人绒毛膜促性腺激素β亚基在大肠杆菌中的表达
作者：张乐鸣 刘东海 董虹 张顺
单位：张乐鸣(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)；刘东海(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)；董虹(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)；张顺(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)
关键词：人绒毛膜促性腺激素β亚基；序列分析；基因表达；复性
中国免疫学杂志000805 摘 要 目的：以该室克隆的PCRⅡ/hCGβ载体为模板，亚克隆到表达载体PG5中使hCGβ基因在大肠杆菌中进行高效表达。方法：改变部分hCGβ序列，得到重组PG5/hCGβ载体，经序列分析证明，再转化到表达菌BL21中表达，所得包涵体经过柱纯化，复性，免疫发光分析和动物试验测定其活性。结果：经SDS-PAGE电泳在18 kD左右有一条明显的新增蛋白带，与预期的分子量相符，并用Western印迹证实，rhCGβ约占菌体总蛋白的10%，活性为7.8 U/mg。结论：重组hCGβ在大肠杆菌中获得了较高水平的表达。且经复性后有较高的免疫活性和生物活性。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.11
Expession in E.coli of human chorionic gonadotropin subunit β cDNA
ZHANG Le-Ming，LIU Dong-Hai，DONG Hong et al.
Laboratory of Tumor Molecular Biology，Ningbo No.2 Hospital，Ningbo 315010
Abstract Objective:Using the previously cloned vector PCRⅡ/hCGβ as the template，subclone the aimed gene into expression vector PG5，make hCGβ expressed efficiently in E.coli.Methods:Several neucleotides of hCGβ in recombinant PCRⅡ/hCGβ were altered through PCR method，then the modified hCGβ was inserted into PG5，proved by sequencing analysis，and transformed E.coli host strain BL21.The expressed inclusion body was extracted，dissolved，and refolded.Its immunological and physiological activities were measured by immunoflurescent assay and animal experiments respectively.Results:The results of SDS-PAGE electrophoresis and western blot demonstrated that the IPTG induced bacteria expressed an extra band of 18 kD in comparison with the uninduced ones.The expression level was more than 10% of the total cell lysate，and the immunological activity，7.8 U/ml.Conclusion:The recombinant PG5/hCGβ was effeciently expressed in E.coli，and the recombinant protein has high immunological and physiological activities.
, 百拇医药
Key words hCGβ Sequencing analysis Gene expression Refolding
人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)是由胎盘滋养层合体细胞合成的激素，促进胚泡发育，维持妊娠。hCG与TSH(促甲状腺激素)、FSH(促卵泡激素)、LH(黄体生成素)等同为糖蛋白激素家庭一员[1]。这些激素都具有相同的α亚基和各自独特的β亚基。α亚基与信息传导有关，而β亚基则产生其激素效应[2]。作为抗原，β亚基比整个hCG分子更具有特异性，所以认为hCGβ亚基的研究具有真正的实用价值。
我们在以前的工作中采用新鲜的人绒毛膜组织，用异硫氰酸胍酚法抽提mRNA，经逆转录生成cDNA，用PCR方法对cDNA进行扩增，然后直接克隆至PCRⅡ载体中[3]。
, http://www.100md.com 本研究中，我们在hCGβ亚基cDNA克隆的基础上重新设计引物，用PCR方法扩增目的DNA，将其克隆到表达质粒PG5中，经序列分析证实为正确的目的DNA后，转化到表达菌BL21中，进行表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶及主要试剂 限制性内切酶NdeI、BamHI和T4DNA连接酶购自Promega公司，PCR试剂盒购自PE公司，低分子蛋白标准购自上海东风生物技术有限公司。
1.1.2 载体与菌株 PCRⅡ/hCGβ质粒，大肠杆菌表达载体PG5，受体菌E.coli DH5α，表达菌E.coli BL21均为本室保存。
1.1.3 PCR引物 上游引物5’-TGA ACA TAT GGA GAT GTT CAA GGG GCT-3’；下游引物5’-CTA TGG ATC CTA CCG TGC GAG GAT CGG GG-3’；由大连宝生物工程公司合成。
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1.2 方法
1.2.1 hCGβ的PCR反应 用PCRⅡ/hCGβ质粒作为PCR反应的模板，每100 μl反应液中含KCl 50 mmol/L，Tris-Cl 10 mmol/L(pH8.3)，MgCl2 4 mmol/L，dNTPs 200 μmol/L，引物400 nmol/L，TaqDNA聚合酶2.5 U，在PE-TCI上进行扩增。95℃变性5 min后，95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min共30个循环，最后72℃延伸5 min。
