 样本为32例RhD阳性样本，44例RhD阴性样本，5例Du型样本均经血 清学技术2次检定 ，方法按《中国输血技术操作规程》[1] 。44例RhD阴性样本中，检测CE表型者42 例，其中ccee型18例，CCee型6例，Ccee型17例，CcEE型1例。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 提取DNA按快速盐析法操作[2]。
1.2.2 RhD基因外显子检测试剂盒由美国G&T公司提供(马利兰州政府批号6 43259)，按说明操作，可检测D基因2、3、4、5、6、7、9、10外显子，见表1。
表1 RhD基因外显子检测试剂盒
Tab.1 RhD gene exon testing kit Mix mark
PCR products
fragment length
Testing exon
, 百拇医药
MixRh-D2
142 bp
RhD exon 2
MixRh-D3
112 bp
RhD exon 3
MixRh-D4
105 bp
RhD exon 4
MixRh-D/CE
D:478 bp
CE:1 126 bp
, 百拇医药
RhD exon 4,5
RhCE exon 4,5
MixRh-D5
60 bp
RhD exon 5
MixRh-D6
130 bp
RhD exon 6
MixRh-D7
98 bp
RhD exon 7
MixRh-D9
, http://www.100md.com
53 bp
RhD exon 9
MixRh-D10
186 bp
RhD exon 10
2 结果
2.1 RhD阳性标准品的D基因2、3、4、5、6、7、9、10外显子管PCR扩增出 相应bp产物；D阴性标准品PCR扩增上述外显子未获相应产物。
2.2 32例RhD阳性样本PCR均扩增出2、3、4、5、6、7、9、10外显子管相应 bp产物。
2.3 44例RhD阴性样本PCR扩增的RhD外显子分3种情况：完全缺失者27例， 其中表型带C抗 原者11例，不带C者16例；部分缺失者8例，其中6例缺失外显子3-9，1例缺失5-9，1例仅 缺失7；无缺失者9例，表型均带C抗原。
, 百拇医药
2.4 5例Du型样本经PCR扩增，2例D基因缺失外显子3-6，3例无缺失。
3 讨论
Rh血型已发现50年。既往认为Rh由C、D、E 3个基因位点连锁构成。1990年Rh基因 被克 隆，采用分子生物学技术研究证实Rh系D和CE 2个结构基因组成，其cDNA序列已测定[3 ]。 D和CE基因都含10个外显子，Rh基因变异主要发生在1、2、5外显子[4]。我们采用 美国G&T公 司提供的RhD基因外显子检测试剂盒，以PCR-序列特异性引物(SSP)方法分析本组样本RhD 基因外显子，发现RhD阳性者D基因外显子无缺失，而阴性者则呈多态性，有完全缺失(61.4 %)、部分缺失(18.2%)与无缺失(20.4%)3种情况，后2种的表型都带C抗原。国外近年 对RhD阴性者D基因外显子多态性研究很多，发现高加索人外显子全缺失[4，5]，黑 人、澳大 利亚人等为部分缺失[6，7]，而东方人却有完全缺失、部分缺失和不缺失3种情况 ，后两者与表型带 C抗原有关[8，9]。本组样本部分缺失和不缺失者比例略高于日本和台湾的报道。 PCR-SSP检测RhD 基因外显子在临床应用上有其局限性，D基因外显子无缺失者(尤其 表 型带C抗原)RhD 却可能是阴性，此时便失去了判定RhD表型的价值。必须指出的是，对D基 因外显子研究的深层意义不仅仅在于确定RhD表型，还在于探讨其多态性的遗传意义或生物 学意义，例如在民族关系研究中的价值；RhD阴性者接受D阳性血液后发生同种免疫仅占50 %～75%，不产生抗体者是否与外显子的结构有关[10]；外显子部分缺失者的遗传规律；外显 子完整却不表达D抗原的机理；Du型与外显子有无内在联系；RhD阳性者外显子是否肯定无 缺 失等方面。RhD基因结构的许多谜还未揭示，本研究初步观察RhD基因外显子多态性意在抛砖 引玉，以期与同行对我国D基因多态性的遗传背景和生物学意义深入研究。
, 百拇医药
本课题受1999年度广东省医学科研基金资助〔粤卫(1999)116号〕
作者简介：兰炯采，研究员，博士生导师，主任，主要研究血液 免疫学
张志梅(第一军医大学南方医院，广州510515)
彭道波(第一军医大学南方医院，广州510515)
4 参考文献
1，中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程.天津:天津科学技术出 版社,1998:64
2，兰炯采,张祖文,张玉明 et al.HLA-DQB1 PCR-SSP基因分型技术.实 验血液学杂志,1996;4(4):220
3，Mouro I,Colin Y.Molecular genetic basis of the human Rhesus blood g roup system.Nature Genetics,1993;5:62
, http://www.100md.com
4，Hyland C A,Wolter L C,Saul A.Identification and analysis of Rh genes:appli cation of PCR and RFLP typing tests.Transfusion Medicine Reviews,1995;9:289
5，Colin Y,Cherif-Zahar B,Le Van Kim C et al.Genetic basis of the RhD-po sitive an d RhD-negative blood group polymorphism as determined by southem analysis.Blood ,1991;78:2747
