9.1C3分子抑制杀伤性细胞的细胞毒作用及其机制
作者：欧阳为明 金伯泉 李琦 李林 刘雪松 韩卫宁 李德敏 夏海滨
单位：欧阳为明(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)；金伯泉(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)；李琦(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)；李林(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
关键词：细胞毒细胞；TNF-ɑ；抑制型杀伤细胞受体
中国免疫学杂志000502 摘 要 目的：探讨9.1C3分子对杀伤细胞功能的影响。方法：以新鲜分离的PBMC或混合淋巴 细胞培养活化的淋巴细胞为效应细胞，采用重导向杀伤实验(Redirected killing assay, R KA)观察9.1C3抗体对效应细胞杀伤P815细胞作用及其杀伤过程中TNF-ɑ分泌的影响。结果 ：9.1C3抗体能显著抑制杀伤细胞对靶细胞的细胞毒作用，并使效应细胞分泌TNF -ɑ水平降低。结论：9.1C3分子是一种抑制型杀伤细胞受体。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
The inhibitory effect of 9.1C3 molecule on cy totoxicity of human killer cells
OU-YANG Wei-Ming JIN Bo-Quan LI Qi
(Departmen t of Immunology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract Objective：To investigate the effect of 9 .1C3 antibody on human killer cells.Methods：Redirected killing assay was employed to stu dy the effect of 9.1C3 antibody on cytotoxic activity of killer cells, in which freshly isolated PBMC or mixture lymphocyte culture cells were used as effectors,and P815 was used as target cells. Results：Cytotoxicity of effectors induced by CD16 was significantl y inhibited by 9.1C3 antibody and the secrection of TNF-ɑ was also inhibited du ring the killing phase.Conclusion：9.1C3 molecule is a kin d of killing cell inhibitory receptor.
, 百拇医药
Key words Killer cell TNF-ɑ Killing cell inhibitiory receptor
1990年以来，有关NK细胞受体的研究有了突破，克隆和鉴定了一批NK细胞 刺激型或抑制型 受体，并对不同类型受体介导的信号转导有了全新的认识。从分子水平进一步阐明了NK细胞 参与机体先天免疫(Innate immunity)以及调节免疫应答。重导向杀伤实验(Rediercted kil ling assay,RKA)是一种确定杀伤细胞受体性质的方法[1]，RKA是以表达Fc受体的P 8 15为靶细胞，在杀伤系统中加入杀伤细胞膜分子相应的抗体，观察其对效应细胞杀伤靶细胞 的促进或抑制作用，从而确定抗体识别的受体为刺激型或抑制型杀伤细胞受体。应用RKA已 确定CD158a、CD158b、p70、p140、p49、LAIR-1等为抑制型受体，CD2、CD16、CD44、CD69 、NKR-P1等为刺激型受体。9.1C3是通过从外周血分离的人NK细胞免疫小鼠筛选到的1株 单抗[2]，它能显著抑制新鲜分离NK细胞对K562细胞的细胞毒作用，其作用的机制 还不清楚。本文应用RKA方法研究9.1C3分子对杀伤细胞功能的影响，同时观察RKA中9.1 C3抗体对杀伤细胞分泌TNF-ɑ的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 Na251CrO4购自Amershan公司，TNF-ɑ EL ISA试剂盒为本室制备。
1.1.2 抗体和细胞系 9.1C3、CD16和CD57单克隆抗体为本室制备。K56 2、P815的Daudi细胞为本室冻存，上述细胞培养于含10%FCS的RPMI1640培养基中。
1.2 方法