1.2.2 表达载体的构建 将PCR扩增回收的hCGβ基因片段和PG5载体，分别用NdeI和BamHI进行双酶切，酶切产物用1.5%琼脂糖电泳分离，经透析袋回收，纯化后用T4DNA连接酶连接。
1.2.3 包涵体的纯化 rhCGβ主要存在于包涵体中。超声破碎离心后的沉淀依次用①1 mg溶菌酶，30 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，1 mmol/L EDTA，20%蔗糖，洗涤1次。②50 mmol/L乙酸钠(pH=5.0)，1 mmol/L EDTA，1%Tris X-100洗涤3次。③20 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，5 mmol/L EDTA，2%脱氧胆酸盐，室温20 min。④20 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，5 mmol/L EDTA洗涤1次。⑤8 mol/L尿素，50 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)溶解后纯度可达90%以上，再经Sephadex G-150过柱后，纯度可达95%以上。
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2 结果
2.1 PCR扩增结果 经过30个循环的PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，PEGM3Z/HaeIII分子量标准显示在500 bp处有一条DNA带，与预期的长度相符。
2.2 重组表达质粒的酶切及序列分析 筛选克隆阳性的菌落，增菌并提取质粒DNA，用NdeI/BamHI双酶切和PCR扩增两种方法鉴定(图1)。hCGβ的序列分析在ABI PrismTM377全自动测序仪上进行，hCGβ的序列分析结果表明所克隆的基因序列与Genbank上的hCGβ序列完全一致。
2.3 rhCGβ在大肠杆菌中的表达 PG5/hCGβ重组质粒转化E.coli BL21的感受态细胞，挑选阳性菌落培养至600 nm波长的OD在0.4～0.6之间时，加0.5 mmol/L IPTG，继续培养4 h后，用12%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物[4]。染色后可见在18 kD左右有一条明显的新增蛋白带，与预期的分子量相符，激光密度扫描计算此蛋白质量约占菌体总蛋白的10%左右，未经IPTG诱导的阳性细菌并无此带(图2)。
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2.4 表达产物的Western印迹鉴定 经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜，与DAKO公司兔抗人hCG多克隆抗体作Western印迹。结果证明rhCGβ的分子量约为18 kD，且为单一条带。说明与兔抗人hCG多克隆抗体有特异的反应(图3)。
2.5 包涵体的复性及初步活性测定 经SephadexG-100过柱收集活性主峰，在50 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，1% Tris X-100缓冲条件下用1 mmol/L谷胱甘肽(还原型)0.1 mmol/L谷胱甘肽(氧化型)4℃缓慢复性过夜，4℃浓缩，用Beckman Access全自动免疫发光分析仪检测活性为7.8 U/mg。
2.6 初步动物活性实验(按中国药典) 取雌性昆明鼠，鼠龄18～21 d，每一种复性方法及空白对照各5只，每天用蛋白浓度为0.1 mg/ml、免疫活性为500 mU/ml的复性液0.2 ml连续3 d，注射小鼠，第4天解剖观察子宫大小。结果：阴性对照的小鼠子宫重(65±5)mg，注射谷胱甘肽复性液后小鼠子宫重(105±5) mg，有显著的差异。
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图1 PG5/hCGβ限制性内切酶酶切电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis of PG5/hCGβ after restrictive endonucleases digestion
Note:1.pEGM/Hae Ⅲ maker;2.PG5/hCGβ digested by Nde I/BamH I;3.PG5/hCGβ;4.λDNA digested by EcoR I/HinDⅢ(marker)
图2 PG5/hCGβ表达产物SDS-PAGE电泳图谱
Fig.2 SDS-PAGE analysis of PG5/hCGβ after expression products
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Note:1.Protein molecular weight markers;2.Cell lysates from uninduced BL21;3-5.Cell lysates from BL21，IPTG induced for 3，4，5 h respectively;6.Purified inclusion body;7.Renatured inclusion body lysates
图3 Western blot免疫印迹分析
Fig.3 Western blot analysis by enhanced chemiluminescence of cell lysates from uninduced
Note:Lane1 and Lane2 (induced) BL21 cells that contained PG5/hCGβ plasmid
, 百拇医药
3 讨论
自1980年Fiddes等在Nature上发表了hCGβ的mRNA序列后[5]，对hCGβ的分子生物学研究日益引起大家的重视。hCGβ作为胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，在胚泡发育的早期妊娠中占有重要的地位。本研究用分子生物学方法从绒毛膜组织中成功地分离到了hCGβ-cDNA，序列分析结果表明，分离到的cDNA片段包涵hCGβ整个编码区及部分非编码区及部分非编码区序列，此cDNA含有完整的开放阅读框架，经同源性分析表明同Fiddes发表的序列完全一致。
