细胞凋亡对中性粒细胞功能的影响
作者：李英丽 陈泮藻 颜光涛
单位：李英丽(解放军总医院基础所生化室，北京 100853)；陈泮藻(解放军总医院基础所生化室，北京 100853)；颜光涛(解放军总医院基础所生化室，北京 100853)
关键词：中性粒细胞；凋亡；吞噬；趋化；活性氧生成
中国免疫学杂志001006 摘 要 目的：为了探讨中性粒细胞(PMN)的自然凋亡和PMN凋亡对细胞吞噬、趋化和活性氧(ROS)生成等功能的影响。方法：采用光镜、电镜、电泳和流式细胞仪等研究手段探讨PMN的自然凋亡；通过葡萄球菌法、滤膜法和化学发光的方法研究凋亡PMN吞噬、趋化和ROS生成的改变。结果：分离健康成人外周血PMN，在体外进行10%血清培养，随着培养时间的延长，PMN凋亡率升高，同时PMN的吞噬、趋化以及ROS生成等功能都不同程度地受损。结论：外周血PMN在体外培养发生自然凋亡，PMN的凋亡与细胞功能相关。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
The effect of apoptosis on neutrophil function
LI Ying-Li，CHEN Pan-Zao，YAN Guang-Tao
(Biochem. Lab. of the PLA General Hospital,Beijing 100853)
Abstract Objective: To understand the apoptosis of PMN in the absence of stimuli. To study the phagocytosis of apoptotic neutrophils，its ability to migrate toward a chemoattractant， and also its ability of superoxide releasing. Methods: PMN apoptosis was determined by light microscopy，electron-microscopy，gel electrophoresis and flow cytometry analysis. The phagocytosis of apoptotic neutrophil，its ability to migrate toward a chemoattractant，and its ability of superoxide releasing were also studied in this paper. Results: The rate of apoptosis of human PMN increased as the incubate time prolong. The phagocytosis of neutrophil，its ability to migrate toward a chemoattractant，and its ability of superoxide releasing were all decreased as it was cultured for a longer time. Conclusions: Neutrophil apoptosis could affect its function，the function of apoptotic neutrophil were decreased.
, 百拇医药
Key words Polymorphonuclear neutrophils Apoptosis Phagocytosis Chemotaxis Superoxide releasing
细胞凋亡是近年来的研究热点，PMN作为机体防御系统的重要组成部分，其凋亡研究倍受关注。PMN的功能相当复杂，在接受机体发生组织损伤或感染的信息后，PMN游出血管，向炎症部位趋化游走，首先到达炎症局部，发挥其吞噬和杀菌功能。另外，PMN还产生大量O2*、H2O2等ROS。这一方面有利于入侵微生物的杀灭，另一方面也不可避免地损伤周围正常组织或细胞。为了研究PMN的凋亡是否直接抑制细胞在炎症介质激发下所产生的对机体具有潜在损伤性反应的能力，我们利用PMN自然凋亡的特性，观察健康成人外周血PMN在体外培养不同时间，细胞吞噬、趋化和活性氧生成等功能的改变。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 发光光度仪及专用试管为LKB公司产品，Boyden趋化小室、滤膜为国产，鲁米诺购自Serva公司，佛波酯(PMA)为Sigma公司产品。
1.2 中性粒细胞分离与细胞基因组DNA提取 人外周血肝素抗凝，0.5% 甲基纤维素沉降红细胞；淋巴细胞分离液分离获得PMN。以酚:氯仿法抽提获得DNA，-20℃保存待用。
1.3 中性粒细胞形态学观察
1.3.1 光镜观察 采用瑞士-姬姆萨混合染色法，光镜下观察PMN，高倍视野计数100个细胞，计算凋亡细胞所占百分比。
1.3.2 电镜观察 2%戊二醛固定，2%低熔点胶包埋，电子染色，H-7000型透射电镜观察凋亡细胞内部结构变化并拍照。
1.4 中性粒细胞基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳观察 PMN基因组DNA以2%琼脂糖凝胶电泳，0.5%溴化乙锭(EB)染色，紫外透射仪下观察并拍照。
, http://www.100md.com
1.5 中性粒细胞的流式细胞仪分析 70% 乙醇固定PMN，4℃ 过夜，终浓度100 μg/ml的RNaseA作用30 min，再加入终浓度为50 μg/ml的碘化丙锭(PI)，室温避光30 min，流式细胞仪检测。