1.2.1 效应细胞的制备 取健康人外周血，用Ficoll分离单个核细胞， 分离得到的PBMC直接用于杀 伤或作为混合淋巴细胞培养(MLC)中的反应细胞。混合淋巴细胞培养参照文献[3]： 将1.5×106 PBMC和0.5×106经3 000 Rad照射的Daudi细胞接种于24孔板中，37C、5% CO2孵 箱培养5 d后，加入100 U/ml的IL-2继续培养3 d，收集细胞，作为RKA实验的效应细胞。
, 百拇医药
1.2.2 51Cr释放实验[4] 收集对数生长期的P815细胞， 加入51Cr至1 00 μCi/1.0×106细胞，于37°C、5%CO2孵箱中标记2 h，每隔15 min摇匀1次，标记 完 毕后洗涤3次，调整细胞浓度至1.0×105 ml-1，加入V型板中，100 μl/孔，作为R KA中的靶 细胞；按效靶比加入相应的效应细胞，其中效应细胞预先和相应的抗体于37°C孵育30 min 。 杀伤时于37C、5%CO2孵箱中放置4 h。每孔收集100μl上清，测γ射线cpm值，按以 下公式计算杀伤率：
1.2.3 TNF-ɑ的测定收集MLC细胞，加入相应抗体于37C孵育30 min ，调整细胞浓度至1 .0×106 ml-1，取100μl加入预先加有未标记同位素1.0×104 P815细胞的V型 板中，于37C、5%CO2孵箱中放置4 h后收集上清，ELISA方法测定TNF-ɑ的含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 9.1C3抑制PBMC在RKA中的杀伤作用 图1显示CD16抗体在RKA中能诱导 静止PBMC对P815细胞的杀伤作用，这与以往的报道相吻 合[1]。但同时加入9.1C3抗体后，几乎完全抑制由CD16抗体诱导的对P815的杀伤作 用。CD57抗体作为对NK细胞杀伤无影响的阴性对照。这表明9.1C3能抑制活化型受体C D16介导的杀伤作用。
2.2 9.1C3抑制MLC效应细胞在RKA中的杀伤作用 以MLC活化的淋巴细胞为 效应细胞，观察 到9.1C3抗体在RKA实验系统中对杀伤的抑制作用。从图2可以看出，MLC来源的效应细胞 对P8 15细胞有一定的杀伤，在效靶比为8：1、4：1和2：1时杀伤率分别为20.5%、13.2%和9.8%。这种杀伤作用能被9.1C3抗体完全抑制。在RKA实验系统中加入CD16抗体时，效应细胞对P815 细胞的杀伤作用显著增强，在效靶比为8：1、4：1和2：1的杀伤率为82.2%、56.7%和53.5% ，比对照组分别增加4.7、5.0和5.9倍；但同时加入9.1C3抗体时，效应细胞对P815细胞 的杀 伤作用被明显抑制，在效靶比为8：1、4：1和2：1的杀伤率为12.4%、7.1%和3.4%，抑制率 分别为84.9%、87.5%和93.6%。9.1C3这种抑制作用与加入抗体的浓度呈剂量依赖关系，随着 抗体浓度的降抵抑制作用减弱，效靶比为10：1，CD16抗体浓度为5 μg/ml,见图3。
, 百拇医药
图1 9.1C3抑制PBMC在RKA中CD16介导的杀伤作用
Fig.1 Inhibitory effect of 9.1C3 antibody on
CD16 induced cytotoxicity of PBMC in RKA
图2 9.1C3抑制MLC效应细胞在RKA中CD16介导的杀伤 作用
Fig.2 Inhibitory effect of 9.1C3 antibody on CD16 induced
cytotoxicity of MLC effector in RKA
, 百拇医药
图3 9.1C3抑制CD16介导杀伤作用的剂量依赖关系
Fig.3 The inhibitory effect of 9.1C3 antibody on CD16-induced
cytotoxic ity in dose response manner
图4 9.1C3抗体对CD16诱导效应细胞分泌 TNF-ɑ的 抑制作用
Fig.4 Inhibitory effect of 9.1C3 antibody on the secretion of
TNF-ɑ by CD16-induced effectors
, 百拇医药
2.3 9.1C3抗体在RKA中降低效应细胞TNF-ɑ的分泌水平 以MLC为效应细 胞的RKA中，加入CD16抗体比不 加抗体或加对照抗体，效应细胞在杀伤相4 h培养上清中TNF-ɑ的释放明显增加，上清中 浓度为494 pg/ml，是对照组的5.8倍。但同时加入CD16和9.1C3抗体时，CD16刺激效应细胞 分泌TNF-ɑ被明显抑制，其浓度降低为259 pg/ml，抑制率达48%(图4)。
3 讨论
