从健康人外周血中建立异种抗原特异性的T细胞系初探
作者：谢晋 李宁丽 张冬青 沈佰华 周光炎
单位：谢晋(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；李宁丽(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；张冬青(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；沈佰华(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；周光炎(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)
关键词：异种细胞抗原；异种移植；T细胞系
中国免疫学杂志000611 摘 要 目的：为了探讨异种器官移植中T细胞参与的免疫排斥机理，从健康人外周血中试行建立识别猪淋巴细胞抗原特异性的T细胞系方法研究。方法：通过照光致弱的猪外周血单个核细胞反复刺激人的T淋巴细胞，3H-TdR掺入法筛选特异性增殖的T细胞。结果：获得2株为TCRαβ+ CD3+CD8+细胞，另1株为TCRαβ+ CD3+CD4+细胞。结论：健康人外周血中有识别异种抗原特异性的T细胞系，但出现频率较低。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.4
The generation of xeno-antigen specific T lymphocyte lines
XIE Jin, LI Ning-Li, ZHANG Dong-Qing et al
(Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Immunology，Shanghai 200025)
Abstract Objective: In order to study the mechanism of T lymphocytes immune rejection in xenotransplantation,the authors construct a method of xeno-antigen specific T cell lines.Methods:Human T cell was restimulated by irradiated porcine periphery blood monocyte every other two weeks, and selected by 3 H-thymidine incorporation.Results:Two of the T cell lines are TCR α β CD3CD8 positive, the other is almost shared in TCRαβ+ CD3+CD4+ ; but NKT cells (CD3+CD56+) are found in the three T cell lines.Conclusions:The frequency which the T cell lines specially recognized xen-antigen was very low in normal human peripheral blood.
, 百拇医药
Key words Xeno-antigen Xenotranplantation T cell lines
体外建立抗原特异性T淋巴细胞克隆或细胞系研究T细胞分化发育及其参与的免疫应答具有重要意义。尤其在研究T细胞对抗原识别中的MHC限制性，分析T细胞表位及T细胞克隆特性(Clonality)方面尤为可行[1,2]。本文报道应用猪的外周血单个核细胞作抗原，从健康人外周血中成功地建立3株特异性T细胞系，其分化抗原表型为TCRαβ+ CD3+CD4+ 或TCRαβ+ CD3+CD8+，并对猪细胞抗原表现出良好的应答特异性。
1 材料与方法
1.1 外周血单个核细胞的分离 HLA.A2阳性健康人和中国广西小型猪(中国科学院上海实验动物中心)的外周血各20 ml，肝素抗凝，Ficoll(1.077)分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤3次，少量的红细胞用ACK(155 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,110 mmol/L EDTA,pH7.3)裂解，再洗涤3次，用含谷胺酰胺2 mmol/L、丙酮酸钠10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、5%人AB血清的RPMI-1640培养液调整人和猪PBMC至1×106 ml-1，备用。
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1.2 T细胞建系 建立异种抗原特异性T细胞系采用标准的半有限稀释法[3-5]，简述如下。
初次培养：用5%自体血清的RPMI-1640调整人和猪细胞至1×106 ml-1，人PBMC加入96孔‘U’型板(Nunc,丹麦)，100 μl/孔，猪PBMC经3 000 rad辐照作刺激细胞(100 μl/孔)。37℃、5%CO2、培养3 d后，弃100 μl上清，同时加入含IL-2(20 U/ml)的新鲜RPMI-1640 100 μl，以后每隔2 d换液1次，直至14 d。
异种抗原特异性T细胞出现频率分析：第15天完全弃去含IL-2的营养液，加入不含IL-2的RPMI-1640每孔150 μl至初次培养的T细胞中，将细胞悬液均分入3孔中，同时在3孔中加入2×105抗原递呈细胞(APC)(即经3 000 rad辐照后的来源同一个体的PBMC)，在这3孔中，一孔不加刺激细胞，作为对照组；另两孔加刺激细胞，分别为试验组与备份组。APC和刺激细胞每孔各加50 μl(2×106 ml-1)，培养72 h，培养终止前18 h加1 μCi[3H]thymidine(上海原子核研究所)，收集试验组与对照组细胞，β液闪仪测定cpm值。计算刺激指数SI≥3孔数，统计异种抗原特异性T细胞频率。并且挑选刺激指数SI≥3的备份组细胞至新板中，继续培养，用含IL-2 的RPMI-1640每隔2 d换液一次，至28 d。