1.6 中性粒细胞吞噬功能观察 采用葡萄球菌法：40孔培养板每孔加入30 μl PMN 2×106 ml-1和20 μl沸水煮过的金黄色葡萄球菌悬液6×108 ml-1，CO2孵箱培养30 min后以瑞士-姬姆萨复染法染色，显微镜下观察并计数200个PMN，分别求出吞噬百分率与吞噬指数。
1.7 中性粒细胞趋化性观察 采用滤膜法：Boyden趋化小室下室加入 0.1 mol/L PB (pH7.4) 100 μl和0.1 mg/ml PMA 20 μl，上室加入2×106 ml-1细胞悬液0.5 ml，CO2孵箱中温育2 h后取出滤膜，甲醇固定，0.5%苏木素染色10 min，蒸馏水漂洗，异丙醇脱水，二甲苯透明，透明后的滤膜原来向下的一面朝上，贴于洁净载玻片上，中性树脂封片后，油镜下观察。
, 百拇医药
1.8 中性粒细胞活性氧生成观察 采用化学发光法：发光光度仪专用试管加入107 ml-1 细胞悬液200 μl，测定空白计数；又加入2 mg/ml鲁米诺5 μl，37℃孵育10 min，同时进行化学发光计数10 min；再加入0.1 mg/ml PMA 5 μl，轻摇2 s后立即进行化学发光计数。
2 结果
2.1 中性粒细胞凋亡观察 光镜和电镜下观察凋亡细胞特征性形态学改变的出现，结果显示，PMN在短时间内(3 h)就能发生自然凋亡，随着培养时间的延长(6，12，24 h)，细胞凋亡量增多(见表1)。电泳结果与光镜观察结果一致(见图1)。流式细胞仪分析体外培养0，3，6，20 h的PMN凋亡百分比和凋亡特征性亚二倍体峰的出现也与光镜观察结果一致(见图2)。
表1 不同时间点人中性粒细胞自然凋亡光镜及电泳检查结果
, 百拇医药
Tab.1 Human PMN incubated in vitro and detected by light microscopy and gel electrophoresis Hours (h)
Times (n)
Apoptosis (%)
DNA-Ladder
0
3
0.33±0.58
-
3
3
, 百拇医药
4.33±0.58
-
6
3
9.33±1.53
±
12
3
17.00±2.00
+
24
3
25.67±2.08
, 百拇医药
++
Notes:“-”no DNA-Ladder；“±”weaker DNA-Ladder；“+”DNA-Ladder；“++”stronger DNA-Ladder. The SAS (Statistical Analysis System) was used for Statistical Analysis.Every two groups were analysed，P < 0.05 were considered extremely significant( P<0.05)
图1 不同时间点人中性粒细胞自然凋亡DNA-ladder
Fig.1 Gel electrophoresis of DNA from cultured PMNs
, http://www.100md.com
Note:Lane1. λ DNA/EcoR Ⅰ +Hind Ⅲmarker(21 227,5 148,4 973,4 268)； Lane2.0 h； Lane3. 3 h；Lane4. 6 h; Lane5. 12 h; Lane6. 24 h
图2 不同时间点人中性粒细胞自然凋亡流式细胞仪分析结果
Fig.2 Human PMN incubated in vitro and assessed by FACs
图3 中性粒细胞24 h培养电镜观察(×2 500)
Fig.3 Humman PMN incubated for 24 hours observed by electron microscope(×2 500)
, http://www.100md.com
2.2 凋亡中性粒细胞的功能变化
2.2.1 凋亡中性粒细胞吞噬功能观察 新鲜分离PMN(正常细胞组)与培养6 h的PMN(低凋亡组)以及培养20 h的PMN(高凋亡组)相比，随着细胞凋亡率的升高，PMN对金黄色葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数均降低(见表2)。
2.2.2 凋亡中性粒细胞趋化性的观察 新鲜分离PMN与培养6 h PMN以及培养20 h PMN相比，随着细胞凋亡率的升高，在PMA(终浓度0.017 mg/mL)的趋化作用下穿透滤膜的PMN数减少(见表2)。2.2.3 凋亡中性粒细胞活性氧生成的观察 PMN自发产生的活性氧，随着培养时间的延长(0 、6、12、20 h)迅速减少(见图4A)；但是在PMA(终浓度0.002 mg/ml)激发下产生活性氧的能力，随着培养时间的延长，呈不断增加趋势(见图4B)。
表2 PMN凋亡与PMN吞噬率及吞噬指数
, 百拇医药
Tab.2 The phagocytosis of apoptotic PMN Hours(h)
Times(n)
Apoptosis(%)
Phagocytosis rate
Phagocytosis number
Migrate toward chemoattractant
0
3
1.82±0.28
98.33±1.53
, http://www.100md.com
18.70±2.68
31.200±4.56
6
3
20.85±0.71
82.00±5.57
10.13±1.16
24.400±4.22
20
3
33.80±0.39
47.00±4.58
, http://www.100md.com
3.43±0.70
10.400±2.34
