Kgla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达
作者：隋建华 宋增璇 佘鸣 张丽艳 沈德诚 韩忠朝
单位：隋建华(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)；宋增璇(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)；佘鸣(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
关键词：Kgla；噬菌体展示；抗体库；scFv
中国免疫学杂志000612 摘 要 目的：用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库。方法：用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠，取其脾细胞，RT-PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体，构建scFv文库，并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性。用KGla作为固相抗原，进行四轮吸附-洗脱-富集的筛选，SDS-PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达。结果：文库的库容为3×106cfu，单个克隆的BstN1 Ⅰ酶切图谱显示多样，提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要，筛选后的文库能很好地表达外源scFv。结论：文库的构建为进一步地分离KGla细胞表面分子抗体基因提供了必要而可靠的基础。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.11
The construction and expression of phage display scFv library from the spleen cells of mice immunized with KGla cells
SUI Jian-Hua, SONG Zeng-Xuan,SHE Ming et al
(Institute of Hematolgy, Chinese Academy of Medical Science & Reking Union Medical College, Tianjin 300020)
Abstract Objective:To construct a scFv library by phage display technique from the spleen cells of mice immunized with KGla cells. Methods: Three mice were immunized with KGla cells, and their spleen cells were harvested. The genes of VH and Vκ were amplified by RT-PCR and a scFv-phage display antibody library was constructed with the amplified V gene. The library was selected by using the KGla cells as panning antigen by 4 rounds of binding-elution-enrichment procedure, and the expression of the library were examined by SDS-PAGE. Results: We were able to produce a scFv library containing 3×106individual clones which showed different patterns after digested with restriction endonuclease BstN I. It indicated that the capacity and diversity of the library is sufficient for screening specific scFv.The surface display expression of the library was also verified. Conclusion: A scFv library of anti-KGla cell surface molecules has been constructed. It will be useful for isolating specific scFv against the cell surface molecules of hematopoietic progenitors.
, 百拇医药
Key words KGla Phage display Antibody library scFv