最近的研究表明NK细胞受体(NK cell receptor, NKCR)根据其对NK细胞活化及其杀伤功 能的 影响可以分为3类[2，5，6]：①活化型受体，主要有CD2、CD16、CD44、CD69、N KR-P1、PTA1等，通过RKA可观察到这类受体能增强NK细胞的杀伤活性以及促进TNF-ɑ、IF N-γ、GM-CSF等重要细胞因子的分泌，其中CD16是最常用的活化型NK细胞受体的模型。② 抑制型受 体，主要有KIRs(Killer cell inhyibitory receptors)家族(CD158a、CD158b、p70、p140) 、p49、LAIR-1、NKG2家族、Ly49家族(小鼠)等，通过RKA实验可观察到这类受 体不仅抑制NK细胞的自然杀伤活性，还能负调节由活化型受体介导的NK细胞活化、对靶细胞的杀伤作用 以及细胞因子的分泌。③CD56、CD57、CD96等分子虽可作为NK细胞的标记，但不影响NK细 胞的杀伤功能。本实验采用RKA方法观察到9.1C3抗体能显著抑制CD16介导的PBMC和MLC细 胞对P815细胞的杀伤作用以及杀伤过程中TNF-α的分泌。由于CD16分子表达于PBMC或ML C效应细胞中的NK细胞上，可以认为9.1C3分子是对NK细胞活化具有重要的负调节作用的抑制 型受体。
, 百拇医药
在实验中，我们观察到MLC效应细胞对P815细胞有一定的杀伤作用，可能是由NK细胞、CTL细 胞和LAK细胞介导，这种杀伤作用能被9.1C3抗体 完全抑制，这提示9.1C3除了对NK细胞的杀 伤抑制作用外，对T细胞功能也可能具有类似的调节作用。事实上，大部分抑制型NKC R也表达于T细胞上，并参与调节T细胞的活化，如KIR、NKG2A等。我们发现9.1C3分子分布较 广，表达于NK细胞、T细胞、中性粒细胞、巨核细胞以及单核细胞(资料未发表)。这种分布 特性显然不同于已报道的NK细胞抑制型受体，因此9.1C3分子很可能是一种新的抑制型NK细 胞受体，有关9.1C3分子的基因克隆以及对NK细胞信号的研究正在研究之中。
本课题为国家自然科学基金资助项目(NO.39770381)
作者简介：欧阳为明，男，28岁，博士生，主要从事细胞与分子免疫学研究
刘雪松(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
, http://www.100md.com
韩卫宁(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
李德敏(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
夏海滨(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
4 参考文献
1，Lanier L L,Corliss B，Phillips J H.Arousal and inhibition of human N K cells. Immunol Rev,1997；155：145
2，Gordon F B,Tony T,Pery F B et al. Human natural killer cells, activated l yphocyt e killer cells, and monocytes possess similar cytotxic mechanisms. Proc Natl Aca d Sci USA,1983；80：7606
, 百拇医药
3，Aramburu J,Balboa M A,Ramirez A et al. A novel functional cell surface dimer (Kp43) expressed by natural killer cells and T cell receptor-gamma/delta+T lymp hocytes. I. Inhibition of the IL-2-dependent proliferation by anti-Kp43 monoc lonal antibody.J Immunol，1990；144：3238
4，le-Drean E,Vely F,Olcese L et al. Inhibition of antigen-induce T cel l res ponse and antibody induced NK cell cytotoxicity by NKG2A:association of NKG2A wi th SHP-1 and SHP-2 protein-tyrosine phosphatases. Eur J Immunol，1998；28：2 64
5，Lanier L L.NK cell receptors. Annu Rev Immunol，1998；16：371
6，Lanier L L.NK natural killer cells:from no receptor to too many.Immuntiy，199 7；6：371
[收稿1999-06-23 修回1999-09-21], 百拇医药
单位：欧阳为明(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)；金伯泉(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)；李琦(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)；李林(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