Notes:The SAS (Statistical Analysis System) was used for Statistical Analysis.Every two groups were analysed，P < 0.05 were considered extremely significant.( P<0.05)
图4 PMN凋亡与活性氧生成
Fig.4 PMN apoptosis and its ability of superoxide releasing
Notes:A.spontaneous superoxide releasing;B.stimulated superoxide releasing
, http://www.100md.com
3 讨论
PMN是机体防御系统中的快速反应元件，在急性炎症刺激下首先到达炎症局部。本实验对凋亡PMN吞噬、趋化和活性氧生成等功能的改变进行了初步探讨。
3.1 凋亡中性粒细胞吞噬功能下降 PMN对细菌或异物的吞噬作用，是一个极其复杂的活动。与PMN膜表面的IgG 受体、C3b受体和细菌的对应抗体IgG以及补体C3b有关。文献报道，PMN发生凋亡时，CD16的表达下降[1，2]，CD16(FcγRⅢ)是IgG的低亲和力受体，CD16表达的降低可能导致凋亡PMN吞噬功能下降。
3.2 凋亡中性粒细胞趋化性减弱 PMN游出血管向炎症部位游走，主要靠化学激动作用和趋化性两种功能。很多物质能使PMN发生趋化性，如C3a，LTB4以及IL-1等。PMA也是一种趋化因子，对PMN具有较强的趋化活性和化学激动作用。关于趋化性的机制认为与PMN膜表面存在的能与趋化因子结合的受体有关。凋亡PMN趋化性的降低可以由PMN发生凋亡时细胞表面某些受体表达的减少来解释[1-3]。
, http://www.100md.com
3.3 凋亡中性粒细胞活性氧的生成 本实验观察到PMN自发产生的ROS，随着培养时间的延长，迅速减少，但是在PMA激发下产生的ROS，随着培养时间的延长，呈不断增加趋势，提示凋亡PMN仍保持激活NADPH氧化酶系统的胞内信号传导途径。其原因虽待进一步探讨，但近来研究表明，PMN的凋亡与细胞保持氧化剂-抗氧化剂平衡的能力相关[6]，胞内ROS的积聚可以促进细胞的凋亡[4-5]。Kettritz等则指出，ROS的释放可能是PMN自然凋亡和FMLP作用下PMN凋亡的原因[7]。Bcl-2对细胞凋亡的抑制机制涉及减少ROS的产生和抑制ROS的活性，而PMN不表达Bcl-2及其相关癌基因Bcl-x[8]，这可能是PMN易于凋亡的原因之一。
本实验结果表明，随着培养时间的延长，PMN凋亡率升高，同时PMN的吞噬、趋化以及ROS生成等功能都不同程度地受损。从而提示，PMN的凋亡与细胞功能相关。Lee等发现，LPS既对细胞凋亡有抑制作用，又能保持细胞有关功能不受损害，这一结果支持了作者的观点[9]。 Whyte等的研究发现，PMN发生凋亡时，与细胞骨架有关的功能如伸展、变形、趋化等均完全或部分地丧失，而且凋亡PMN在FMLP等物质刺激下，脱颗粒[以髓过氧化物酶(MPO)的释放为标志]能力大大降低[10]。在ROS生成方面，凋亡PMN保持对PMA反应的能力[6,10]。这与我们的实验结果基本一致。
, 百拇医药
综上所述，凋亡PMN虽然仍保持有害内容物， 但细胞实际上是处于一种与外界“功能分离”的状态。这种性质在Mφ不能及时吞噬清除凋亡PMN时格外重要， 因为单核细胞需要一段时间的成熟期才能发挥其吞噬功能。在Mφ功能超负荷时这种性质也很重要。与PMN凋亡相关的功能丧失，对控制急性炎症，促进炎症消退很重要。总之，特异性的诱导凋亡可能会成为治疗炎症的新方法。
国家自然科学基金资助项目(批准号39770716)
作者简介：李英丽，女，27岁，生物化学硕士
参考文献
1，Dransfield I， Buckle A M， Savill J S et al. Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD16 (Fc gamma RIII) expression. J Immunol，1994；153(3): 1254
, http://www.100md.com
2，Homburg C H，de Haas M，von dem Borne AE et al. Human neutrophils lose their surface Fc gamma RIII and acquire Annexin V binding sites during apoptosis in vitro. Blood，1995；85(2): 532
3，Jones J，Morgan B P. Apoptosis is associated with reduced expression of complement regulatory molecules, adhesion molecules and other receptors on polymorphonuclear leucocytes: functional relevance and role in inflammation. Immunology，1995 86(4): 651
, 百拇医药
4，Greenlund L J S，Devkwerth T L，Johnson E M. Superoxide dismutase delays neuronal apoptosis: A role for reactive oxygen species in programmed neuonal death. Neuron，1995；14:303