单链抗体(single chain antibody, scFv)是抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)由一个连接肽首尾相连组成的单一肽链，具有分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等优点。噬菌体展示抗体库技术是继杂交瘤技术之后抗体技术发展的又一新的里程碑[1]。该技术是将抗体可变区基因与单链丝状噬菌体衣壳蛋白基因融合，使scFv或Fab段可随衣壳蛋白一起呈示表达于噬菌体的表面，通过简便的吸附-洗脱-富集的筛选过程，而分离获得特异性抗体可变区基因的新技术。人髓系白血病细胞系KGla细胞表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子，分离这些细胞表面分子的特异性抗体基因具有重要意义。本文报道从KGla细胞免疫小鼠的脾细胞建立scFv噬菌体展示文库，为进一步获得抗造血细胞表面分子的抗体奠定必要的基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 小鼠免疫 用1×107的人髓系白血病细胞系KGla细胞，腹腔注射免疫3只8周龄的雄性BALB/c小鼠，3次免疫后取脾脏混合，分离脾淋巴细胞。
1.2 PCR引物 设计VH和VL引物，采用简并引物形式，并在5＇ 端加有克隆入载体的酶切位点。5＇ 端引物均位于小鼠抗体可变区的第一骨架区共有序列(FR1)，3＇ 端引物均位于恒定区起始段。引物序列如下：PH1(γ重链VH5＇ 端引物，35 bp)：5＇-GGACTAGTTGAA(G)GTA(C，G，T)CAGCTGCAGCAA(G)TCA(C，G，T)GGA(C)GC-3＇。PH2(γ重链VH3′端引物，38 bp)：5′-CCAGGGGCCAGTGGGAATTCAAGCTTGGGTGTGTCGTTTT-3’PL1(K轻链5＇端引物33 bp)：5＇-CGACGCGTAGATATCGTC(G)CTC(G，T)ACA(C，T)CAA (G)TCA (C，G，T)CCA-3＇。PL2(K轻链Vκ 3＇ 端引物，27 bp)：5＇-GATGGATCCAG(C)TTGGTGCAGCAT(A)CAGC-3＇。
, 百拇医药
1.3 载体、菌株及主要材料与试剂 噬菌粒pSEX81和pSEX81-PHOX由德国海德堡大学Dübel博士惠赠。大肠杆菌XL1-Blue和辅助噬菌体M13KO7为本室保存。Taq DNA 聚合酶购自Boehringer Mannheim公司；T4 DNA ligase，限制性内切酶dNTP，逆转录酶(M-MLV)等均购自GLBCO/BRL公司。电穿孔仪为Bio-RAD E.Coli Pulser；PCR扩增仪为PE2400型；PEG/NaCl 溶液：20%PEG8000，9%NaCl；SOB、LB、2×YT培养基按《分子克隆》配制，含葡萄糖(Glucose, G)培养基中G浓度均为100 mmol/L；抗生素培养基中氨苄青霉素(Ampicillin,A)为 100 μg/ml，卡那霉素(Kanamycin,K)：50 μg/ml；四环素(Tetracycline，T)：10 μg/ml。其余试剂均为分析纯。
1.4 VH及Vκ cDNA的克隆 RNA的提取：从107参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA[2]脾细胞。逆转录PCR(RT-PCR)：以脾细胞总RNA为模板，用PH2和PL2引物，分别逆转录合成VH和Vκ cDNA第一链。逆转录条件：5×第一链缓冲液10 μ1，RNA样品10 μg，M-MLV 2 μ1(200 U)，RNasin 40 U，dNTP 终浓度为 300 μmol/L，引物30 pmo1，加无RNase H2O至总体积50 μ1，37°C保温1 h。以逆转录产物为模板，PH1/PH2和PL1/PL2为引物，分别PCR扩增全套VH和Vκ基因片段。PCR 反应程序为：97°C预变性2 min，继以94°C变性30 s，60°C退火45 s，72°C延伸1 min，共30个循环。取5 μ1 PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。
, http://www.100md.com
1.5 scFv文库的构建
1.5.1 Vκ亚文库的构建 BamHI和Mlul双酶切经低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化的VκPCR产物，回收此酶切产物后与经同样酶切和纯化的载体pSEX81片段连接，电穿孔转化XL1-Blue，SOBGA培养板扩增转化的细菌(30°C过夜培养)，提取质粒得到轻链亚文库(pSEX81-Vκ)。
1.5.2 将VH克隆入pSEX81-Vκ亚文库，获得完整的scFv文库 将HindⅢ和PvuII双酶切的VHPCR产物和经同样酶切反应的pSEX81-Vk质粒DNA连接，电转化XL1-Blue，取少部分转化细菌铺LBGA平板，计数菌落，测定库容后，其余同上述方法扩增得到完整的噬菌体scFv文库，甘油保存备用。取一部分悬于10 ml 2×YTGA培养基中使OD600＝0.8，加入8×1011pfu(感染复数moi为20)的M13KO7，37°C温育90 min，离心沉淀感染的细胞并重悬于15 ml 2×YTAKT中37°C培养5～8 h，离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体，冰浴至少30 min后，10 000 r/min 4°C离心20 min，以2 ml含1%BSA的PBS重悬沉淀，13 000 r/min离心5 min收集上清即为噬菌体scFv表达展示文库。