此次在hCG引物设计时加上了NedI和BamHI两个限制性内切酶的位点，终止密码子和一些保护性碱基，减少了大肠杆菌的毒性反应。从实验结果可见，修改序列后的细菌生长快速，而未经修改的细菌生长缓慢。PG5是一个高效表达载体。构建后的载体，经过序列分析证实基因序列的符合是表达所必需的，改变表达条件，进一步提高蛋白表达量，是我们目前要做的工作，这是降低成本，进行大规模生产的前提。我们已经得到了较高的免疫活性，而其生物活性取决于23与72，9与90两对半胱氨酸二硫键之间的正确结合，从而使hCGβ蛋白分子维持在生理构象[6]。
, http://www.100md.com
宁波市自然科学基金资助项目(编号9827)
作者简介：张乐鸣，男，42岁，博士，教授，主任医师，主要研究肿瘤外科及分子生物学
4 参考文献
[1]Talwar G P，Om Singh R，Chatterjee P N et al.A vaccine that prevents pregnancy in women.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:8532
[2]颜建华，朱锡华.绒毛膜促性腺激素、生长激素的基因调控.国外医学*分子生物学分册，1993；15(1)：13
[3]张乐鸣，刘东海，董 虹.人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆的初步报告.宁波医学，1996；8(4)：206
, 百拇医药
[4]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning-A laboratory mannual.2nd ed.New York:CSH，1989:881
[5]Fiddes J C，Goodman H M.The cDNA FOR the β-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region.Nature，1980;286(14):684
[6]Huth J R，Mountjoy K，Perini F et al.Domain-dependent protein folding is indicated by the intracellular kinetics of disulfide bind formation of hunam chorionic gonadotrpin β subunit.J Biol Chem，1992; 267:21396
[收稿：1999-04-04 修回：1999-10-25], 百拇医药
单位：张乐鸣(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)；刘东海(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)；董虹(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)；张顺(宁波市第二医院肿瘤分子生物学实验室，宁波 315010)
关键词：人绒毛膜促性腺激素β亚基；序列分析；基因表达；复性
中国免疫学杂志000805 摘 要 目的：以该室克隆的PCRⅡ/hCGβ载体为模板，亚克隆到表达载体PG5中使hCGβ基因在大肠杆菌中进行高效表达。方法：改变部分hCGβ序列，得到重组PG5/hCGβ载体，经序列分析证明，再转化到表达菌BL21中表达，所得包涵体经过柱纯化，复性，免疫发光分析和动物试验测定其活性。结果：经SDS-PAGE电泳在18 kD左右有一条明显的新增蛋白带，与预期的分子量相符，并用Western印迹证实，rhCGβ约占菌体总蛋白的10%，活性为7.8 U/mg。结论：重组hCGβ在大肠杆菌中获得了较高水平的表达。且经复性后有较高的免疫活性和生物活性。
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中国图书分类号 R392.11
Expession in E.coli of human chorionic gonadotropin subunit β cDNA
ZHANG Le-Ming，LIU Dong-Hai，DONG Hong et al.
Laboratory of Tumor Molecular Biology，Ningbo No.2 Hospital，Ningbo 315010
Abstract Objective:Using the previously cloned vector PCRⅡ/hCGβ as the template，subclone the aimed gene into expression vector PG5，make hCGβ expressed efficiently in E.coli.Methods:Several neucleotides of hCGβ in recombinant PCRⅡ/hCGβ were altered through PCR method，then the modified hCGβ was inserted into PG5，proved by sequencing analysis，and transformed E.coli host strain BL21.The expressed inclusion body was extracted，dissolved，and refolded.Its immunological and physiological activities were measured by immunoflurescent assay and animal experiments respectively.Results:The results of SDS-PAGE electrophoresis and western blot demonstrated that the IPTG induced bacteria expressed an extra band of 18 kD in comparison with the uninduced ones.The expression level was more than 10% of the total cell lysate，and the immunological activity，7.8 U/ml.Conclusion:The recombinant PG5/hCGβ was effeciently expressed in E.coli，and the recombinant protein has high immunological and physiological activities.