5，Sandstrom P A，Mannie M D，Buttke T M. Inhibition of activation-induced death in T cell hybridomas by thiol antioxidants: oxidative stress as a mediator of apoptosis. J Leukocyte Biol，1994；55:221
6，Narayanan P K，Ragheb K，Lawler G et al. Defects in intracellular oxidative metabolism of neutrophils undergoing apoptosis. J Leukoc Biol，1997；61(4): 481
, http://www.100md.com
7，Kettritz R，Falk R J，Jennette J C et al. Neutrophil superoxide release is required for spontaneous and FMLP-mediated but not for TNF alpha-mediated apoptosis. J Am Soc Nephrol，1997；8(7): 1091
8，Liles W C，Klebanoff S J. Regulation of apoptosis in neutrophils-Fas track to death. J Immunol，1995；155:3289
9，Lee A，Whyte M K B，Haslett C et al. Inhibition of neutrophil apoptosis and prolongation of functional longevity by inflammatory mediators. J.Leukocyte Biol，1993；54:283
10，Whyte M K B，Meagher L C，MacDermot T et al. Impairment of function in aging neutrophils is associated with apoptosis. J Immunol，1993；150:5124
[收稿1999-07-16，修回1999-11-12], 百拇医药
单位：李英丽(解放军总医院基础所生化室，北京 100853)；陈泮藻(解放军总医院基础所生化室，北京 100853)；颜光涛(解放军总医院基础所生化室，北京 100853)
关键词：中性粒细胞；凋亡；吞噬；趋化；活性氧生成
中国免疫学杂志001006 摘 要 目的：为了探讨中性粒细胞(PMN)的自然凋亡和PMN凋亡对细胞吞噬、趋化和活性氧(ROS)生成等功能的影响。方法：采用光镜、电镜、电泳和流式细胞仪等研究手段探讨PMN的自然凋亡；通过葡萄球菌法、滤膜法和化学发光的方法研究凋亡PMN吞噬、趋化和ROS生成的改变。结果：分离健康成人外周血PMN，在体外进行10%血清培养，随着培养时间的延长，PMN凋亡率升高，同时PMN的吞噬、趋化以及ROS生成等功能都不同程度地受损。结论：外周血PMN在体外培养发生自然凋亡，PMN的凋亡与细胞功能相关。
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中国图书分类号 R392.12
The effect of apoptosis on neutrophil function
LI Ying-Li，CHEN Pan-Zao，YAN Guang-Tao
(Biochem. Lab. of the PLA General Hospital,Beijing 100853)
Abstract Objective: To understand the apoptosis of PMN in the absence of stimuli. To study the phagocytosis of apoptotic neutrophils，its ability to migrate toward a chemoattractant， and also its ability of superoxide releasing. Methods: PMN apoptosis was determined by light microscopy，electron-microscopy，gel electrophoresis and flow cytometry analysis. The phagocytosis of apoptotic neutrophil，its ability to migrate toward a chemoattractant，and its ability of superoxide releasing were also studied in this paper. Results: The rate of apoptosis of human PMN increased as the incubate time prolong. The phagocytosis of neutrophil，its ability to migrate toward a chemoattractant，and its ability of superoxide releasing were all decreased as it was cultured for a longer time. Conclusions: Neutrophil apoptosis could affect its function，the function of apoptotic neutrophil were decreased.