, http://www.100md.com
1.6 scFv展示文库的初步鉴定
1.6.1 滴度测定 将10 μl经适当稀释的噬菌体scFv文库与100 μl的XL1-Blue菌(OD600＝1)室温放置15 min后铺LBGA培养板，37°C过夜，计数菌落，计算菌落形成单位(cfu)。
1.6.2 多样性分析 随机挑取文库单个克隆提取质粒后进行BstN1酶切消化，分析酶切图谱。
1.7 用KGla筛选噬菌体展示scFv文库 取PBS洗涤的3×106KGla细胞，含2%BSA的PBS冰浴90 min，沉淀细胞后，用scFv文库噬菌体上清(滴度约2×1011)重悬细胞，4°C轻摇2 h，PBS洗5次后加入500 μ1洗脱液(0.1 mol/L甘氨酸/HCl，pH＝2.5，含0.1%BSA)，冰浴5 min后沉淀细胞，立即加入20 μ1 1 mol/L的Tris中和，加入10 ml OD600＝0.8的XL1-Blue 37°C静置1 h，离心后1 ml SOBGA重悬细胞沉淀，全部铺于SOBGA培养板。再按1.5.2的程序进行辅助噬菌体感染和PEG沉淀，所得经KGla细胞筛选后的噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选，同样方法筛选4轮。
, 百拇医药
1.8 随机挑选单个克隆进行KGla细胞筛选后次级库的检验 限制性内切酶分析和PCR扩增鉴定scFv的重组率。同1.5.2方法用辅助噬菌体超感染制备噬菌体抗体上清，经PEG/NaCl沉淀、重溶后，还原条件下行SDS-PAGE，以M13KO7为阴性对照，携带并能展示抗PHOX scFv的pSEX81-PHOX为阳性对照，噬菌体的上样量为1013～14pfu，电泳后硝酸银染色。
2 结果
2.1 噬菌体scFv文库的构建和鉴定 RT-PCR扩增获得大小分别为399和357 bp的VH和Vκ基因(图1)，先后克隆到噬菌粒载体pSEX81相应的酶切位点中(图2)，电穿孔转化XL1-Blue细菌，库容为3×106cfu。M13KO7超感染得到噬菌体展示scFv文库，经测定所获文库滴度为1012cfu。随机挑取文库的多个单克隆进行BstN1酶切消化，结果呈现多样的酶切图谱(图3)。
, 百拇医药
图1 VH和Vκ的PT-PCR扩增产物
Fig.1 RT-PCR amplification of VH and Vκ gene
Note:M.PBR322/Hinf1 marker；1. PCR product of Vκ；2.PCR product of VH
图2 scFv噬菌体展示载体pSEX81示意图
Fig.2 pSEX81 vector for constructing the scFv library
图3 单克隆的BstN1酶切图谱
, 百拇医药
Fig.3 BstN1 fingerprinting of individual clones
Note:M.PCR marker；1～10.Individual clones
2.2 KGla细胞筛选后次级库的检验 随机挑选次级库的多个单克隆内切酶图谱分析(结果未示)和PCR扩增结果示scFv片段插入重组率达100%(图4)。
图4 筛选后的单克隆的PCR鉴定结果
Fig.4 Identification of selected individual recombinant clones by
PCR recombinant clones by PCR
, http://www.100md.com
Note:M.PBR332/Hinfl marker；1～11.Individual recombinant clones
scFv在噬菌体表面表达的检测 SDS-PAGE结果显示随机挑选的多个单克隆均有scFv+PⅢ融合蛋白在噬菌体表面的展示表达。PⅢ是噬菌体次要衣壳蛋白，scFv与PⅢN端展示于噬菌体的表面，融合蛋白在电泳中的表观分子量约为100 kD，与阳性对照相同，而阴性对照则没有此电泳条带。由于PⅢ分子量为42.1 kD，而实际电泳移率为55～70 kD[3]，使得预计分子量为85 kD的scFv+PⅢ，在电泳中的表观分子量为100 kD(图5)。
图5 SDS-PAGE(10%)电泳检测筛选后单克隆的表达(图谱)
Fig.5 SDS-PAGE electrophoretogram of the expression production
, http://www.100md.com
of the selected individual recombinant clones
Note:1.Protein molecular weight marker；2.M13K07 phage (negative control)；
3.pSEX81-PHOX (positive control)；4～8.recombinant individual clones
3 讨论
噬菌体展示抗体库技术是近年来发展较快的制备单克隆抗体的有效手段，尤其可直接克隆抗体可变区基因以利于进一步构建在疾病的诊断和靶向治疗方面具有广阔应用前景的各种基因工程抗体。
