抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达
作者：陈晓穗 朱迎春 王欲晓 刘晓琳 周丽君 王琰
单位：陈晓穗(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；朱迎春(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；王欲晓(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；刘晓琳(解放军；周丽君(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；王琰(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)
关键词：噬菌体抗体；乙肝表面抗原；人抗体；真核表达
中国免疫学杂志000506 摘 要 目的：尝试将1株来源于人源性噬菌体抗体库的抗HBsAg人Fa b，转换成完整的抗 HBsAg人IgG。方法：采用重叠PCR方法，在抗HBsAg人Fab的Vκ和VH基因 的5’端接上人工合成 的人κ链的前导序列，构建表达完整IgG1的真核表达载体，转染CHO(DHFR-)细胞，用ELI S A、RT-PCR和免疫印迹检测抗HBsAg人IgG的表达。通过DHFR/MTX体系及金属离子诱导提高Ig 表达。结果：获得表达量在每24 h 1 μg/106细胞的稳定表 达抗HBsAg人IgG的转染细胞系 。并证实所表达IgG具有良好特异性及完整Fc段，其亲和力约为2.1×109 M-1。又 通 过DHFR/MTX扩增系统的作用及金属离子锌和镉对小鼠金属硫蛋白启动子的激活作用，使IgG 的 表达量提高了约20倍。结论：通过拼接人κ链的前导序列在真核表达 系统成功地将抗HBsAg人Fab转换成完整的HBsAg人IgG1，为其进一步应用打下了基础。
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中国图书分类号 R392-11
Construction and eukaryotic expression of anti -HBsAg human IgG
CHEN Xiao-Sui ZHU Ying-Chun WANG Yu-Xiao
(Navy General Hospital, Beijing100037)
Abstract Objective：To convert anti-HBsAg human F ab derived from phage antibody l ibrary to whole human IgG molecules expressed by eukaryotic cells.Met hods：A syn thesized human Vκ leader sequence was spliced to anti-HBsAg VH and Vκ by over lap PCR.Eukaryotic expression vectors were constructed and transfected into CHO(DHF R)cells.The expressed IgG was analyzed by ELISA,RT-PCR and Western blot. DH F R/MTX system and metal ion induction were used to ampify IgG production.Results：Stable transfectant were obtained after selection and subcloning among which th ree produced human IgG up to 1.0 μg/106/24 h.The expressed human IgG was pr ov ed to bind to HBsAg specifically, contain intact Fc portion and possess an assoc iation constant of 2.1×109 M-1by ELISA, RT-PCR and Weastern bolt an alysi s. The expression level could be increased up to 20 times by DHFR/MTX amplificat ion system and metal ion Zn2+and Cd2+induction. Conclution：These res ults proved the successful conversion of anti-HBsAg human Fab fragments to whol e hIgG molecules with good specificity and affinity.
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Key words Phage antibody HBsAg Human antibody Eukaryot ic expression