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Key words Polymorphonuclear neutrophils Apoptosis Phagocytosis Chemotaxis Superoxide releasing
细胞凋亡是近年来的研究热点，PMN作为机体防御系统的重要组成部分，其凋亡研究倍受关注。PMN的功能相当复杂，在接受机体发生组织损伤或感染的信息后，PMN游出血管，向炎症部位趋化游走，首先到达炎症局部，发挥其吞噬和杀菌功能。另外，PMN还产生大量O2*、H2O2等ROS。这一方面有利于入侵微生物的杀灭，另一方面也不可避免地损伤周围正常组织或细胞。为了研究PMN的凋亡是否直接抑制细胞在炎症介质激发下所产生的对机体具有潜在损伤性反应的能力，我们利用PMN自然凋亡的特性，观察健康成人外周血PMN在体外培养不同时间，细胞吞噬、趋化和活性氧生成等功能的改变。
1 材料与方法
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1.1 材料 发光光度仪及专用试管为LKB公司产品，Boyden趋化小室、滤膜为国产，鲁米诺购自Serva公司，佛波酯(PMA)为Sigma公司产品。
1.2 中性粒细胞分离与细胞基因组DNA提取 人外周血肝素抗凝，0.5% 甲基纤维素沉降红细胞；淋巴细胞分离液分离获得PMN。以酚:氯仿法抽提获得DNA，-20℃保存待用。
1.3 中性粒细胞形态学观察
1.3.1 光镜观察 采用瑞士-姬姆萨混合染色法，光镜下观察PMN，高倍视野计数100个细胞，计算凋亡细胞所占百分比。
1.3.2 电镜观察 2%戊二醛固定，2%低熔点胶包埋，电子染色，H-7000型透射电镜观察凋亡细胞内部结构变化并拍照。
1.4 中性粒细胞基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳观察 PMN基因组DNA以2%琼脂糖凝胶电泳，0.5%溴化乙锭(EB)染色，紫外透射仪下观察并拍照。
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1.5 中性粒细胞的流式细胞仪分析 70% 乙醇固定PMN，4℃ 过夜，终浓度100 μg/ml的RNaseA作用30 min，再加入终浓度为50 μg/ml的碘化丙锭(PI)，室温避光30 min，流式细胞仪检测。
1.6 中性粒细胞吞噬功能观察 采用葡萄球菌法：40孔培养板每孔加入30 μl PMN 2×106 ml-1和20 μl沸水煮过的金黄色葡萄球菌悬液6×108 ml-1，CO2孵箱培养30 min后以瑞士-姬姆萨复染法染色，显微镜下观察并计数200个PMN，分别求出吞噬百分率与吞噬指数。
1.7 中性粒细胞趋化性观察 采用滤膜法：Boyden趋化小室下室加入 0.1 mol/L PB (pH7.4) 100 μl和0.1 mg/ml PMA 20 μl，上室加入2×106 ml-1细胞悬液0.5 ml，CO2孵箱中温育2 h后取出滤膜，甲醇固定，0.5%苏木素染色10 min，蒸馏水漂洗，异丙醇脱水，二甲苯透明，透明后的滤膜原来向下的一面朝上，贴于洁净载玻片上，中性树脂封片后，油镜下观察。
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1.8 中性粒细胞活性氧生成观察 采用化学发光法：发光光度仪专用试管加入107 ml-1 细胞悬液200 μl，测定空白计数；又加入2 mg/ml鲁米诺5 μl，37℃孵育10 min，同时进行化学发光计数10 min；再加入0.1 mg/ml PMA 5 μl，轻摇2 s后立即进行化学发光计数。
2 结果
2.1 中性粒细胞凋亡观察 光镜和电镜下观察凋亡细胞特征性形态学改变的出现，结果显示，PMN在短时间内(3 h)就能发生自然凋亡，随着培养时间的延长(6，12，24 h)，细胞凋亡量增多(见表1)。电泳结果与光镜观察结果一致(见图1)。流式细胞仪分析体外培养0，3，6，20 h的PMN凋亡百分比和凋亡特征性亚二倍体峰的出现也与光镜观察结果一致(见图2)。
表1 不同时间点人中性粒细胞自然凋亡光镜及电泳检查结果
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Tab.1 Human PMN incubated in vitro and detected by light microscopy and gel electrophoresis Hours (h)