本文采用噬菌体展示抗体库技术，从人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫的小鼠脾细胞mRNA扩增得到全套抗体可变区基因片段，将其克隆入噬菌体呈示载体pSEX81，构建了抗KGla细胞表面分子的scFv表达文库，文库容量、多样性、滴度及表达能力均能满足进一步筛选目的抗体基因的要求。引物的设计是构建文库的关键，本文根据Kabat database，参考了Dübel报道的适于扩增大鼠和小鼠VH和VL的单一通用引物[4]，并结合我们在从杂交瘤细胞中克隆抗体可变区cDNA的经验[5，6]，选择了免疫球蛋白重链和轻链恒定区起始段各7个氨基酸残基密码子为3’引物互补区，其5’引物则同源于VH和VL的FR1区N端第1～8个氨基酸残基密码子并采用简并引物形式以期尽可能地扩增出多样的抗体基因。结果表明我们设计的引物达到了预期的目标。由于小鼠轻链95%以上为κ链，我们扩增VL时只使用了适于κ轻链的引物，因此本文库均为VH-Vκ单链。
, 百拇医药
KGla是人髓系白血病细胞系，细胞表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子，这些细胞表面分子抗体基因的分离和抗体的制备具有重要的理论和临床应用价值，例如针对白血病分化抗原的各种单克隆抗体已在白血病分型诊断中不可缺少，其中抗CD34单抗在造血干/祖细胞的分离、扩增和移植中更是发挥了重要的作用[7]，抗CD33单抗在经过基因工程改造后成为CD33阳性白血病靶向治疗的药物递呈分子[8]。由于KGla细胞分化程
度很低，被认为是造血干/祖细胞系，其表面很可能存在许多尚未发现的细胞因子受体或与干细胞迁移和归巢有关的粘附分子，抗KGla细胞表面分子抗体库的建立将不仅为其表面已知抗原分子新的抗体基因的分离，而且还为其表面未知分子及其抗体的发现提供了必要的基础。
作者简介：隋建华，女，27岁，博士生；
宋增璇，女，63岁，研究员，博士生导师，主要从事造血调控和基因工程抗体研究
, 百拇医药
张丽艳(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
沈德诚(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
韩忠朝(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
参考文献
1，Winter G, Griffiths A D, Hawkins B E et al. Making antibody by phage display technology.Annu Rev Immunol, 1994；12：433
2，Chomozynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chlororform extraction.Anal Biochem, 1987；162(1)：156
, 百拇医药
3，Goldsmith M E, Kinigsberg W H. Absorption protein of the bacteriophage fd:isolation.molecular properties and location in the virus. Biochemistry，1977；16：2686
4，Dübel S, Breitling F, Fuchs P et al.Isolation of IgG antibody Fv-DNA from various mouse and rat hybridoma cell lines using the polymerase chain reaction with a simple set of primers. J Imm Meth,1994,175：89
5，宋增璇，蔡英林，宋丹英 et al.抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆和表达.中华血液学杂志，1997；18(5)：311
, 百拇医药
6，Zengxuan S,Yinglin C, Danying S et al. Primary structure and functional expression of heavy- and light-chain variable region genes of a monoclonal antibody specific for human fibrin. Hybridoma ,1997；16(3)：235
7，Scheding S, Kratz-Albers K, Meister B et al.Ex-vivo expansion of hematopoietic progenitorcells for clinical use. Semin Hematol, 1998；35(3)：232
8，Co M S,Scheinberg D A,Avdalovic N M et al. Genetically engineered deglysylation of the variable domain increase the affinity of an anti-CD33monoclonal antibody. Molecular Immunology, 1993；30：1361