乙型病毒性肝炎是一种发病率高且危害性大的疾病，抗乙肝病毒表面抗原(H BsAg)的人源 性 抗体在临床上有防治乙肝的应用前景，如用于预防新生儿的乙肝病毒的垂直传播和制备治 疗性乙肝疫苗[1，2]。但人单克隆抗体的制备一直较为困难，噬菌体抗体库技术的 出现使多年来人源性抗体制备的难题得到了解决。通过这条新途径，各种人源性抗体不断出 现，已显示出其作为体内诊疗制剂应用与发展的诱人前景。我们在以前的工作中曾用噬菌体 抗体库技术从接种过乙肝疫苗的个体克隆到两株不同的抗HBsAg人Fab段基因[3，4] 。从抗体库中获得的抗体可变区基因可在大肠杆菌表达的小分子抗体，在某些情况下，尤其 用于体内治疗，需要Fc段的生物学效应功能，因此需制备完整的抗体分子，本研究试图将其中一株抗HBsAg Fab转换成真核表达的完整的人IgG1，并通过扩增的方法提高人IgG在CHO细 胞中的表达量。为其进一步应用打下基础。现将结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 质粒和细胞株 抗HBsAg人Fab基因的载体质粒p3HB2-1由本室构建[4]，大 肠杆菌菌株XL1-Blue由本室保存。可同时表达人轻、重链的真核表达载体(含DHFR基因)pDH L 由中科院微生物所阎锡蕴教授惠赠。人κ链前导序列的载体质粒pUCL由本室构建。CHO(DHFR -)细胞系由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠。
1.2 寡核苷酸引物 前导序列的设计与合成，用于扩增VH和Vκ以及将前 导序列与VH、Vκ拼接的引物LEK、HK3、LEH、HG3、SIG、PDVK3及PDVH3，见文献[5]。
1.3 真核表达载体的构建 分别用LEK+HK3和LEH+HG3从原核表达载体上扩 增与前导序列3 ’端互补的κ链和Fd段，再通过重叠PCR，以所获κ段或Fd段与含前导序列的质粒pUCL互为 引 物和模板PCR扩增7圈，补加前导序列5’端引物SIG和Vκ3’端引物PDVK3或VH3’端引物PDVH 3，继续扩增30圈，获得400 bp左右的带前导序列的Vκ和VH基因。经琼脂糖电泳分离、纯化 、电洗脱回收后分别将Vκ和VH重组到真核表达体pDHL的相应部位。得表达载体pDHLHB2。
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1.4 CHO细胞的转染和克隆化培养 取表达载体DNA 0.4 μg，加到含有4 μ1Plus Reagent 的25 μ1无血清IMDM培养基中，室温置15 min；另取LipofectimAMINE Reagent 1 μ1加入2 5 μ1无血清IMDM中。以上两种液体混合后室温置15 min，取混合液逐滴加入1×105CHO 细胞 /200 μ1无血清IMDM培养基中。37C培养3 h后，补加含10%小牛血清的非选择培养液至 1 m1。次日吸出细胞上清，换入1 m1非选择性培养基，48 h后取上清检测IgG的瞬时表达。 同 时用有限稀释 法在96孔板上进行转染细胞的克隆化培养，加入选择性培养基(不含次黄嘌呤 和胸腺嘧啶的IMDM培养液)。10 d后开始检测单克隆，挑出阳性孔细胞继续进行亚克隆化培 养，直至所有亚克隆细胞100%为阳性克隆，稳定表达IgG的单克隆细胞。
1.5 氨甲喋呤(MTX)对IgG表达的扩增 挑选表达抗HBsAg人IgG的单克隆 转染细胞系，在 选择培养液中加入10-7mol/L MTX，培养细胞2 w后做亚克隆培养，挑选出表达量提 高的 单克隆细胞，继续用MTX加压，浓度至10-6 mol/L，2 w后同上处理。再将MTX增加到 10 -5 mol/L。检测加压后生长的亚克隆细胞培养上清中的人IgG表达量和与抗原的结合活 性。
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1.6 金属离子锌和镉对MTI启动子的激活 在转染细胞的培养液中加入 不同浓 度硫酸锌(0.78～200 μm)和硫酸镉(0.007～2 μm)，1 w后，检测细胞培养上清中 IgG的表达。
1.7 ELISA
1.7.1 IgG表达量的测定 用羊抗人IgG Fab包被ELISA板。1% BSA-PBS封闭后 ，加入细胞培养上清和不同浓度的标准人IgG，37C 1 h，洗3次后，加入HRP-羊抗人I gG 37C 1 h，洗3次后，加入OPD底物液显色 ，测A490值。
1.7.2 IgG与抗原结合活性的测定用重组HBs Ag 0.9 μg/ml包被ELISA 板 (同时用多种抗原液包被作对照)，其余步骤同上，测定细胞上清的抗原特异性结合活性。
1.8 RT-PCR 用Trizol按产品说明书从1×107转染细胞中提取总RNA 。逆转录后PCR扩 增IgG的各片段，以证实转染细胞中存在人IgG的轻链和重链mRNA。
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1.9 免疫印迹试验 取抗 HBsAg人IgG和标准人IgG进行12%的SDS -PAGE电泳，电转移至纤维膜上，5%脱脂奶粉-PBS 4C封闭后，加入HRP-羊抗人IgG(γ 链)和HRP-羊抗人Fab(κ链)，孵育2 h，洗涤后，加入DAB液显色。
1.10 亲和力测定 采用非竞争性酶免疫法，抗HBsAg IgG从8 mmol/L浓 度倍比稀释后加样[6]。亲和力计算公式：K＝n-1/2(n[AB’]-[AB ])。
2 结果