关键词：细胞毒细胞；TNF-ɑ；抑制型杀伤细胞受体
中国免疫学杂志000502 摘 要 目的：探讨9.1C3分子对杀伤细胞功能的影响。方法：以新鲜分离的PBMC或混合淋巴 细胞培养活化的淋巴细胞为效应细胞，采用重导向杀伤实验(Redirected killing assay, R KA)观察9.1C3抗体对效应细胞杀伤P815细胞作用及其杀伤过程中TNF-ɑ分泌的影响。结果 ：9.1C3抗体能显著抑制杀伤细胞对靶细胞的细胞毒作用，并使效应细胞分泌TNF -ɑ水平降低。结论：9.1C3分子是一种抑制型杀伤细胞受体。
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中国图书分类号 R392.12
The inhibitory effect of 9.1C3 molecule on cy totoxicity of human killer cells
OU-YANG Wei-Ming JIN Bo-Quan LI Qi
(Departmen t of Immunology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract Objective：To investigate the effect of 9 .1C3 antibody on human killer cells.Methods：Redirected killing assay was employed to stu dy the effect of 9.1C3 antibody on cytotoxic activity of killer cells, in which freshly isolated PBMC or mixture lymphocyte culture cells were used as effectors,and P815 was used as target cells. Results：Cytotoxicity of effectors induced by CD16 was significantl y inhibited by 9.1C3 antibody and the secrection of TNF-ɑ was also inhibited du ring the killing phase.Conclusion：9.1C3 molecule is a kin d of killing cell inhibitory receptor.
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Key words Killer cell TNF-ɑ Killing cell inhibitiory receptor
1990年以来，有关NK细胞受体的研究有了突破，克隆和鉴定了一批NK细胞 刺激型或抑制型 受体，并对不同类型受体介导的信号转导有了全新的认识。从分子水平进一步阐明了NK细胞 参与机体先天免疫(Innate immunity)以及调节免疫应答。重导向杀伤实验(Rediercted kil ling assay,RKA)是一种确定杀伤细胞受体性质的方法[1]，RKA是以表达Fc受体的P 8 15为靶细胞，在杀伤系统中加入杀伤细胞膜分子相应的抗体，观察其对效应细胞杀伤靶细胞 的促进或抑制作用，从而确定抗体识别的受体为刺激型或抑制型杀伤细胞受体。应用RKA已 确定CD158a、CD158b、p70、p140、p49、LAIR-1等为抑制型受体，CD2、CD16、CD44、CD69 、NKR-P1等为刺激型受体。9.1C3是通过从外周血分离的人NK细胞免疫小鼠筛选到的1株 单抗[2]，它能显著抑制新鲜分离NK细胞对K562细胞的细胞毒作用，其作用的机制 还不清楚。本文应用RKA方法研究9.1C3分子对杀伤细胞功能的影响，同时观察RKA中9.1 C3抗体对杀伤细胞分泌TNF-ɑ的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 Na251CrO4购自Amershan公司，TNF-ɑ EL ISA试剂盒为本室制备。
1.1.2 抗体和细胞系 9.1C3、CD16和CD57单克隆抗体为本室制备。K56 2、P815的Daudi细胞为本室冻存，上述细胞培养于含10%FCS的RPMI1640培养基中。
1.2 方法
1.2.1 效应细胞的制备 取健康人外周血，用Ficoll分离单个核细胞， 分离得到的PBMC直接用于杀 伤或作为混合淋巴细胞培养(MLC)中的反应细胞。混合淋巴细胞培养参照文献[3]： 将1.5×106 PBMC和0.5×106经3 000 Rad照射的Daudi细胞接种于24孔板中，37C、5% CO2孵 箱培养5 d后，加入100 U/ml的IL-2继续培养3 d，收集细胞，作为RKA实验的效应细胞。