收稿1999-04-26 修回1999-07-05, http://www.100md.com
单位：隋建华(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)；宋增璇(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)；佘鸣(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
关键词：Kgla；噬菌体展示；抗体库；scFv
中国免疫学杂志000612 摘 要 目的：用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库。方法：用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠，取其脾细胞，RT-PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体，构建scFv文库，并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性。用KGla作为固相抗原，进行四轮吸附-洗脱-富集的筛选，SDS-PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达。结果：文库的库容为3×106cfu，单个克隆的BstN1 Ⅰ酶切图谱显示多样，提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要，筛选后的文库能很好地表达外源scFv。结论：文库的构建为进一步地分离KGla细胞表面分子抗体基因提供了必要而可靠的基础。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.11
The construction and expression of phage display scFv library from the spleen cells of mice immunized with KGla cells
SUI Jian-Hua, SONG Zeng-Xuan,SHE Ming et al
(Institute of Hematolgy, Chinese Academy of Medical Science & Reking Union Medical College, Tianjin 300020)
Abstract Objective:To construct a scFv library by phage display technique from the spleen cells of mice immunized with KGla cells. Methods: Three mice were immunized with KGla cells, and their spleen cells were harvested. The genes of VH and Vκ were amplified by RT-PCR and a scFv-phage display antibody library was constructed with the amplified V gene. The library was selected by using the KGla cells as panning antigen by 4 rounds of binding-elution-enrichment procedure, and the expression of the library were examined by SDS-PAGE. Results: We were able to produce a scFv library containing 3×106individual clones which showed different patterns after digested with restriction endonuclease BstN I. It indicated that the capacity and diversity of the library is sufficient for screening specific scFv.The surface display expression of the library was also verified. Conclusion: A scFv library of anti-KGla cell surface molecules has been constructed. It will be useful for isolating specific scFv against the cell surface molecules of hematopoietic progenitors.
, 百拇医药
Key words KGla Phage display Antibody library scFv