, 百拇医药
Key words hCGβ Sequencing analysis Gene expression Refolding
人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)是由胎盘滋养层合体细胞合成的激素，促进胚泡发育，维持妊娠。hCG与TSH(促甲状腺激素)、FSH(促卵泡激素)、LH(黄体生成素)等同为糖蛋白激素家庭一员[1]。这些激素都具有相同的α亚基和各自独特的β亚基。α亚基与信息传导有关，而β亚基则产生其激素效应[2]。作为抗原，β亚基比整个hCG分子更具有特异性，所以认为hCGβ亚基的研究具有真正的实用价值。
我们在以前的工作中采用新鲜的人绒毛膜组织，用异硫氰酸胍酚法抽提mRNA，经逆转录生成cDNA，用PCR方法对cDNA进行扩增，然后直接克隆至PCRⅡ载体中[3]。
, http://www.100md.com 本研究中，我们在hCGβ亚基cDNA克隆的基础上重新设计引物，用PCR方法扩增目的DNA，将其克隆到表达质粒PG5中，经序列分析证实为正确的目的DNA后，转化到表达菌BL21中，进行表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶及主要试剂 限制性内切酶NdeI、BamHI和T4DNA连接酶购自Promega公司，PCR试剂盒购自PE公司，低分子蛋白标准购自上海东风生物技术有限公司。
1.1.2 载体与菌株 PCRⅡ/hCGβ质粒，大肠杆菌表达载体PG5，受体菌E.coli DH5α，表达菌E.coli BL21均为本室保存。
1.1.3 PCR引物 上游引物5’-TGA ACA TAT GGA GAT GTT CAA GGG GCT-3’；下游引物5’-CTA TGG ATC CTA CCG TGC GAG GAT CGG GG-3’；由大连宝生物工程公司合成。
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1.2 方法
1.2.1 hCGβ的PCR反应 用PCRⅡ/hCGβ质粒作为PCR反应的模板，每100 μl反应液中含KCl 50 mmol/L，Tris-Cl 10 mmol/L(pH8.3)，MgCl2 4 mmol/L，dNTPs 200 μmol/L，引物400 nmol/L，TaqDNA聚合酶2.5 U，在PE-TCI上进行扩增。95℃变性5 min后，95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min共30个循环，最后72℃延伸5 min。
1.2.2 表达载体的构建 将PCR扩增回收的hCGβ基因片段和PG5载体，分别用NdeI和BamHI进行双酶切，酶切产物用1.5%琼脂糖电泳分离，经透析袋回收，纯化后用T4DNA连接酶连接。
1.2.3 包涵体的纯化 rhCGβ主要存在于包涵体中。超声破碎离心后的沉淀依次用①1 mg溶菌酶，30 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，1 mmol/L EDTA，20%蔗糖，洗涤1次。②50 mmol/L乙酸钠(pH=5.0)，1 mmol/L EDTA，1%Tris X-100洗涤3次。③20 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，5 mmol/L EDTA，2%脱氧胆酸盐，室温20 min。④20 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)，5 mmol/L EDTA洗涤1次。⑤8 mol/L尿素，50 mmol/L DTT，50 mmol/L Tris-Cl(pH=8.1)溶解后纯度可达90%以上，再经Sephadex G-150过柱后，纯度可达95%以上。
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2 结果
2.1 PCR扩增结果 经过30个循环的PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，PEGM3Z/HaeIII分子量标准显示在500 bp处有一条DNA带，与预期的长度相符。
2.2 重组表达质粒的酶切及序列分析 筛选克隆阳性的菌落，增菌并提取质粒DNA，用NdeI/BamHI双酶切和PCR扩增两种方法鉴定(图1)。hCGβ的序列分析在ABI PrismTM377全自动测序仪上进行，hCGβ的序列分析结果表明所克隆的基因序列与Genbank上的hCGβ序列完全一致。
2.3 rhCGβ在大肠杆菌中的表达 PG5/hCGβ重组质粒转化E.coli BL21的感受态细胞，挑选阳性菌落培养至600 nm波长的OD在0.4～0.6之间时，加0.5 mmol/L IPTG，继续培养4 h后，用12%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物[4]。染色后可见在18 kD左右有一条明显的新增蛋白带，与预期的分子量相符，激光密度扫描计算此蛋白质量约占菌体总蛋白的10%左右，未经IPTG诱导的阳性细菌并无此带(图2)。
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2.4 表达产物的Western印迹鉴定 经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜，与DAKO公司兔抗人hCG多克隆抗体作Western印迹。结果证明rhCGβ的分子量约为18 kD，且为单一条带。说明与兔抗人hCG多克隆抗体有特异的反应(图3)。
2.5 包涵体的复性及初步活性测定 经SephadexG-100过柱收集活性主峰，在50 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，1% Tris X-100缓冲条件下用1 mmol/L谷胱甘肽(还原型)0.1 mmol/L谷胱甘肽(氧化型)4℃缓慢复性过夜，4℃浓缩，用Beckman Access全自动免疫发光分析仪检测活性为7.8 U/mg。