2.1 完整人IgG表达载体的构建 通过重叠PCR拼接法将人工合成的一个人 κ链的前导序列 和抗HBsAg的Vκ和VH拼接在一起，并重组装到pDHL中得到表达载体pDHLHB2，如图1所示，PM T I为小鼠金属硫蛋白I启动子，Cκ为轻链恒定区基因，CH1、CH2、CH3为人IgG1重链恒 定区基因，DHFR为二氢叶酸还原基因，XbaI和BamHI之间为轻链可变区基因，XhoI和HindIII 之间为重链可变区基因。
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图1 表达载体pDHLHB2示意图
Fig.1 Expression vector pDHLHB2
图2 人IgG mRNA的RT-PCR检测
Fig.2 RT-PCR ampliqication of the human IgG mRNA
Note： M1.γDNA/EcoR 91I;M2.PBR 322 DNA/BstNI
图3 表达的人IgG的免疫印迹检测
Fig.3 Western Blot of the expressed human IgG
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Note:1.expressed IgG；2.normal human IgG
图4 MTX对转染细胞IgG表达的扩增作用
Fig.4 Increased expression of IgG by MTX
图5 金属离子锌和镉对转染细胞IgG表达的影响
Fig.5 Effect of Zn2+and Cd2+on the expression of the IgG
2.2 CHO细胞的转染及IgG的瞬时表达 将表达质粒以脂质体介导法转染到 CHO(DHFR-) 细胞中，转染60 h后取细胞培养上清，测定人IgG的瞬时表达量，约为160～300 ng/ml 。测定其与HBsAg及其它不同抗原的结合活性，结果显示转染细胞表达的IgG只与HBsAg有特 异结合反应，与其他抗原无交叉反应。
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2.3 转染细胞的克隆化培养筛选及稳定表达 用有限稀释法克隆化培养和 选择稳定转染的 细胞克隆，初次筛选出35个阳性克隆，经ELISA测定，其中有3个克隆的IgG表达量达每24 h 0.6～1.0 μg/106细胞(图2)，ELISA检测其抗原特异性结合良好。
2.4 人IgG mRNA的检测 为进一步核实转染细胞中完整IgG的表达，从转 染的CHO细胞中提 取总RNA，用RT-PCR扩增出IgG轻、重链的各片段。琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2可见到约70 0 bp的κ链(1道)，约1 400 bp的完整H链(2道)，约1 000 bp的CH1-CH3段(3道)以及约700 ～ 800 bp的Fd段和Fc段(4道和5道)，由于从扩增带的长度可推断出表达载体上轻重链基因所含 的内 含子序列已被剪切，表明转染细胞中存在IgG κ链和完整H链的mRNA。
2.5 免疫印迹试验 为进一步核实IgG蛋白的表达，进行Western Blot。 图3中第1道为转 染细胞表达的人IgG的轻、重链，第2道为正常人IgG的轻、重链。结果证实表IgG蛋白的表达。
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2.6 MTX对转染细胞IgG表达量的扩增 为增加抗HBsAg人IgG的表达，将表 达量高的稳定转 染细胞系用MTX持续加压处理近2个月期间MTX浓度逐步从10-7增加到10 -5 mol/L。取不同MTX浓度处理的转染细胞的亚克隆培养上清进行检测，结果表明，经MTX处理后，细 胞分泌抗体的抗原结合活性不受影响，而IgG的表达量随着MTX浓度增加而逐步提高，从加压 前的每24 h 0.6～1.0 μg/106细胞，增至每24 h 6～10 μg/106细胞，见图4 。
2.7 金属离子锌和镉对IgG表达的诱导 pDHLHB2载体中Ig基因是在小鼠 金属硫蛋白I(MTI) 启动子的驱动下进行表达，该启动子可被金属离子锌和镉所诱导，在培养液中加入不同浓度 的硫酸锌和硫酸镉，观察其对Ig表达的诱导效果。显示硫酸锌/硫酸镉的浓度在(6.25 μmol/L)/(0.062 5 μmol/L)时，转染细胞IgG表达量较对照孔细胞增加最为明显，可 使表达量增加1～2倍， 细胞状态良好。超过硫酸锌(100 μmol/L)/硫酸镉(0.1 μmol/L)浓度时细胞生长受到明显 抑制，导致分泌量急剧下降(图5)。
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2.8 抗HBsAgIgG的亲和力测定 采用Beatty等报道的非竞争性酶免疫法 测定 了CHO细胞表达的完整人IgG的亲和力[6] 。计算公式按文中报道的方法。测定结果经计算，抗HB sAg IgG的亲和力约为2.1×109 M-1(图略)。
3 讨论
大肠杆菌无法表达具有正常功能的完整抗体分子。因此，为了把来源于噬菌体抗体库的 人源 性抗体片段转换成完整的人抗体，必须换用真核细胞的表达体系。迄今，这类报道不多。这 里需要解决的主要问题，包括构建适当的表达载体和选择合适的表达手段以提高产量。
