McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡与CPP32基因表达的关系
作者：潘德顺 陈伟强 王迪浔
单位：潘德顺(广东药学院病理生理教研室，广州 510224)；陈伟强(广东药学院病理生理教研室，广州 510224)；王迪浔(同济医科大学病理生理教研室，武汉 430030)
关键词：
中国免疫学杂志000814 中国图书分类号 R735
1994年Teresa等克隆出人的CPP32(caspase-3)cDNA,并证实CPP32基因与细胞凋亡有密切关系[1]；CD28和CD80 McAb共刺激PBLs作用于培养的肝癌细胞能引起肝癌细胞凋亡[2]；为了探讨其机制，本文进行了相关的研究。
1 材料与方法
1.1 淋巴细胞的分离培养 参见文献[2]。
, http://www.100md.com
1.2 肝癌细胞(BEL-7402)培养 参见文献[2]。
1.3 单克隆抗体(McAb)来源 CD28(T细胞亚群干粉)、CD80(B细胞亚群干粉)均购自法国Immunotech公司。
1.4 细胞总的DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 肿瘤细胞总的DNA提取按标准程序进行[3]，DNA样品用紫外分光光度计定量，5%琼脂糖凝胶电泳。
1.5 逆转录PCR 一步法提取RNA，紫外分光光度计定量及电泳确定RNA质量，取10 μg总的RNA按逆转录试剂盒说明进行逆转录，CPP32基因引物参照文献[1]合成，上游引物TGTGACTTCTGGAGTCACC
TAAGTT与CPP32基因cDNA第233～257 bp相对应；下游引物AGAAACATCTCGCATCACTTCCACA与cDNA第511～536 bp相对应；经PCR扩增的片段是253 bp。
, 百拇医药
1.6 特异产物的检测 10 μl PCR反应产物加上2 μl上样液，以1×TAE电泳缓冲液在2%琼脂糖凝胶上，100 v恒压电泳30 min，在紫外灯下照像，以条带大小及深浅判断CPP32 mRNA的水平，并经图像分析处理，以平均光密度条带面积表示总的光密度(OD)来代表mRNA量。
1.7 统计学处理 数据均以
±s表示，各组间结果进行t检验。
2 结果
2.1 肿瘤细胞DNA琼脂糖凝胶电泳结果 肿瘤细胞组和单纯淋巴细胞处理组的肝癌细胞未见凋亡现象发生，而经CD28+CD80共刺激的淋巴细胞则能明显诱导肝癌细胞凋亡(见图1)。
, http://www.100md.com 图1 肝癌细胞DNA琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 The electrophoretic results of the DNA of hepatocellular carcinoma cell line
Note:A:BEL-7402;B:BEL-7402 treated by PBLs;C:BEL-7402 treated PBLs costimulated with McAb(CD80+CD28)
2.2 肝癌细胞在不同情况下CPP32 mRNA水平 CPP32扩增条带经图像分析处理，其肝癌细胞组(n=7)OD值为1.32±0.22，单纯淋巴细胞处理组(n=8)OD值为1.28±0.25，二者之间没有显著差异性(P>0.05)；经CD28+CD80处理组(n=8)OD值为2.35±0.32，明显高于肝癌细胞组和单纯淋巴细胞处理组(P<0.05)。结果说明：经CD28+CD80处理的淋巴细胞能明显诱导肝癌细胞CPP32的高表达。
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3 讨论
T淋巴细胞在肿瘤免疫中起着关键作用，在一些试验系统中起主要作用的是CD8+细胞，但有些试验证实CD4+细胞也是主要的效应细胞；T淋巴细胞活化的双信号学说认为T细胞抗原受体(TCR)和MHC抗原肽结合提供第一信号，第二信号则是共刺激受体与配体相互结合介导；CD28与TCR激活相似的传导途径，但只有在共刺激后，TCR途径传导才能达到最佳激活，就是说CD28维持了TCR诱导的第二信使作用；大量的实验证实CD80与T细胞上CD28分子相结合后稳定IL-2 mRNA，促进IL-2产生以及防止特异抗原诱导的T细胞耐受[4，5]。实验证实CD28+CD80共刺激T淋巴细胞能诱导明显肝癌细胞凋亡[2]，故本实验选用CD28+CD80共刺激T淋巴细胞诱导肝癌细胞凋亡。人类CPP32基因和Ced-3基因(线虫细胞凋亡基因)高度同源，并且具有相同的功能，有实验证实，CPP32基因“剔出”，小鼠神经细胞的凋亡大幅度下降，且多种因素诱导的细胞凋亡与CPP32相关，CPP32酶主要通过裂解DNA修复酶(PARP)、DNA依赖蛋白激酶、蛋白磷酸激酶2A等导致细胞凋亡[6，7]；本实验结果显示：CD28+CD80共刺激T淋巴细胞能同时诱导肝癌细胞的凋亡和CPP32基因高表达，这表明CD28+CD80激活T淋巴细胞诱导肝癌细胞凋亡的机制与CPP32基因高表达相关，激活的T细胞通过某种途径诱导肝癌细胞CPP32基因表达增加，从而导致其凋亡。