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再刺激与异种抗原特异性分析：第29天，收集同一孔来源细胞，调整细胞浓度至1.6×106 ml-1(50 μl/孔)，再用猪细胞刺激，筛选SI≥3备份组细胞为异种抗原特异性T细胞，方法同异种抗原特异性T细胞出现频率分析。根据细胞长势扩增细胞，待细胞达到一定量时进行细胞表型鉴定。
1.3 表型鉴定 荧光标记鼠抗人系列单抗CD3-FITC/CD56-PE、TCRγδ-FITC/TCRαβ-PE、CD4-FITC/CD8-PE、鼠IgGγ1-FITC/γ2-PE对照抗体均来自B.D.Comp，IL-2(Boerhringer Mannheim)。
收集细胞(5×105/管)，分别加CD3/CD56、TCRγδ/TCRαβ、CD4/CD8、鼠IgGγ1/γ2对照抗体，混匀，4℃，30 min，PBS(1%小牛血清)洗涤3次，2%多聚甲醛固定，进行流式细胞仪检测。
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2 结果
2.1 异种抗原特异性T淋巴系频率分析 用γ射线辐照致弱的猪淋巴细胞再次刺激初次培养人淋巴细胞后，经3H-TdR掺入试验分析筛选SI≥3(表1)为阳性反应细胞。本试验中60孔细胞共筛选出 4孔细胞阳性细胞，故异种抗原特异性T细胞频率为6.67%。
表1 特异性T细胞频率(即第2次刺激数值)
Tab.1 Specific T cells frequency T cell lines
Control(cpm)
Positive(cpm)
SI(positive/control)
, 百拇医药 A
4 624
57 374
12.4
B
9 724
66 392
6.8
C
5 820
17 526
3.0
D
, 百拇医药
6 076
46 462
7.6
2.2 异种抗原特异性分析 培养29 d时，用γ射线辐照致弱的猪淋巴细胞再次刺激阳性T细胞，经3H-TdR掺入试验分析筛选SI≥3，得到3株特异性针对刺激细胞增殖的T细胞(表2)。因为其中异种抗原特异性T细胞出现频率中SI=3的‘C’细胞株，逐渐失去抗原特异性增殖的能力。另3株特异性T细胞(A,B,D)能在体外长期不断扩增增殖，此为异种抗原特异性T细胞。
表2 异种抗原特异性(即第3次刺激数值)
Tab.2 Xeno-antigen specific T cell lines T cell lines
Control(cpm)
, http://www.100md.com
Positive(cpm)
SI(positive/control)
A
10 275±2 748
34 044±3 874
3.3
B
1 184±327
7 283±1 517
6.2
C
8 278±741
, 百拇医药
15 586±3 199
1.9
D
5 307±1391
15 825±2 289
3.0
2.3 T细胞系表型分析 用流式细胞仪分析3株T细胞系(A,B,D)表型(表3)，结果表明：第一，全部为TCRαβ阳性；第二，两株为CD8(>90%)阳性，一株为CD4(>64%)为主；第三，单独NK细胞标记(CD56)阳性细胞小于1%，而CD3+CD56+双阳性细胞比例相对较高，介于25%至54%之间。
表3 T细胞系表型(%)
, 百拇医药
Tab.3 T cells phenotype(%) T cell lines
CD3+
CD4+
CD8+
CD3-CD56+
CD3+CD56+
TCRαβ
TCRγδ
A
98.50
71.99
, 百拇医药
28.99
0.37
28.43
99.47
2.69
B
98.81
0.51
91.84
0.10
25.41
93.12
1.83
, http://www.100md.com
D
99.92
1.52
89.77
0.05
53.45
98.46
4.67
3 讨论
由于抗原分为可溶性抗原和细胞抗原，因此建立T细胞克隆或系的方法很多，原理是用抗原反复刺激与筛选抗原特异性的T细胞。这种体外建立抗原特异性T细胞系的方法在抗原诱发的免疫机理研究中十分重要。为了深入研究异种移植的细胞性排斥机理，我们用异种细胞作为刺激抗原，在体外反复刺激健康人外周血T细胞，经3H-TdR掺入法筛选得到特异性增殖的T细胞。本试验中建立的特异性T细胞株中有部分呈NK细胞表面标记(CD3+CD56+)，称NK样T细胞(NKT)。体内，该类细胞在骨髓含量较高，是不成熟的细胞；发育成熟后，在外周血中，NKT细胞量很少，几乎检测不出[6]。有关抗原特异性T细胞株和NK T细胞生理学功能正在进一步研究。
, http://www.100md.com
建立T细胞系的技术要点是：首先，在第1次刺激时，培养基中应加自体血清以减少自身反应性T细胞增殖。第二，在第2次刺激后加入自体APC细胞很重要，抗原需经加工递呈才能进一步激活T细胞增殖反应。并且APC细胞递呈不同抗原表位，甚至优势表位都可影响T细胞增殖强度。第三，细胞抗原刺激细胞增殖强度往往弱于可溶性抗原，在细胞生长旺盛期时扩增细胞，当达到一定数量后，应立即进行细胞功能研究。最后，应用3H-TdR掺入法筛选阳性增殖T细胞是可行的，在此基础上可根据实验要求，进一步做有限稀释建立T细胞克隆。
国家自然科学基金重大项目资助(No.39993430)
作者简介：谢晋，男，28岁，博士研究生，主要从事移植免疫研究
参考文献
1，Kumagai-Braesch M, Satake M, Koregren O et al. Characterization of cellular human anti-porcine xenoreactivity. Clin Transpl， 1993；7:273
, http://www.100md.com