在构建完整抗体的真核表达载体时，载体除必须具备一般的元件以及Ig的恒定区基因外，主 要还需选择合适的前导序列。在构建噬菌体抗体库时，从第一骨架区扩增可变区基因，未包 括前导序列。在大肠杆菌是通过细菌来源的前导序列完成抗体片段的分泌型表达，不适用 于真核细胞。抗体的前导序列变化较大，不同的抗体配以何种前导序列才能保证有效的分泌 表达及前导肽酶对前导肽的切除，尚待积累成功的经验。Bender等将一个噬菌体人Fab转换 成完整的人Ig，是根据原Fab的V区亚群选择了来源于同一亚群的同源性最强的 前导序列，但这种方法需根据每一个可变区基因设计前导序列，不具通用性[7]。P ersic等构建了一 套完整人抗体的通用表达载体，采用了小鼠VH前导序列，他们试用了一个噬菌体抗体的人源 性ScFv和一个鼠源性杂交瘤抗体的V区基因的转换，均获成功[8]。我们选择了一个 人κ链前导序列进行原核到真核表达的转换，将一株来源于噬菌体抗体库的抗HBsAg的人Fab 转 换也获成功[5]，提示尽管Ig前导序列有较高的多样性，其功能仍具有较大的通用 性，有可能用一个前导序列表达多种不同的可变区基因。
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为进一步证实完整抗体在CHO细胞中表达，采用Western Blot检测到转染细胞上清中的IgG蛋 白分子的轻、重链；又从转染细胞中经RT-PCR扩增出人IgG轻、重链的各个片段，表明所表 达的抗体分子具有完整的Fc段，但对其的生物学效应功能尚需进一步的试验证实。
CHO细胞的DHFR缺陷型变异株在转染表达外源基因时，可通过DHFR/MTX扩增系统提高表达量 。在含DHFR抑制剂MTX的培养液中选择培养，MTX的加压作用使DHFR及其两侧基因序列扩增， 抗 体基因也得以扩增。本研究通过MTX加压作用，使CHO细胞表达IgG的水平从每24 h 1 μg/1 06细胞提高到每24 h 10 μg/106细胞。由于所采用的真核表达载体中的小鼠金属硫蛋 白启 动子，可被金属离子锌、镉等诱导，增加基因的转录水平[9]，我们尝试在细胞培 养液中适量添加锌(6.25～12.5 μmol/L)和镉(1.062 5～0.125 μmol/L)可在MTX扩增的基 础上再加倍提高转染细胞IgG的表达量，同时保持细胞正常的生长繁殖状态。
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本研究获得了稳定表达抗HBsAg IgG1的CHO细胞株，此抗体具有良好的特异抗性和较高的亲 和力，为其进一步应用打下了基础。
国家863计划资助项目(Z-18-01-02-03)
王琰 通讯联系人
作者简介：陈晓穗，女，45岁，硕士，副研究员，主要从事抗体工程研究
4 参考文献
1，We Y M, Xu X H, Hu D C et al. Hepatitis B vaccine and anti-HBS c omplex as approach for vaccine therapy. Lancet, 1995；345：1575
2，闻玉梅.治疗性疫苗的研究进展.中华微生物学和免疫学杂志，1996；16(3)：155
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3，陈竞华，王 琰，刘群英 et al.人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选 .中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(3)：158
4，王 琰，刘群英，化 冰 et al.从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的 抗HBsAg Fab克隆.中国免疫学杂志，1998；14(2)：115
5，王 琰，王欲晓，朱迎春 et al.将抗体所获抗-HBS Fab 平均换为全长人IgG.中 华微生物学和免疫学杂志，2000；20(1)：41
6，Beatty J D， Beatty B G,Vlahos W G. Measurement of monoclonal antibody affint iy by non-competitive enzyme immunoassay. J Immunol Methods, 1987；100：173
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7，Bender E, Woof J M, Atkin J D et al.Recombinant human antiodies: Linkag e of an Fab frament from a combinatorial library to an Fc fragment for expression iin m ammlian cell culture. Hum Antibod Hybridomas, 1993；4：74
8，Persic L, Roberts A, Wilton J et al. An integrated vector system for the euk aryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage d isplay libraries. Gene, 1997；187：9
9，Karin M. Metallothioneins:proteins in search of function. Cell,1985；41：9