单链抗体(single chain antibody, scFv)是抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)由一个连接肽首尾相连组成的单一肽链，具有分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等优点。噬菌体展示抗体库技术是继杂交瘤技术之后抗体技术发展的又一新的里程碑[1]。该技术是将抗体可变区基因与单链丝状噬菌体衣壳蛋白基因融合，使scFv或Fab段可随衣壳蛋白一起呈示表达于噬菌体的表面，通过简便的吸附-洗脱-富集的筛选过程，而分离获得特异性抗体可变区基因的新技术。人髓系白血病细胞系KGla细胞表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子，分离这些细胞表面分子的特异性抗体基因具有重要意义。本文报道从KGla细胞免疫小鼠的脾细胞建立scFv噬菌体展示文库，为进一步获得抗造血细胞表面分子的抗体奠定必要的基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 小鼠免疫 用1×107的人髓系白血病细胞系KGla细胞，腹腔注射免疫3只8周龄的雄性BALB/c小鼠，3次免疫后取脾脏混合，分离脾淋巴细胞。
1.2 PCR引物 设计VH和VL引物，采用简并引物形式，并在5＇ 端加有克隆入载体的酶切位点。5＇ 端引物均位于小鼠抗体可变区的第一骨架区共有序列(FR1)，3＇ 端引物均位于恒定区起始段。引物序列如下：PH1(γ重链VH5＇ 端引物，35 bp)：5＇-GGACTAGTTGAA(G)GTA(C，G，T)CAGCTGCAGCAA(G)TCA(C，G，T)GGA(C)GC-3＇。PH2(γ重链VH3′端引物，38 bp)：5′-CCAGGGGCCAGTGGGAATTCAAGCTTGGGTGTGTCGTTTT-3’PL1(K轻链5＇端引物33 bp)：5＇-CGACGCGTAGATATCGTC(G)CTC(G，T)ACA(C，T)CAA (G)TCA (C，G，T)CCA-3＇。PL2(K轻链Vκ 3＇ 端引物，27 bp)：5＇-GATGGATCCAG(C)TTGGTGCAGCAT(A)CAGC-3＇。
, 百拇医药
1.3 载体、菌株及主要材料与试剂 噬菌粒pSEX81和pSEX81-PHOX由德国海德堡大学Dübel博士惠赠。大肠杆菌XL1-Blue和辅助噬菌体M13KO7为本室保存。Taq DNA 聚合酶购自Boehringer Mannheim公司；T4 DNA ligase，限制性内切酶dNTP，逆转录酶(M-MLV)等均购自GLBCO/BRL公司。电穿孔仪为Bio-RAD E.Coli Pulser；PCR扩增仪为PE2400型；PEG/NaCl 溶液：20%PEG8000，9%NaCl；SOB、LB、2×YT培养基按《分子克隆》配制，含葡萄糖(Glucose, G)培养基中G浓度均为100 mmol/L；抗生素培养基中氨苄青霉素(Ampicillin,A)为 100 μg/ml，卡那霉素(Kanamycin,K)：50 μg/ml；四环素(Tetracycline，T)：10 μg/ml。其余试剂均为分析纯。
1.4 VH及Vκ cDNA的克隆 RNA的提取：从107参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA[2]脾细胞。逆转录PCR(RT-PCR)：以脾细胞总RNA为模板，用PH2和PL2引物，分别逆转录合成VH和Vκ cDNA第一链。逆转录条件：5×第一链缓冲液10 μ1，RNA样品10 μg，M-MLV 2 μ1(200 U)，RNasin 40 U，dNTP 终浓度为 300 μmol/L，引物30 pmo1，加无RNase H2O至总体积50 μ1，37°C保温1 h。以逆转录产物为模板，PH1/PH2和PL1/PL2为引物，分别PCR扩增全套VH和Vκ基因片段。PCR 反应程序为：97°C预变性2 min，继以94°C变性30 s，60°C退火45 s，72°C延伸1 min，共30个循环。取5 μ1 PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。
, http://www.100md.com
1.5 scFv文库的构建
1.5.1 Vκ亚文库的构建 BamHI和Mlul双酶切经低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化的VκPCR产物，回收此酶切产物后与经同样酶切和纯化的载体pSEX81片段连接，电穿孔转化XL1-Blue，SOBGA培养板扩增转化的细菌(30°C过夜培养)，提取质粒得到轻链亚文库(pSEX81-Vκ)。
1.5.2 将VH克隆入pSEX81-Vκ亚文库，获得完整的scFv文库 将HindⅢ和PvuII双酶切的VHPCR产物和经同样酶切反应的pSEX81-Vk质粒DNA连接，电转化XL1-Blue，取少部分转化细菌铺LBGA平板，计数菌落，测定库容后，其余同上述方法扩增得到完整的噬菌体scFv文库，甘油保存备用。取一部分悬于10 ml 2×YTGA培养基中使OD600＝0.8，加入8×1011pfu(感染复数moi为20)的M13KO7，37°C温育90 min，离心沉淀感染的细胞并重悬于15 ml 2×YTAKT中37°C培养5～8 h，离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体，冰浴至少30 min后，10 000 r/min 4°C离心20 min，以2 ml含1%BSA的PBS重悬沉淀，13 000 r/min离心5 min收集上清即为噬菌体scFv表达展示文库。