2，Yamada K, Sachs D H, Dersimonian H. Human anti-porcine xenogeneic T cell response: Evidence for allelic specificity of mixed leukocyte reaction
and for both direct and indirect pathways of recognition. J Immunol， 1995；155: 5249
3，Banerjee S, Webber C, Poole A R. The induction of arthritis in mice by the cartilage proteoglycan aggrecan: role of CD4+ and CD8+ cells. Cell Immunol, 1992；144: 347
, http://www.100md.com
4，Leroux J Y, Guerassimov A, Cartman A et al. Immunity to the G1 Globular domain of the cartilage prpteoglycan aggrecan can induce inflammatory erosive polyarthritis and spondylitis in BALB/C mice but imminity to G1 is inhibited by covaently bound keratan sulfate in vitro and in vivo. J Clin Invest, 1996；97: 621
5，Zhang Y P, Guerassinov A, Leroux J Y et al. Arthritis induced by proteoglycan aggrecn G1 domain in Balb/c mice: Evidence of T cell Involvement and the immunosuppressive influence of keratan sulfate on recognition of T and B cell Epitopes. J Clin Invest, 1998；101:1678
6，Eberl G, Robson MacDonald H. Rapid death and regeneration of NKT cells in anti-cd3ε- or IL-12-Treated mice: A major role for bone marrow in NKT cell homeostasis. Immunity，1998；9: 345
收稿1999-08-19 修回1999-11-10, http://www.100md.com
单位：谢晋(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；李宁丽(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；张冬青(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；沈佰华(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)；周光炎(上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海 200025)
关键词：异种细胞抗原；异种移植；T细胞系
中国免疫学杂志000611 摘 要 目的：为了探讨异种器官移植中T细胞参与的免疫排斥机理，从健康人外周血中试行建立识别猪淋巴细胞抗原特异性的T细胞系方法研究。方法：通过照光致弱的猪外周血单个核细胞反复刺激人的T淋巴细胞，3H-TdR掺入法筛选特异性增殖的T细胞。结果：获得2株为TCRαβ+ CD3+CD8+细胞，另1株为TCRαβ+ CD3+CD4+细胞。结论：健康人外周血中有识别异种抗原特异性的T细胞系，但出现频率较低。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.4
The generation of xeno-antigen specific T lymphocyte lines
XIE Jin, LI Ning-Li, ZHANG Dong-Qing et al
(Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Immunology，Shanghai 200025)
Abstract Objective: In order to study the mechanism of T lymphocytes immune rejection in xenotransplantation,the authors construct a method of xeno-antigen specific T cell lines.Methods:Human T cell was restimulated by irradiated porcine periphery blood monocyte every other two weeks, and selected by 3 H-thymidine incorporation.Results:Two of the T cell lines are TCR α β CD3CD8 positive, the other is almost shared in TCRαβ+ CD3+CD4+ ; but NKT cells (CD3+CD56+) are found in the three T cell lines.Conclusions:The frequency which the T cell lines specially recognized xen-antigen was very low in normal human peripheral blood.