Times (n)
Apoptosis (%)
DNA-Ladder
0
3
0.33±0.58
-
3
3
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4.33±0.58
-
6
3
9.33±1.53
±
12
3
17.00±2.00
+
24
3
25.67±2.08
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++
Notes:“-”no DNA-Ladder；“±”weaker DNA-Ladder；“+”DNA-Ladder；“++”stronger DNA-Ladder. The SAS (Statistical Analysis System) was used for Statistical Analysis.Every two groups were analysed，P < 0.05 were considered extremely significant( P<0.05)
图1 不同时间点人中性粒细胞自然凋亡DNA-ladder
Fig.1 Gel electrophoresis of DNA from cultured PMNs
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Note:Lane1. λ DNA/EcoR Ⅰ +Hind Ⅲmarker(21 227,5 148,4 973,4 268)； Lane2.0 h； Lane3. 3 h；Lane4. 6 h; Lane5. 12 h; Lane6. 24 h
图2 不同时间点人中性粒细胞自然凋亡流式细胞仪分析结果
Fig.2 Human PMN incubated in vitro and assessed by FACs
图3 中性粒细胞24 h培养电镜观察(×2 500)
Fig.3 Humman PMN incubated for 24 hours observed by electron microscope(×2 500)
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2.2 凋亡中性粒细胞的功能变化
2.2.1 凋亡中性粒细胞吞噬功能观察 新鲜分离PMN(正常细胞组)与培养6 h的PMN(低凋亡组)以及培养20 h的PMN(高凋亡组)相比，随着细胞凋亡率的升高，PMN对金黄色葡萄球菌的吞噬率和吞噬指数均降低(见表2)。
2.2.2 凋亡中性粒细胞趋化性的观察 新鲜分离PMN与培养6 h PMN以及培养20 h PMN相比，随着细胞凋亡率的升高，在PMA(终浓度0.017 mg/mL)的趋化作用下穿透滤膜的PMN数减少(见表2)。2.2.3 凋亡中性粒细胞活性氧生成的观察 PMN自发产生的活性氧，随着培养时间的延长(0 、6、12、20 h)迅速减少(见图4A)；但是在PMA(终浓度0.002 mg/ml)激发下产生活性氧的能力，随着培养时间的延长，呈不断增加趋势(见图4B)。
表2 PMN凋亡与PMN吞噬率及吞噬指数
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Tab.2 The phagocytosis of apoptotic PMN Hours(h)
Times(n)
Apoptosis(%)
Phagocytosis rate
Phagocytosis number
Migrate toward chemoattractant
0
3
1.82±0.28
98.33±1.53
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18.70±2.68
31.200±4.56
6
3
20.85±0.71
82.00±5.57
10.13±1.16
24.400±4.22
20
3
33.80±0.39
47.00±4.58
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3.43±0.70
10.400±2.34