[收稿1999-07-08 修回1999-10-08], 百拇医药
单位：陈晓穗(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；朱迎春(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；王欲晓(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；刘晓琳(解放军；周丽君(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)；王琰(解放军海军 总医院中心实验科，北京100037)
关键词：噬菌体抗体；乙肝表面抗原；人抗体；真核表达
中国免疫学杂志000506 摘 要 目的：尝试将1株来源于人源性噬菌体抗体库的抗HBsAg人Fa b，转换成完整的抗 HBsAg人IgG。方法：采用重叠PCR方法，在抗HBsAg人Fab的Vκ和VH基因 的5’端接上人工合成 的人κ链的前导序列，构建表达完整IgG1的真核表达载体，转染CHO(DHFR-)细胞，用ELI S A、RT-PCR和免疫印迹检测抗HBsAg人IgG的表达。通过DHFR/MTX体系及金属离子诱导提高Ig 表达。结果：获得表达量在每24 h 1 μg/106细胞的稳定表 达抗HBsAg人IgG的转染细胞系 。并证实所表达IgG具有良好特异性及完整Fc段，其亲和力约为2.1×109 M-1。又 通 过DHFR/MTX扩增系统的作用及金属离子锌和镉对小鼠金属硫蛋白启动子的激活作用，使IgG 的 表达量提高了约20倍。结论：通过拼接人κ链的前导序列在真核表达 系统成功地将抗HBsAg人Fab转换成完整的HBsAg人IgG1，为其进一步应用打下了基础。
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中国图书分类号 R392-11
Construction and eukaryotic expression of anti -HBsAg human IgG
CHEN Xiao-Sui ZHU Ying-Chun WANG Yu-Xiao
(Navy General Hospital, Beijing100037)
Abstract Objective：To convert anti-HBsAg human F ab derived from phage antibody l ibrary to whole human IgG molecules expressed by eukaryotic cells.Met hods：A syn thesized human Vκ leader sequence was spliced to anti-HBsAg VH and Vκ by over lap PCR.Eukaryotic expression vectors were constructed and transfected into CHO(DHF R)cells.The expressed IgG was analyzed by ELISA,RT-PCR and Western blot. DH F R/MTX system and metal ion induction were used to ampify IgG production.Results：Stable transfectant were obtained after selection and subcloning among which th ree produced human IgG up to 1.0 μg/106/24 h.The expressed human IgG was pr ov ed to bind to HBsAg specifically, contain intact Fc portion and possess an assoc iation constant of 2.1×109 M-1by ELISA, RT-PCR and Weastern bolt an alysi s. The expression level could be increased up to 20 times by DHFR/MTX amplificat ion system and metal ion Zn2+and Cd2+induction. Conclution：These res ults proved the successful conversion of anti-HBsAg human Fab fragments to whol e hIgG molecules with good specificity and affinity.
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Key words Phage antibody HBsAg Human antibody Eukaryot ic expression