, 百拇医药
Key words Xeno-antigen Xenotranplantation T cell lines
体外建立抗原特异性T淋巴细胞克隆或细胞系研究T细胞分化发育及其参与的免疫应答具有重要意义。尤其在研究T细胞对抗原识别中的MHC限制性，分析T细胞表位及T细胞克隆特性(Clonality)方面尤为可行[1,2]。本文报道应用猪的外周血单个核细胞作抗原，从健康人外周血中成功地建立3株特异性T细胞系，其分化抗原表型为TCRαβ+ CD3+CD4+ 或TCRαβ+ CD3+CD8+，并对猪细胞抗原表现出良好的应答特异性。
1 材料与方法
1.1 外周血单个核细胞的分离 HLA.A2阳性健康人和中国广西小型猪(中国科学院上海实验动物中心)的外周血各20 ml，肝素抗凝，Ficoll(1.077)分离单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤3次，少量的红细胞用ACK(155 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,110 mmol/L EDTA,pH7.3)裂解，再洗涤3次，用含谷胺酰胺2 mmol/L、丙酮酸钠10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、5%人AB血清的RPMI-1640培养液调整人和猪PBMC至1×106 ml-1，备用。
, http://www.100md.com
1.2 T细胞建系 建立异种抗原特异性T细胞系采用标准的半有限稀释法[3-5]，简述如下。
初次培养：用5%自体血清的RPMI-1640调整人和猪细胞至1×106 ml-1，人PBMC加入96孔‘U’型板(Nunc,丹麦)，100 μl/孔，猪PBMC经3 000 rad辐照作刺激细胞(100 μl/孔)。37℃、5%CO2、培养3 d后，弃100 μl上清，同时加入含IL-2(20 U/ml)的新鲜RPMI-1640 100 μl，以后每隔2 d换液1次，直至14 d。
异种抗原特异性T细胞出现频率分析：第15天完全弃去含IL-2的营养液，加入不含IL-2的RPMI-1640每孔150 μl至初次培养的T细胞中，将细胞悬液均分入3孔中，同时在3孔中加入2×105抗原递呈细胞(APC)(即经3 000 rad辐照后的来源同一个体的PBMC)，在这3孔中，一孔不加刺激细胞，作为对照组；另两孔加刺激细胞，分别为试验组与备份组。APC和刺激细胞每孔各加50 μl(2×106 ml-1)，培养72 h，培养终止前18 h加1 μCi[3H]thymidine(上海原子核研究所)，收集试验组与对照组细胞，β液闪仪测定cpm值。计算刺激指数SI≥3孔数，统计异种抗原特异性T细胞频率。并且挑选刺激指数SI≥3的备份组细胞至新板中，继续培养，用含IL-2 的RPMI-1640每隔2 d换液一次，至28 d。
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再刺激与异种抗原特异性分析：第29天，收集同一孔来源细胞，调整细胞浓度至1.6×106 ml-1(50 μl/孔)，再用猪细胞刺激，筛选SI≥3备份组细胞为异种抗原特异性T细胞，方法同异种抗原特异性T细胞出现频率分析。根据细胞长势扩增细胞，待细胞达到一定量时进行细胞表型鉴定。
1.3 表型鉴定 荧光标记鼠抗人系列单抗CD3-FITC/CD56-PE、TCRγδ-FITC/TCRαβ-PE、CD4-FITC/CD8-PE、鼠IgGγ1-FITC/γ2-PE对照抗体均来自B.D.Comp，IL-2(Boerhringer Mannheim)。
收集细胞(5×105/管)，分别加CD3/CD56、TCRγδ/TCRαβ、CD4/CD8、鼠IgGγ1/γ2对照抗体，混匀，4℃，30 min，PBS(1%小牛血清)洗涤3次，2%多聚甲醛固定，进行流式细胞仪检测。
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2 结果
2.1 异种抗原特异性T淋巴系频率分析 用γ射线辐照致弱的猪淋巴细胞再次刺激初次培养人淋巴细胞后，经3H-TdR掺入试验分析筛选SI≥3(表1)为阳性反应细胞。本试验中60孔细胞共筛选出 4孔细胞阳性细胞，故异种抗原特异性T细胞频率为6.67%。
表1 特异性T细胞频率(即第2次刺激数值)
Tab.1 Specific T cells frequency T cell lines
Control(cpm)
Positive(cpm)
SI(positive/control)
, 百拇医药 A
4 624
57 374
12.4
B
9 724
66 392
6.8
C
5 820
17 526
3.0
D
, 百拇医药
6 076
46 462
7.6
2.2 异种抗原特异性分析 培养29 d时，用γ射线辐照致弱的猪淋巴细胞再次刺激阳性T细胞，经3H-TdR掺入试验分析筛选SI≥3，得到3株特异性针对刺激细胞增殖的T细胞(表2)。因为其中异种抗原特异性T细胞出现频率中SI=3的‘C’细胞株，逐渐失去抗原特异性增殖的能力。另3株特异性T细胞(A,B,D)能在体外长期不断扩增增殖，此为异种抗原特异性T细胞。
表2 异种抗原特异性(即第3次刺激数值)
Tab.2 Xeno-antigen specific T cell lines T cell lines
Control(cpm)
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Positive(cpm)
SI(positive/control)
A
10 275±2 748
34 044±3 874
3.3
B
1 184±327
7 283±1 517
6.2
C
8 278±741
, 百拇医药
15 586±3 199
1.9
D
5 307±1391