2.6 初步动物活性实验(按中国药典) 取雌性昆明鼠，鼠龄18～21 d，每一种复性方法及空白对照各5只，每天用蛋白浓度为0.1 mg/ml、免疫活性为500 mU/ml的复性液0.2 ml连续3 d，注射小鼠，第4天解剖观察子宫大小。结果：阴性对照的小鼠子宫重(65±5)mg，注射谷胱甘肽复性液后小鼠子宫重(105±5) mg，有显著的差异。
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图1 PG5/hCGβ限制性内切酶酶切电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis of PG5/hCGβ after restrictive endonucleases digestion
Note:1.pEGM/Hae Ⅲ maker;2.PG5/hCGβ digested by Nde I/BamH I;3.PG5/hCGβ;4.λDNA digested by EcoR I/HinDⅢ(marker)
图2 PG5/hCGβ表达产物SDS-PAGE电泳图谱
Fig.2 SDS-PAGE analysis of PG5/hCGβ after expression products
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Note:1.Protein molecular weight markers;2.Cell lysates from uninduced BL21;3-5.Cell lysates from BL21，IPTG induced for 3，4，5 h respectively;6.Purified inclusion body;7.Renatured inclusion body lysates
图3 Western blot免疫印迹分析
Fig.3 Western blot analysis by enhanced chemiluminescence of cell lysates from uninduced
Note:Lane1 and Lane2 (induced) BL21 cells that contained PG5/hCGβ plasmid
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3 讨论
自1980年Fiddes等在Nature上发表了hCGβ的mRNA序列后[5]，对hCGβ的分子生物学研究日益引起大家的重视。hCGβ作为胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，在胚泡发育的早期妊娠中占有重要的地位。本研究用分子生物学方法从绒毛膜组织中成功地分离到了hCGβ-cDNA，序列分析结果表明，分离到的cDNA片段包涵hCGβ整个编码区及部分非编码区及部分非编码区序列，此cDNA含有完整的开放阅读框架，经同源性分析表明同Fiddes发表的序列完全一致。
此次在hCG引物设计时加上了NedI和BamHI两个限制性内切酶的位点，终止密码子和一些保护性碱基，减少了大肠杆菌的毒性反应。从实验结果可见，修改序列后的细菌生长快速，而未经修改的细菌生长缓慢。PG5是一个高效表达载体。构建后的载体，经过序列分析证实基因序列的符合是表达所必需的，改变表达条件，进一步提高蛋白表达量，是我们目前要做的工作，这是降低成本，进行大规模生产的前提。我们已经得到了较高的免疫活性，而其生物活性取决于23与72，9与90两对半胱氨酸二硫键之间的正确结合，从而使hCGβ蛋白分子维持在生理构象[6]。
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宁波市自然科学基金资助项目(编号9827)
作者简介：张乐鸣，男，42岁，博士，教授，主任医师，主要研究肿瘤外科及分子生物学
4 参考文献
[1]Talwar G P，Om Singh R，Chatterjee P N et al.A vaccine that prevents pregnancy in women.Proc Natl Acad Sci USA，1994;91:8532
[2]颜建华，朱锡华.绒毛膜促性腺激素、生长激素的基因调控.国外医学*分子生物学分册，1993；15(1)：13
[3]张乐鸣，刘东海，董 虹.人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆的初步报告.宁波医学，1996；8(4)：206
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[4]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning-A laboratory mannual.2nd ed.New York:CSH，1989:881
[5]Fiddes J C，Goodman H M.The cDNA FOR the β-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region.Nature，1980;286(14):684
[6]Huth J R，Mountjoy K，Perini F et al.Domain-dependent protein folding is indicated by the intracellular kinetics of disulfide bind formation of hunam chorionic gonadotrpin β subunit.J Biol Chem，1992; 267:21396
[收稿：1999-04-04 修回：1999-10-25], 百拇医药