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1.2.2 51Cr释放实验[4] 收集对数生长期的P815细胞， 加入51Cr至1 00 μCi/1.0×106细胞，于37°C、5%CO2孵箱中标记2 h，每隔15 min摇匀1次，标记 完 毕后洗涤3次，调整细胞浓度至1.0×105 ml-1，加入V型板中，100 μl/孔，作为R KA中的靶 细胞；按效靶比加入相应的效应细胞，其中效应细胞预先和相应的抗体于37°C孵育30 min 。 杀伤时于37C、5%CO2孵箱中放置4 h。每孔收集100μl上清，测γ射线cpm值，按以 下公式计算杀伤率：
1.2.3 TNF-ɑ的测定收集MLC细胞，加入相应抗体于37C孵育30 min ，调整细胞浓度至1 .0×106 ml-1，取100μl加入预先加有未标记同位素1.0×104 P815细胞的V型 板中，于37C、5%CO2孵箱中放置4 h后收集上清，ELISA方法测定TNF-ɑ的含量。
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2 结果
2.1 9.1C3抑制PBMC在RKA中的杀伤作用 图1显示CD16抗体在RKA中能诱导 静止PBMC对P815细胞的杀伤作用，这与以往的报道相吻 合[1]。但同时加入9.1C3抗体后，几乎完全抑制由CD16抗体诱导的对P815的杀伤作 用。CD57抗体作为对NK细胞杀伤无影响的阴性对照。这表明9.1C3能抑制活化型受体C D16介导的杀伤作用。
2.2 9.1C3抑制MLC效应细胞在RKA中的杀伤作用 以MLC活化的淋巴细胞为 效应细胞，观察 到9.1C3抗体在RKA实验系统中对杀伤的抑制作用。从图2可以看出，MLC来源的效应细胞 对P8 15细胞有一定的杀伤，在效靶比为8：1、4：1和2：1时杀伤率分别为20.5%、13.2%和9.8%。这种杀伤作用能被9.1C3抗体完全抑制。在RKA实验系统中加入CD16抗体时，效应细胞对P815 细胞的杀伤作用显著增强，在效靶比为8：1、4：1和2：1的杀伤率为82.2%、56.7%和53.5% ，比对照组分别增加4.7、5.0和5.9倍；但同时加入9.1C3抗体时，效应细胞对P815细胞 的杀 伤作用被明显抑制，在效靶比为8：1、4：1和2：1的杀伤率为12.4%、7.1%和3.4%，抑制率 分别为84.9%、87.5%和93.6%。9.1C3这种抑制作用与加入抗体的浓度呈剂量依赖关系，随着 抗体浓度的降抵抑制作用减弱，效靶比为10：1，CD16抗体浓度为5 μg/ml,见图3。
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图1 9.1C3抑制PBMC在RKA中CD16介导的杀伤作用
Fig.1 Inhibitory effect of 9.1C3 antibody on
CD16 induced cytotoxicity of PBMC in RKA
图2 9.1C3抑制MLC效应细胞在RKA中CD16介导的杀伤 作用
Fig.2 Inhibitory effect of 9.1C3 antibody on CD16 induced
cytotoxicity of MLC effector in RKA
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图3 9.1C3抑制CD16介导杀伤作用的剂量依赖关系
Fig.3 The inhibitory effect of 9.1C3 antibody on CD16-induced
cytotoxic ity in dose response manner
图4 9.1C3抗体对CD16诱导效应细胞分泌 TNF-ɑ的 抑制作用
Fig.4 Inhibitory effect of 9.1C3 antibody on the secretion of
TNF-ɑ by CD16-induced effectors
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2.3 9.1C3抗体在RKA中降低效应细胞TNF-ɑ的分泌水平 以MLC为效应细 胞的RKA中，加入CD16抗体比不 加抗体或加对照抗体，效应细胞在杀伤相4 h培养上清中TNF-ɑ的释放明显增加，上清中 浓度为494 pg/ml，是对照组的5.8倍。但同时加入CD16和9.1C3抗体时，CD16刺激效应细胞 分泌TNF-ɑ被明显抑制，其浓度降低为259 pg/ml，抑制率达48%(图4)。
3 讨论