乙型病毒性肝炎是一种发病率高且危害性大的疾病，抗乙肝病毒表面抗原(H BsAg)的人源 性 抗体在临床上有防治乙肝的应用前景，如用于预防新生儿的乙肝病毒的垂直传播和制备治 疗性乙肝疫苗[1，2]。但人单克隆抗体的制备一直较为困难，噬菌体抗体库技术的 出现使多年来人源性抗体制备的难题得到了解决。通过这条新途径，各种人源性抗体不断出 现，已显示出其作为体内诊疗制剂应用与发展的诱人前景。我们在以前的工作中曾用噬菌体 抗体库技术从接种过乙肝疫苗的个体克隆到两株不同的抗HBsAg人Fab段基因[3，4] 。从抗体库中获得的抗体可变区基因可在大肠杆菌表达的小分子抗体，在某些情况下，尤其 用于体内治疗，需要Fc段的生物学效应功能，因此需制备完整的抗体分子，本研究试图将其中一株抗HBsAg Fab转换成真核表达的完整的人IgG1，并通过扩增的方法提高人IgG在CHO细 胞中的表达量。为其进一步应用打下基础。现将结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 质粒和细胞株 抗HBsAg人Fab基因的载体质粒p3HB2-1由本室构建[4]，大 肠杆菌菌株XL1-Blue由本室保存。可同时表达人轻、重链的真核表达载体(含DHFR基因)pDH L 由中科院微生物所阎锡蕴教授惠赠。人κ链前导序列的载体质粒pUCL由本室构建。CHO(DHFR -)细胞系由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠。
1.2 寡核苷酸引物 前导序列的设计与合成，用于扩增VH和Vκ以及将前 导序列与VH、Vκ拼接的引物LEK、HK3、LEH、HG3、SIG、PDVK3及PDVH3，见文献[5]。
1.3 真核表达载体的构建 分别用LEK+HK3和LEH+HG3从原核表达载体上扩 增与前导序列3 ’端互补的κ链和Fd段，再通过重叠PCR，以所获κ段或Fd段与含前导序列的质粒pUCL互为 引 物和模板PCR扩增7圈，补加前导序列5’端引物SIG和Vκ3’端引物PDVK3或VH3’端引物PDVH 3，继续扩增30圈，获得400 bp左右的带前导序列的Vκ和VH基因。经琼脂糖电泳分离、纯化 、电洗脱回收后分别将Vκ和VH重组到真核表达体pDHL的相应部位。得表达载体pDHLHB2。
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1.4 CHO细胞的转染和克隆化培养 取表达载体DNA 0.4 μg，加到含有4 μ1Plus Reagent 的25 μ1无血清IMDM培养基中，室温置15 min；另取LipofectimAMINE Reagent 1 μ1加入2 5 μ1无血清IMDM中。以上两种液体混合后室温置15 min，取混合液逐滴加入1×105CHO 细胞 /200 μ1无血清IMDM培养基中。37C培养3 h后，补加含10%小牛血清的非选择培养液至 1 m1。次日吸出细胞上清，换入1 m1非选择性培养基，48 h后取上清检测IgG的瞬时表达。 同 时用有限稀释 法在96孔板上进行转染细胞的克隆化培养，加入选择性培养基(不含次黄嘌呤 和胸腺嘧啶的IMDM培养液)。10 d后开始检测单克隆，挑出阳性孔细胞继续进行亚克隆化培 养，直至所有亚克隆细胞100%为阳性克隆，稳定表达IgG的单克隆细胞。
1.5 氨甲喋呤(MTX)对IgG表达的扩增 挑选表达抗HBsAg人IgG的单克隆 转染细胞系，在 选择培养液中加入10-7mol/L MTX，培养细胞2 w后做亚克隆培养，挑选出表达量提 高的 单克隆细胞，继续用MTX加压，浓度至10-6 mol/L，2 w后同上处理。再将MTX增加到 10 -5 mol/L。检测加压后生长的亚克隆细胞培养上清中的人IgG表达量和与抗原的结合活 性。
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1.6 金属离子锌和镉对MTI启动子的激活 在转染细胞的培养液中加入 不同浓 度硫酸锌(0.78～200 μm)和硫酸镉(0.007～2 μm)，1 w后，检测细胞培养上清中 IgG的表达。
1.7 ELISA
1.7.1 IgG表达量的测定 用羊抗人IgG Fab包被ELISA板。1% BSA-PBS封闭后 ，加入细胞培养上清和不同浓度的标准人IgG，37C 1 h，洗3次后，加入HRP-羊抗人I gG 37C 1 h，洗3次后，加入OPD底物液显色 ，测A490值。
1.7.2 IgG与抗原结合活性的测定用重组HBs Ag 0.9 μg/ml包被ELISA 板 (同时用多种抗原液包被作对照)，其余步骤同上，测定细胞上清的抗原特异性结合活性。
1.8 RT-PCR 用Trizol按产品说明书从1×107转染细胞中提取总RNA 。逆转录后PCR扩 增IgG的各片段，以证实转染细胞中存在人IgG的轻链和重链mRNA。
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1.9 免疫印迹试验 取抗 HBsAg人IgG和标准人IgG进行12%的SDS -PAGE电泳，电转移至纤维膜上，5%脱脂奶粉-PBS 4C封闭后，加入HRP-羊抗人IgG(γ 链)和HRP-羊抗人Fab(κ链)，孵育2 h，洗涤后，加入DAB液显色。
1.10 亲和力测定 采用非竞争性酶免疫法，抗HBsAg IgG从8 mmol/L浓 度倍比稀释后加样[6]。亲和力计算公式：K＝n-1/2(n[AB’]-[AB ])。
2 结果