, http://www.100md.com
1.6 scFv展示文库的初步鉴定
1.6.1 滴度测定 将10 μl经适当稀释的噬菌体scFv文库与100 μl的XL1-Blue菌(OD600＝1)室温放置15 min后铺LBGA培养板，37°C过夜，计数菌落，计算菌落形成单位(cfu)。
1.6.2 多样性分析 随机挑取文库单个克隆提取质粒后进行BstN1酶切消化，分析酶切图谱。
1.7 用KGla筛选噬菌体展示scFv文库 取PBS洗涤的3×106KGla细胞，含2%BSA的PBS冰浴90 min，沉淀细胞后，用scFv文库噬菌体上清(滴度约2×1011)重悬细胞，4°C轻摇2 h，PBS洗5次后加入500 μ1洗脱液(0.1 mol/L甘氨酸/HCl，pH＝2.5，含0.1%BSA)，冰浴5 min后沉淀细胞，立即加入20 μ1 1 mol/L的Tris中和，加入10 ml OD600＝0.8的XL1-Blue 37°C静置1 h，离心后1 ml SOBGA重悬细胞沉淀，全部铺于SOBGA培养板。再按1.5.2的程序进行辅助噬菌体感染和PEG沉淀，所得经KGla细胞筛选后的噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选，同样方法筛选4轮。
, 百拇医药
1.8 随机挑选单个克隆进行KGla细胞筛选后次级库的检验 限制性内切酶分析和PCR扩增鉴定scFv的重组率。同1.5.2方法用辅助噬菌体超感染制备噬菌体抗体上清，经PEG/NaCl沉淀、重溶后，还原条件下行SDS-PAGE，以M13KO7为阴性对照，携带并能展示抗PHOX scFv的pSEX81-PHOX为阳性对照，噬菌体的上样量为1013～14pfu，电泳后硝酸银染色。
2 结果
2.1 噬菌体scFv文库的构建和鉴定 RT-PCR扩增获得大小分别为399和357 bp的VH和Vκ基因(图1)，先后克隆到噬菌粒载体pSEX81相应的酶切位点中(图2)，电穿孔转化XL1-Blue细菌，库容为3×106cfu。M13KO7超感染得到噬菌体展示scFv文库，经测定所获文库滴度为1012cfu。随机挑取文库的多个单克隆进行BstN1酶切消化，结果呈现多样的酶切图谱(图3)。
, 百拇医药
图1 VH和Vκ的PT-PCR扩增产物
Fig.1 RT-PCR amplification of VH and Vκ gene
Note:M.PBR322/Hinf1 marker；1. PCR product of Vκ；2.PCR product of VH
图2 scFv噬菌体展示载体pSEX81示意图
Fig.2 pSEX81 vector for constructing the scFv library
图3 单克隆的BstN1酶切图谱
, 百拇医药
Fig.3 BstN1 fingerprinting of individual clones
Note:M.PCR marker；1～10.Individual clones
2.2 KGla细胞筛选后次级库的检验 随机挑选次级库的多个单克隆内切酶图谱分析(结果未示)和PCR扩增结果示scFv片段插入重组率达100%(图4)。
图4 筛选后的单克隆的PCR鉴定结果
Fig.4 Identification of selected individual recombinant clones by
PCR recombinant clones by PCR
, http://www.100md.com
Note:M.PBR332/Hinfl marker；1～11.Individual recombinant clones
scFv在噬菌体表面表达的检测 SDS-PAGE结果显示随机挑选的多个单克隆均有scFv+PⅢ融合蛋白在噬菌体表面的展示表达。PⅢ是噬菌体次要衣壳蛋白，scFv与PⅢN端展示于噬菌体的表面，融合蛋白在电泳中的表观分子量约为100 kD，与阳性对照相同，而阴性对照则没有此电泳条带。由于PⅢ分子量为42.1 kD，而实际电泳移率为55～70 kD[3]，使得预计分子量为85 kD的scFv+PⅢ，在电泳中的表观分子量为100 kD(图5)。
图5 SDS-PAGE(10%)电泳检测筛选后单克隆的表达(图谱)
Fig.5 SDS-PAGE electrophoretogram of the expression production
, http://www.100md.com
of the selected individual recombinant clones
Note:1.Protein molecular weight marker；2.M13K07 phage (negative control)；
3.pSEX81-PHOX (positive control)；4～8.recombinant individual clones
3 讨论
噬菌体展示抗体库技术是近年来发展较快的制备单克隆抗体的有效手段，尤其可直接克隆抗体可变区基因以利于进一步构建在疾病的诊断和靶向治疗方面具有广阔应用前景的各种基因工程抗体。