6，Mouro I,Colin Y,Cherif-Zahar B et al.Molecular genetic basis of the hu man Rhesus blood group system.Nat Genet,1993;5:62
, 百拇医药
7，Cartton J P.Defining the Rh blood group antigens:biochemistry and molecula r genetics.Blood Rev,1994;8:199
8，Okuda H,Kawano M,Iwamoto Set al.The RHD gene is highly detectable in R hD-negative Japanese donors.J Clin Invest,1997;100:373
9，Sun C,Chou C,Lai N et al.RHD gene polymorphisms among RhD-negative Chi nese in Taiwan.Vox Sang,1998;71:52
10，Wangner F F,Gassner C,Muller T H et al.Molecular basis of weak D phenotypes.Blood,1999;93:385
[收稿1999-06-13 修回1999-09-29], http://www.100md.com
单位：兰炯采(第一军医大学南方医院，广州510515)；陈强(中国医学科学院输血研究所，成都610041)；孙倩(中国医学科学院输血研究所，成都610041)；武大林(第一军医大学南方医院，广州510515)；丁红(第一军医大学南方医院，广州510515)
关键词：RhD；外显子；多态性
中国免疫学杂志000520 摘 要 目的：观察中国人RhD基因。方法： 采用P CR-SSP技术，检测32例血清学试验RhD阳性，44例RhD阴性者的D基因外显子。结 果：RhD阳性者D基因外显子无缺失，RhD阴性者D基因外显子有完全缺失(61.4%)、 部 分缺失(18.2%)与无缺失(20.4%)3种类型。结论：中国人RhD基因外显子 具有多态性。
中国图书分类号 R457.1+1
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Observation on polymorphisms of RhD gene exon
LAN Jiong-Cai CHEN Qiang SUN Qian
(Nanfang Hosp ital,First Military Medical University,Guangzhou 510515)
Abstract Objective：To observe RhD gene in Chinese.Methods：RhD gene among 32 cases of serological RhD positi ve and 44 cases serological RhD negative were tested by PCR-SSP.Results：Exons of RhD positive subject were intact.Exons of RhD negative subject showed total deletion(61.4%),partly deletion(18.2%) and in tact(20.1%).Conclusion：RhD gene exons are morphisms in Chinese.
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Key words RhD Exon Polymorphisms
Rh血型在红细胞血型系统中最为复杂，其临床意义仅次于ABO血型。Rh血型系统的 抗原 已发现40多个，但有临床意义的主要是D、C、c、E、e，其中D最重要。RhD阴性个体接受D阳 性血液后可能产生抗-D，导致溶血性输血反应甚至有致死的报告。RhD阴性妇女妊娠D阳性 胎 儿，可能发生新生儿溶血病，影响优生优育。目前RhD检测多采用血清学方法，虽快速简便 ，但有局限性。采用基因检测技术，可以分析构成RhD基因的外显子。现将我们对RhD基因外 显子多态性的观察报道如下。
1 材料与方法
1.1 样本为32例RhD阳性样本，44例RhD阴性样本，5例Du型样本均经血 清学技术2次检定 ，方法按《中国输血技术操作规程》[1] 。44例RhD阴性样本中，检测CE表型者42 例，其中ccee型18例，CCee型6例，Ccee型17例，CcEE型1例。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 提取DNA按快速盐析法操作[2]。
1.2.2 RhD基因外显子检测试剂盒由美国G&T公司提供(马利兰州政府批号6 43259)，按说明操作，可检测D基因2、3、4、5、6、7、9、10外显子，见表1。
表1 RhD基因外显子检测试剂盒
Tab.1 RhD gene exon testing kit Mix mark
PCR products
fragment length
Testing exon
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MixRh-D2
142 bp
RhD exon 2
MixRh-D3
112 bp
RhD exon 3
MixRh-D4
105 bp
RhD exon 4
MixRh-D/CE
D:478 bp
CE:1 126 bp
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RhD exon 4,5
RhCE exon 4,5
MixRh-D5
60 bp
RhD exon 5
MixRh-D6
130 bp
RhD exon 6
MixRh-D7
98 bp
RhD exon 7
MixRh-D9