2.1 完整人IgG表达载体的构建 通过重叠PCR拼接法将人工合成的一个人 κ链的前导序列 和抗HBsAg的Vκ和VH拼接在一起，并重组装到pDHL中得到表达载体pDHLHB2，如图1所示，PM T I为小鼠金属硫蛋白I启动子，Cκ为轻链恒定区基因，CH1、CH2、CH3为人IgG1重链恒 定区基因，DHFR为二氢叶酸还原基因，XbaI和BamHI之间为轻链可变区基因，XhoI和HindIII 之间为重链可变区基因。
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图1 表达载体pDHLHB2示意图
Fig.1 Expression vector pDHLHB2
图2 人IgG mRNA的RT-PCR检测
Fig.2 RT-PCR ampliqication of the human IgG mRNA
Note： M1.γDNA/EcoR 91I;M2.PBR 322 DNA/BstNI
图3 表达的人IgG的免疫印迹检测
Fig.3 Western Blot of the expressed human IgG
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Note:1.expressed IgG；2.normal human IgG
图4 MTX对转染细胞IgG表达的扩增作用
Fig.4 Increased expression of IgG by MTX
图5 金属离子锌和镉对转染细胞IgG表达的影响
Fig.5 Effect of Zn2+and Cd2+on the expression of the IgG
2.2 CHO细胞的转染及IgG的瞬时表达 将表达质粒以脂质体介导法转染到 CHO(DHFR-) 细胞中，转染60 h后取细胞培养上清，测定人IgG的瞬时表达量，约为160～300 ng/ml 。测定其与HBsAg及其它不同抗原的结合活性，结果显示转染细胞表达的IgG只与HBsAg有特 异结合反应，与其他抗原无交叉反应。
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2.3 转染细胞的克隆化培养筛选及稳定表达 用有限稀释法克隆化培养和 选择稳定转染的 细胞克隆，初次筛选出35个阳性克隆，经ELISA测定，其中有3个克隆的IgG表达量达每24 h 0.6～1.0 μg/106细胞(图2)，ELISA检测其抗原特异性结合良好。
2.4 人IgG mRNA的检测 为进一步核实转染细胞中完整IgG的表达，从转 染的CHO细胞中提 取总RNA，用RT-PCR扩增出IgG轻、重链的各片段。琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2可见到约70 0 bp的κ链(1道)，约1 400 bp的完整H链(2道)，约1 000 bp的CH1-CH3段(3道)以及约700 ～ 800 bp的Fd段和Fc段(4道和5道)，由于从扩增带的长度可推断出表达载体上轻重链基因所含 的内 含子序列已被剪切，表明转染细胞中存在IgG κ链和完整H链的mRNA。
2.5 免疫印迹试验 为进一步核实IgG蛋白的表达，进行Western Blot。 图3中第1道为转 染细胞表达的人IgG的轻、重链，第2道为正常人IgG的轻、重链。结果证实表IgG蛋白的表达。
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2.6 MTX对转染细胞IgG表达量的扩增 为增加抗HBsAg人IgG的表达，将表 达量高的稳定转 染细胞系用MTX持续加压处理近2个月期间MTX浓度逐步从10-7增加到10 -5 mol/L。取不同MTX浓度处理的转染细胞的亚克隆培养上清进行检测，结果表明，经MTX处理后，细 胞分泌抗体的抗原结合活性不受影响，而IgG的表达量随着MTX浓度增加而逐步提高，从加压 前的每24 h 0.6～1.0 μg/106细胞，增至每24 h 6～10 μg/106细胞，见图4 。
2.7 金属离子锌和镉对IgG表达的诱导 pDHLHB2载体中Ig基因是在小鼠 金属硫蛋白I(MTI) 启动子的驱动下进行表达，该启动子可被金属离子锌和镉所诱导，在培养液中加入不同浓度 的硫酸锌和硫酸镉，观察其对Ig表达的诱导效果。显示硫酸锌/硫酸镉的浓度在(6.25 μmol/L)/(0.062 5 μmol/L)时，转染细胞IgG表达量较对照孔细胞增加最为明显，可 使表达量增加1～2倍， 细胞状态良好。超过硫酸锌(100 μmol/L)/硫酸镉(0.1 μmol/L)浓度时细胞生长受到明显 抑制，导致分泌量急剧下降(图5)。
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2.8 抗HBsAgIgG的亲和力测定 采用Beatty等报道的非竞争性酶免疫法 测定 了CHO细胞表达的完整人IgG的亲和力[6] 。计算公式按文中报道的方法。测定结果经计算，抗HB sAg IgG的亲和力约为2.1×109 M-1(图略)。
3 讨论
大肠杆菌无法表达具有正常功能的完整抗体分子。因此，为了把来源于噬菌体抗体库的 人源 性抗体片段转换成完整的人抗体，必须换用真核细胞的表达体系。迄今，这类报道不多。这 里需要解决的主要问题，包括构建适当的表达载体和选择合适的表达手段以提高产量。