本文采用噬菌体展示抗体库技术，从人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫的小鼠脾细胞mRNA扩增得到全套抗体可变区基因片段，将其克隆入噬菌体呈示载体pSEX81，构建了抗KGla细胞表面分子的scFv表达文库，文库容量、多样性、滴度及表达能力均能满足进一步筛选目的抗体基因的要求。引物的设计是构建文库的关键，本文根据Kabat database，参考了Dübel报道的适于扩增大鼠和小鼠VH和VL的单一通用引物[4]，并结合我们在从杂交瘤细胞中克隆抗体可变区cDNA的经验[5，6]，选择了免疫球蛋白重链和轻链恒定区起始段各7个氨基酸残基密码子为3’引物互补区，其5’引物则同源于VH和VL的FR1区N端第1～8个氨基酸残基密码子并采用简并引物形式以期尽可能地扩增出多样的抗体基因。结果表明我们设计的引物达到了预期的目标。由于小鼠轻链95%以上为κ链，我们扩增VL时只使用了适于κ轻链的引物，因此本文库均为VH-Vκ单链。
, 百拇医药
KGla是人髓系白血病细胞系，细胞表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子，这些细胞表面分子抗体基因的分离和抗体的制备具有重要的理论和临床应用价值，例如针对白血病分化抗原的各种单克隆抗体已在白血病分型诊断中不可缺少，其中抗CD34单抗在造血干/祖细胞的分离、扩增和移植中更是发挥了重要的作用[7]，抗CD33单抗在经过基因工程改造后成为CD33阳性白血病靶向治疗的药物递呈分子[8]。由于KGla细胞分化程
度很低，被认为是造血干/祖细胞系，其表面很可能存在许多尚未发现的细胞因子受体或与干细胞迁移和归巢有关的粘附分子，抗KGla细胞表面分子抗体库的建立将不仅为其表面已知抗原分子新的抗体基因的分离，而且还为其表面未知分子及其抗体的发现提供了必要的基础。
作者简介：隋建华，女，27岁，博士生；
宋增璇，女，63岁，研究员，博士生导师，主要从事造血调控和基因工程抗体研究
, 百拇医药
张丽艳(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
沈德诚(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
韩忠朝(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津300020)
参考文献
1，Winter G, Griffiths A D, Hawkins B E et al. Making antibody by phage display technology.Annu Rev Immunol, 1994；12：433
2，Chomozynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chlororform extraction.Anal Biochem, 1987；162(1)：156
, 百拇医药
3，Goldsmith M E, Kinigsberg W H. Absorption protein of the bacteriophage fd:isolation.molecular properties and location in the virus. Biochemistry，1977；16：2686
4，Dübel S, Breitling F, Fuchs P et al.Isolation of IgG antibody Fv-DNA from various mouse and rat hybridoma cell lines using the polymerase chain reaction with a simple set of primers. J Imm Meth,1994,175：89
5，宋增璇，蔡英林，宋丹英 et al.抗人纤维蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆和表达.中华血液学杂志，1997；18(5)：311
, 百拇医药
6，Zengxuan S,Yinglin C, Danying S et al. Primary structure and functional expression of heavy- and light-chain variable region genes of a monoclonal antibody specific for human fibrin. Hybridoma ,1997；16(3)：235
7，Scheding S, Kratz-Albers K, Meister B et al.Ex-vivo expansion of hematopoietic progenitorcells for clinical use. Semin Hematol, 1998；35(3)：232
8，Co M S,Scheinberg D A,Avdalovic N M et al. Genetically engineered deglysylation of the variable domain increase the affinity of an anti-CD33monoclonal antibody. Molecular Immunology, 1993；30：1361
收稿1999-04-26 修回1999-07-05, http://www.100md.com