15 825±2 289
3.0
2.3 T细胞系表型分析 用流式细胞仪分析3株T细胞系(A,B,D)表型(表3)，结果表明：第一，全部为TCRαβ阳性；第二，两株为CD8(>90%)阳性，一株为CD4(>64%)为主；第三，单独NK细胞标记(CD56)阳性细胞小于1%，而CD3+CD56+双阳性细胞比例相对较高，介于25%至54%之间。
表3 T细胞系表型(%)
, 百拇医药
Tab.3 T cells phenotype(%) T cell lines
CD3+
CD4+
CD8+
CD3-CD56+
CD3+CD56+
TCRαβ
TCRγδ
A
98.50
71.99
, 百拇医药
28.99
0.37
28.43
99.47
2.69
B
98.81
0.51
91.84
0.10
25.41
93.12
1.83
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D
99.92
1.52
89.77
0.05
53.45
98.46
4.67
3 讨论
由于抗原分为可溶性抗原和细胞抗原，因此建立T细胞克隆或系的方法很多，原理是用抗原反复刺激与筛选抗原特异性的T细胞。这种体外建立抗原特异性T细胞系的方法在抗原诱发的免疫机理研究中十分重要。为了深入研究异种移植的细胞性排斥机理，我们用异种细胞作为刺激抗原，在体外反复刺激健康人外周血T细胞，经3H-TdR掺入法筛选得到特异性增殖的T细胞。本试验中建立的特异性T细胞株中有部分呈NK细胞表面标记(CD3+CD56+)，称NK样T细胞(NKT)。体内，该类细胞在骨髓含量较高，是不成熟的细胞；发育成熟后，在外周血中，NKT细胞量很少，几乎检测不出[6]。有关抗原特异性T细胞株和NK T细胞生理学功能正在进一步研究。
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建立T细胞系的技术要点是：首先，在第1次刺激时，培养基中应加自体血清以减少自身反应性T细胞增殖。第二，在第2次刺激后加入自体APC细胞很重要，抗原需经加工递呈才能进一步激活T细胞增殖反应。并且APC细胞递呈不同抗原表位，甚至优势表位都可影响T细胞增殖强度。第三，细胞抗原刺激细胞增殖强度往往弱于可溶性抗原，在细胞生长旺盛期时扩增细胞，当达到一定数量后，应立即进行细胞功能研究。最后，应用3H-TdR掺入法筛选阳性增殖T细胞是可行的，在此基础上可根据实验要求，进一步做有限稀释建立T细胞克隆。
国家自然科学基金重大项目资助(No.39993430)
作者简介：谢晋，男，28岁，博士研究生，主要从事移植免疫研究
参考文献
1，Kumagai-Braesch M, Satake M, Koregren O et al. Characterization of cellular human anti-porcine xenoreactivity. Clin Transpl， 1993；7:273
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2，Yamada K, Sachs D H, Dersimonian H. Human anti-porcine xenogeneic T cell response: Evidence for allelic specificity of mixed leukocyte reaction
and for both direct and indirect pathways of recognition. J Immunol， 1995；155: 5249
3，Banerjee S, Webber C, Poole A R. The induction of arthritis in mice by the cartilage proteoglycan aggrecan: role of CD4+ and CD8+ cells. Cell Immunol, 1992；144: 347
, http://www.100md.com
4，Leroux J Y, Guerassimov A, Cartman A et al. Immunity to the G1 Globular domain of the cartilage prpteoglycan aggrecan can induce inflammatory erosive polyarthritis and spondylitis in BALB/C mice but imminity to G1 is inhibited by covaently bound keratan sulfate in vitro and in vivo. J Clin Invest, 1996；97: 621
5，Zhang Y P, Guerassinov A, Leroux J Y et al. Arthritis induced by proteoglycan aggrecn G1 domain in Balb/c mice: Evidence of T cell Involvement and the immunosuppressive influence of keratan sulfate on recognition of T and B cell Epitopes. J Clin Invest, 1998；101:1678
6，Eberl G, Robson MacDonald H. Rapid death and regeneration of NKT cells in anti-cd3ε- or IL-12-Treated mice: A major role for bone marrow in NKT cell homeostasis. Immunity，1998；9: 345
收稿1999-08-19 修回1999-11-10, http://www.100md.com