在构建完整抗体的真核表达载体时，载体除必须具备一般的元件以及Ig的恒定区基因外，主 要还需选择合适的前导序列。在构建噬菌体抗体库时，从第一骨架区扩增可变区基因，未包 括前导序列。在大肠杆菌是通过细菌来源的前导序列完成抗体片段的分泌型表达，不适用 于真核细胞。抗体的前导序列变化较大，不同的抗体配以何种前导序列才能保证有效的分泌 表达及前导肽酶对前导肽的切除，尚待积累成功的经验。Bender等将一个噬菌体人Fab转换 成完整的人Ig，是根据原Fab的V区亚群选择了来源于同一亚群的同源性最强的 前导序列，但这种方法需根据每一个可变区基因设计前导序列，不具通用性[7]。P ersic等构建了一 套完整人抗体的通用表达载体，采用了小鼠VH前导序列，他们试用了一个噬菌体抗体的人源 性ScFv和一个鼠源性杂交瘤抗体的V区基因的转换，均获成功[8]。我们选择了一个 人κ链前导序列进行原核到真核表达的转换，将一株来源于噬菌体抗体库的抗HBsAg的人Fab 转 换也获成功[5]，提示尽管Ig前导序列有较高的多样性，其功能仍具有较大的通用 性，有可能用一个前导序列表达多种不同的可变区基因。
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为进一步证实完整抗体在CHO细胞中表达，采用Western Blot检测到转染细胞上清中的IgG蛋 白分子的轻、重链；又从转染细胞中经RT-PCR扩增出人IgG轻、重链的各个片段，表明所表 达的抗体分子具有完整的Fc段，但对其的生物学效应功能尚需进一步的试验证实。
CHO细胞的DHFR缺陷型变异株在转染表达外源基因时，可通过DHFR/MTX扩增系统提高表达量 。在含DHFR抑制剂MTX的培养液中选择培养，MTX的加压作用使DHFR及其两侧基因序列扩增， 抗 体基因也得以扩增。本研究通过MTX加压作用，使CHO细胞表达IgG的水平从每24 h 1 μg/1 06细胞提高到每24 h 10 μg/106细胞。由于所采用的真核表达载体中的小鼠金属硫蛋 白启 动子，可被金属离子锌、镉等诱导，增加基因的转录水平[9]，我们尝试在细胞培 养液中适量添加锌(6.25～12.5 μmol/L)和镉(1.062 5～0.125 μmol/L)可在MTX扩增的基 础上再加倍提高转染细胞IgG的表达量，同时保持细胞正常的生长繁殖状态。
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本研究获得了稳定表达抗HBsAg IgG1的CHO细胞株，此抗体具有良好的特异抗性和较高的亲 和力，为其进一步应用打下了基础。
国家863计划资助项目(Z-18-01-02-03)
王琰 通讯联系人
作者简介：陈晓穗，女，45岁，硕士，副研究员，主要从事抗体工程研究
4 参考文献
1，We Y M, Xu X H, Hu D C et al. Hepatitis B vaccine and anti-HBS c omplex as approach for vaccine therapy. Lancet, 1995；345：1575
2，闻玉梅.治疗性疫苗的研究进展.中华微生物学和免疫学杂志，1996；16(3)：155
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3，陈竞华，王 琰，刘群英 et al.人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选 .中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(3)：158
4，王 琰，刘群英，化 冰 et al.从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的 抗HBsAg Fab克隆.中国免疫学杂志，1998；14(2)：115
5，王 琰，王欲晓，朱迎春 et al.将抗体所获抗-HBS Fab 平均换为全长人IgG.中 华微生物学和免疫学杂志，2000；20(1)：41
6，Beatty J D， Beatty B G,Vlahos W G. Measurement of monoclonal antibody affint iy by non-competitive enzyme immunoassay. J Immunol Methods, 1987；100：173
, http://www.100md.com
7，Bender E, Woof J M, Atkin J D et al.Recombinant human antiodies: Linkag e of an Fab frament from a combinatorial library to an Fc fragment for expression iin m ammlian cell culture. Hum Antibod Hybridomas, 1993；4：74
8，Persic L, Roberts A, Wilton J et al. An integrated vector system for the euk aryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage d isplay libraries. Gene, 1997；187：9
9，Karin M. Metallothioneins:proteins in search of function. Cell,1985；41：9
[收稿1999-07-08 修回1999-10-08], 百拇医药