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53 bp
RhD exon 9
MixRh-D10
186 bp
RhD exon 10
2 结果
2.1 RhD阳性标准品的D基因2、3、4、5、6、7、9、10外显子管PCR扩增出 相应bp产物；D阴性标准品PCR扩增上述外显子未获相应产物。
2.2 32例RhD阳性样本PCR均扩增出2、3、4、5、6、7、9、10外显子管相应 bp产物。
2.3 44例RhD阴性样本PCR扩增的RhD外显子分3种情况：完全缺失者27例， 其中表型带C抗 原者11例，不带C者16例；部分缺失者8例，其中6例缺失外显子3-9，1例缺失5-9，1例仅 缺失7；无缺失者9例，表型均带C抗原。
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2.4 5例Du型样本经PCR扩增，2例D基因缺失外显子3-6，3例无缺失。
3 讨论
Rh血型已发现50年。既往认为Rh由C、D、E 3个基因位点连锁构成。1990年Rh基因 被克 隆，采用分子生物学技术研究证实Rh系D和CE 2个结构基因组成，其cDNA序列已测定[3 ]。 D和CE基因都含10个外显子，Rh基因变异主要发生在1、2、5外显子[4]。我们采用 美国G&T公 司提供的RhD基因外显子检测试剂盒，以PCR-序列特异性引物(SSP)方法分析本组样本RhD 基因外显子，发现RhD阳性者D基因外显子无缺失，而阴性者则呈多态性，有完全缺失(61.4 %)、部分缺失(18.2%)与无缺失(20.4%)3种情况，后2种的表型都带C抗原。国外近年 对RhD阴性者D基因外显子多态性研究很多，发现高加索人外显子全缺失[4，5]，黑 人、澳大 利亚人等为部分缺失[6，7]，而东方人却有完全缺失、部分缺失和不缺失3种情况 ，后两者与表型带 C抗原有关[8，9]。本组样本部分缺失和不缺失者比例略高于日本和台湾的报道。 PCR-SSP检测RhD 基因外显子在临床应用上有其局限性，D基因外显子无缺失者(尤其 表 型带C抗原)RhD 却可能是阴性，此时便失去了判定RhD表型的价值。必须指出的是，对D基 因外显子研究的深层意义不仅仅在于确定RhD表型，还在于探讨其多态性的遗传意义或生物 学意义，例如在民族关系研究中的价值；RhD阴性者接受D阳性血液后发生同种免疫仅占50 %～75%，不产生抗体者是否与外显子的结构有关[10]；外显子部分缺失者的遗传规律；外显 子完整却不表达D抗原的机理；Du型与外显子有无内在联系；RhD阳性者外显子是否肯定无 缺 失等方面。RhD基因结构的许多谜还未揭示，本研究初步观察RhD基因外显子多态性意在抛砖 引玉，以期与同行对我国D基因多态性的遗传背景和生物学意义深入研究。
, 百拇医药
本课题受1999年度广东省医学科研基金资助〔粤卫(1999)116号〕
作者简介：兰炯采，研究员，博士生导师，主任，主要研究血液 免疫学
张志梅(第一军医大学南方医院，广州510515)
彭道波(第一军医大学南方医院，广州510515)
4 参考文献
1，中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程.天津:天津科学技术出 版社,1998:64
2，兰炯采,张祖文,张玉明 et al.HLA-DQB1 PCR-SSP基因分型技术.实 验血液学杂志,1996;4(4):220
3，Mouro I,Colin Y.Molecular genetic basis of the human Rhesus blood g roup system.Nature Genetics,1993;5:62
, http://www.100md.com
4，Hyland C A,Wolter L C,Saul A.Identification and analysis of Rh genes:appli cation of PCR and RFLP typing tests.Transfusion Medicine Reviews,1995;9:289
5，Colin Y,Cherif-Zahar B,Le Van Kim C et al.Genetic basis of the RhD-po sitive an d RhD-negative blood group polymorphism as determined by southem analysis.Blood ,1991;78:2747
6，Mouro I,Colin Y,Cherif-Zahar B et al.Molecular genetic basis of the hu man Rhesus blood group system.Nat Genet,1993;5:62
, 百拇医药
7，Cartton J P.Defining the Rh blood group antigens:biochemistry and molecula r genetics.Blood Rev,1994;8:199
8，Okuda H,Kawano M,Iwamoto Set al.The RHD gene is highly detectable in R hD-negative Japanese donors.J Clin Invest,1997;100:373
9，Sun C,Chou C,Lai N et al.RHD gene polymorphisms among RhD-negative Chi nese in Taiwan.Vox Sang,1998;71:52
10，Wangner F F,Gassner C,Muller T H et al.Molecular basis of weak D phenotypes.Blood,1999;93:385
[收稿1999-06-13 修回1999-09-29], http://www.100md.com