, http://www.100md.com
作者简介：潘德顺，男，36岁，医学博士，主要从事肿瘤免疫研究
4 参考文献
[1]Teresa F A,Gerald L，Emad S A.CPP32,novel human apoptotic protin with homology to caenorhaditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalin interleukin-1β-converting enzyme.J Biol Chem,1994;269:3076
[2]黄树林，罗利琼，肖凤兰 et al.McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡.中国免疫学杂志，1998；14(2)：154
[3]Morgenbesser S D,Will Bo,Jacks et al.P53-dependent apoptosis produced by RB-deficiency.Nature,1994;371:21
, 百拇医药
[4]Laszlo C R,Yufang S,Homayoun V et al.CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response.J Immunol,1996;156:1788
[5]Harding F A,Allison J P.CD28-B7 interations allow the induction of CD8+cytotoxic T lymphocytes in the absence of exogenous help.J Exp Med,1993;177:179
[6]Kuida K,Zhen T S,Na S et al.Decreased apoptosis in the brain and brain and premature lethality in CPP32-deficient mice.Nature,1996;384:368
[7]Casciola R,Livia A,Anhalt G J et al.DNA-dependent protein kinase is one a subset of autoantigents specifically cleaved early during apoptosis.J Exp Med,1995;182:1625
[收稿：1999-06-05 修回：1999-11-12], http://www.100md.com
单位：潘德顺(广东药学院病理生理教研室，广州 510224)；陈伟强(广东药学院病理生理教研室，广州 510224)；王迪浔(同济医科大学病理生理教研室，武汉 430030)
关键词：
中国免疫学杂志000814 中国图书分类号 R735
1994年Teresa等克隆出人的CPP32(caspase-3)cDNA,并证实CPP32基因与细胞凋亡有密切关系[1]；CD28和CD80 McAb共刺激PBLs作用于培养的肝癌细胞能引起肝癌细胞凋亡[2]；为了探讨其机制，本文进行了相关的研究。
1 材料与方法
1.1 淋巴细胞的分离培养 参见文献[2]。
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1.2 肝癌细胞(BEL-7402)培养 参见文献[2]。
1.3 单克隆抗体(McAb)来源 CD28(T细胞亚群干粉)、CD80(B细胞亚群干粉)均购自法国Immunotech公司。
1.4 细胞总的DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 肿瘤细胞总的DNA提取按标准程序进行[3]，DNA样品用紫外分光光度计定量，5%琼脂糖凝胶电泳。
1.5 逆转录PCR 一步法提取RNA，紫外分光光度计定量及电泳确定RNA质量，取10 μg总的RNA按逆转录试剂盒说明进行逆转录，CPP32基因引物参照文献[1]合成，上游引物TGTGACTTCTGGAGTCACC
TAAGTT与CPP32基因cDNA第233～257 bp相对应；下游引物AGAAACATCTCGCATCACTTCCACA与cDNA第511～536 bp相对应；经PCR扩增的片段是253 bp。
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1.6 特异产物的检测 10 μl PCR反应产物加上2 μl上样液，以1×TAE电泳缓冲液在2%琼脂糖凝胶上，100 v恒压电泳30 min，在紫外灯下照像，以条带大小及深浅判断CPP32 mRNA的水平，并经图像分析处理，以平均光密度条带面积表示总的光密度(OD)来代表mRNA量。
1.7 统计学处理 数据均以
±s表示，各组间结果进行t检验。2 结果
2.1 肿瘤细胞DNA琼脂糖凝胶电泳结果 肿瘤细胞组和单纯淋巴细胞处理组的肝癌细胞未见凋亡现象发生，而经CD28+CD80共刺激的淋巴细胞则能明显诱导肝癌细胞凋亡(见图1)。