最近的研究表明NK细胞受体(NK cell receptor, NKCR)根据其对NK细胞活化及其杀伤功 能的 影响可以分为3类[2，5，6]：①活化型受体，主要有CD2、CD16、CD44、CD69、N KR-P1、PTA1等，通过RKA可观察到这类受体能增强NK细胞的杀伤活性以及促进TNF-ɑ、IF N-γ、GM-CSF等重要细胞因子的分泌，其中CD16是最常用的活化型NK细胞受体的模型。② 抑制型受 体，主要有KIRs(Killer cell inhyibitory receptors)家族(CD158a、CD158b、p70、p140) 、p49、LAIR-1、NKG2家族、Ly49家族(小鼠)等，通过RKA实验可观察到这类受 体不仅抑制NK细胞的自然杀伤活性，还能负调节由活化型受体介导的NK细胞活化、对靶细胞的杀伤作用 以及细胞因子的分泌。③CD56、CD57、CD96等分子虽可作为NK细胞的标记，但不影响NK细 胞的杀伤功能。本实验采用RKA方法观察到9.1C3抗体能显著抑制CD16介导的PBMC和MLC细 胞对P815细胞的杀伤作用以及杀伤过程中TNF-α的分泌。由于CD16分子表达于PBMC或ML C效应细胞中的NK细胞上，可以认为9.1C3分子是对NK细胞活化具有重要的负调节作用的抑制 型受体。
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在实验中，我们观察到MLC效应细胞对P815细胞有一定的杀伤作用，可能是由NK细胞、CTL细 胞和LAK细胞介导，这种杀伤作用能被9.1C3抗体 完全抑制，这提示9.1C3除了对NK细胞的杀 伤抑制作用外，对T细胞功能也可能具有类似的调节作用。事实上，大部分抑制型NKC R也表达于T细胞上，并参与调节T细胞的活化，如KIR、NKG2A等。我们发现9.1C3分子分布较 广，表达于NK细胞、T细胞、中性粒细胞、巨核细胞以及单核细胞(资料未发表)。这种分布 特性显然不同于已报道的NK细胞抑制型受体，因此9.1C3分子很可能是一种新的抑制型NK细 胞受体，有关9.1C3分子的基因克隆以及对NK细胞信号的研究正在研究之中。
本课题为国家自然科学基金资助项目(NO.39770381)
作者简介：欧阳为明，男，28岁，博士生，主要从事细胞与分子免疫学研究
刘雪松(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
, http://www.100md.com
韩卫宁(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
李德敏(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
夏海滨(西安第四军医大学免疫教研室，西安710032)
4 参考文献
1，Lanier L L,Corliss B，Phillips J H.Arousal and inhibition of human N K cells. Immunol Rev,1997；155：145
2，Gordon F B,Tony T,Pery F B et al. Human natural killer cells, activated l yphocyt e killer cells, and monocytes possess similar cytotxic mechanisms. Proc Natl Aca d Sci USA,1983；80：7606
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3，Aramburu J,Balboa M A,Ramirez A et al. A novel functional cell surface dimer (Kp43) expressed by natural killer cells and T cell receptor-gamma/delta+T lymp hocytes. I. Inhibition of the IL-2-dependent proliferation by anti-Kp43 monoc lonal antibody.J Immunol，1990；144：3238
4，le-Drean E,Vely F,Olcese L et al. Inhibition of antigen-induce T cel l res ponse and antibody induced NK cell cytotoxicity by NKG2A:association of NKG2A wi th SHP-1 and SHP-2 protein-tyrosine phosphatases. Eur J Immunol，1998；28：2 64
5，Lanier L L.NK cell receptors. Annu Rev Immunol，1998；16：371
6，Lanier L L.NK natural killer cells:from no receptor to too many.Immuntiy，199 7；6：371
[收稿1999-06-23 修回1999-09-21], 百拇医药