Notes:The SAS (Statistical Analysis System) was used for Statistical Analysis.Every two groups were analysed，P < 0.05 were considered extremely significant.( P<0.05)
图4 PMN凋亡与活性氧生成
Fig.4 PMN apoptosis and its ability of superoxide releasing
Notes:A.spontaneous superoxide releasing;B.stimulated superoxide releasing
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3 讨论
PMN是机体防御系统中的快速反应元件，在急性炎症刺激下首先到达炎症局部。本实验对凋亡PMN吞噬、趋化和活性氧生成等功能的改变进行了初步探讨。
3.1 凋亡中性粒细胞吞噬功能下降 PMN对细菌或异物的吞噬作用，是一个极其复杂的活动。与PMN膜表面的IgG 受体、C3b受体和细菌的对应抗体IgG以及补体C3b有关。文献报道，PMN发生凋亡时，CD16的表达下降[1，2]，CD16(FcγRⅢ)是IgG的低亲和力受体，CD16表达的降低可能导致凋亡PMN吞噬功能下降。
3.2 凋亡中性粒细胞趋化性减弱 PMN游出血管向炎症部位游走，主要靠化学激动作用和趋化性两种功能。很多物质能使PMN发生趋化性，如C3a，LTB4以及IL-1等。PMA也是一种趋化因子，对PMN具有较强的趋化活性和化学激动作用。关于趋化性的机制认为与PMN膜表面存在的能与趋化因子结合的受体有关。凋亡PMN趋化性的降低可以由PMN发生凋亡时细胞表面某些受体表达的减少来解释[1-3]。
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3.3 凋亡中性粒细胞活性氧的生成 本实验观察到PMN自发产生的ROS，随着培养时间的延长，迅速减少，但是在PMA激发下产生的ROS，随着培养时间的延长，呈不断增加趋势，提示凋亡PMN仍保持激活NADPH氧化酶系统的胞内信号传导途径。其原因虽待进一步探讨，但近来研究表明，PMN的凋亡与细胞保持氧化剂-抗氧化剂平衡的能力相关[6]，胞内ROS的积聚可以促进细胞的凋亡[4-5]。Kettritz等则指出，ROS的释放可能是PMN自然凋亡和FMLP作用下PMN凋亡的原因[7]。Bcl-2对细胞凋亡的抑制机制涉及减少ROS的产生和抑制ROS的活性，而PMN不表达Bcl-2及其相关癌基因Bcl-x[8]，这可能是PMN易于凋亡的原因之一。
本实验结果表明，随着培养时间的延长，PMN凋亡率升高，同时PMN的吞噬、趋化以及ROS生成等功能都不同程度地受损。从而提示，PMN的凋亡与细胞功能相关。Lee等发现，LPS既对细胞凋亡有抑制作用，又能保持细胞有关功能不受损害，这一结果支持了作者的观点[9]。 Whyte等的研究发现，PMN发生凋亡时，与细胞骨架有关的功能如伸展、变形、趋化等均完全或部分地丧失，而且凋亡PMN在FMLP等物质刺激下，脱颗粒[以髓过氧化物酶(MPO)的释放为标志]能力大大降低[10]。在ROS生成方面，凋亡PMN保持对PMA反应的能力[6,10]。这与我们的实验结果基本一致。
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综上所述，凋亡PMN虽然仍保持有害内容物， 但细胞实际上是处于一种与外界“功能分离”的状态。这种性质在Mφ不能及时吞噬清除凋亡PMN时格外重要， 因为单核细胞需要一段时间的成熟期才能发挥其吞噬功能。在Mφ功能超负荷时这种性质也很重要。与PMN凋亡相关的功能丧失，对控制急性炎症，促进炎症消退很重要。总之，特异性的诱导凋亡可能会成为治疗炎症的新方法。
国家自然科学基金资助项目(批准号39770716)
作者简介：李英丽，女，27岁，生物化学硕士
参考文献
1，Dransfield I， Buckle A M， Savill J S et al. Neutrophil apoptosis is associated with a reduction in CD16 (Fc gamma RIII) expression. J Immunol，1994；153(3): 1254
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[收稿1999-07-16，修回1999-11-12], 百拇医药