, http://www.100md.com 图1 肝癌细胞DNA琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 The electrophoretic results of the DNA of hepatocellular carcinoma cell line
Note:A:BEL-7402;B:BEL-7402 treated by PBLs;C:BEL-7402 treated PBLs costimulated with McAb(CD80+CD28)
2.2 肝癌细胞在不同情况下CPP32 mRNA水平 CPP32扩增条带经图像分析处理，其肝癌细胞组(n=7)OD值为1.32±0.22，单纯淋巴细胞处理组(n=8)OD值为1.28±0.25，二者之间没有显著差异性(P>0.05)；经CD28+CD80处理组(n=8)OD值为2.35±0.32，明显高于肝癌细胞组和单纯淋巴细胞处理组(P<0.05)。结果说明：经CD28+CD80处理的淋巴细胞能明显诱导肝癌细胞CPP32的高表达。
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3 讨论
T淋巴细胞在肿瘤免疫中起着关键作用，在一些试验系统中起主要作用的是CD8+细胞，但有些试验证实CD4+细胞也是主要的效应细胞；T淋巴细胞活化的双信号学说认为T细胞抗原受体(TCR)和MHC抗原肽结合提供第一信号，第二信号则是共刺激受体与配体相互结合介导；CD28与TCR激活相似的传导途径，但只有在共刺激后，TCR途径传导才能达到最佳激活，就是说CD28维持了TCR诱导的第二信使作用；大量的实验证实CD80与T细胞上CD28分子相结合后稳定IL-2 mRNA，促进IL-2产生以及防止特异抗原诱导的T细胞耐受[4，5]。实验证实CD28+CD80共刺激T淋巴细胞能诱导明显肝癌细胞凋亡[2]，故本实验选用CD28+CD80共刺激T淋巴细胞诱导肝癌细胞凋亡。人类CPP32基因和Ced-3基因(线虫细胞凋亡基因)高度同源，并且具有相同的功能，有实验证实，CPP32基因“剔出”，小鼠神经细胞的凋亡大幅度下降，且多种因素诱导的细胞凋亡与CPP32相关，CPP32酶主要通过裂解DNA修复酶(PARP)、DNA依赖蛋白激酶、蛋白磷酸激酶2A等导致细胞凋亡[6，7]；本实验结果显示：CD28+CD80共刺激T淋巴细胞能同时诱导肝癌细胞的凋亡和CPP32基因高表达，这表明CD28+CD80激活T淋巴细胞诱导肝癌细胞凋亡的机制与CPP32基因高表达相关，激活的T细胞通过某种途径诱导肝癌细胞CPP32基因表达增加，从而导致其凋亡。
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作者简介：潘德顺，男，36岁，医学博士，主要从事肿瘤免疫研究
4 参考文献
[1]Teresa F A,Gerald L，Emad S A.CPP32,novel human apoptotic protin with homology to caenorhaditis elegans cell death protein Ced-3 and mammalin interleukin-1β-converting enzyme.J Biol Chem,1994;269:3076
[2]黄树林，罗利琼，肖凤兰 et al.McAb共刺激PBLs介导肝癌细胞凋亡.中国免疫学杂志，1998；14(2)：154
[3]Morgenbesser S D,Will Bo,Jacks et al.P53-dependent apoptosis produced by RB-deficiency.Nature,1994;371:21
, 百拇医药
[4]Laszlo C R,Yufang S,Homayoun V et al.CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response.J Immunol,1996;156:1788
[5]Harding F A,Allison J P.CD28-B7 interations allow the induction of CD8+cytotoxic T lymphocytes in the absence of exogenous help.J Exp Med,1993;177:179
[6]Kuida K,Zhen T S,Na S et al.Decreased apoptosis in the brain and brain and premature lethality in CPP32-deficient mice.Nature,1996;384:368
[7]Casciola R,Livia A,Anhalt G J et al.DNA-dependent protein kinase is one a subset of autoantigents specifically cleaved early during apoptosis.J Exp Med,1995;182:1625
[收稿：1999-06-05 修回：1999-11-12], http://www.100md.com