sgp130 cDNA在痘苗病毒载体系统中的表达
作者：李晓军1 董家新2 倪长源2 黎 燕2 沈倍奋2x{)z\2, 百拇医药
单位：李晓军 南京军区南京总医院检验科 南京 210002； 董家新 倪长源 黎 燕 沈倍奋 军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850x{)z\2, 百拇医药
关键词：gp130 痘苗病毒 基因表达x{)z\2, 百拇医药
免疫学杂志990108 摘 要 gp130是一种分子量为130kD的细胞膜糖蛋白，是IL-6等多种细胞因子共用的信号传递分子。本研究将含gp130胞外区全长的可溶性片段的基因(sgp 130 cDNA)构建到痘苗病毒载体中，并与野生型痘苗病毒在TK-143细胞中发生同源重组，用BudR和X-gal双重选择，得到带有人sgp130的重组痘苗病毒(Vsgp130)。采用IDA和Western Blotting法证实：感染Vsgp130的TK-143细胞上清中有较强的sgp130表达，表达产物分子量为100kD左右。x{)z\2, 百拇医药
中图号 R392.1.11x{)z\2, 百拇医药
EXPRESSION OF SOLUBLE gp130 GENE IN VACCINIA VIRUS SYSTEMx{)z\2, 百拇医药
Li Xiaojun，Dong Jiaxin，Ni Changyuan，Li Yan，Shen Beifenx{)z\2, 百拇医药
(Department of Laboratory Science，Nanjing General Hospital of Nanjing Command，Nanjing 210002)x{)z\2, 百拇医药
Abstract gp130 is a cell membrane glycoprotein of 130 kDa.Some cytokines such as IL-6，ciliary neurotrophic factor(CNTF)，oncostatin M(OM)and leukemia inhibitory factor(LIF) share the gp130 as a common signal transducer.We have constructed soluble gp130(sgp130)-recombinant expression vector by inserting the sgp130 cDNA into the vaccinia virus expression plasmid pJSA1175.This recombinant plasmid was then used for homologous recombination with the wild type vaccinia virus genome in TK-143 cells.sgp130-recombinant vaccinia virus(Vsgp130) was then obtained by the BudR and X-gal double sellections.Immunodot assay and Western blotting analysis showed that the recombinant vaccinia virus could express sgp130 into the supernatant of TK-143 cells and the molecular weight of expression product was about 100 kDa.
Key words gp130，Vaccinia virus，Gene expressionc*8o, 百拇医药
gp130是一种分子量为130kD，由896个氨基酸组成的细胞膜糖蛋白，其胞外区六个Ⅲ型Fn是细胞因子受体区域。gp130是IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)及IL-11等多种细胞因子共用的信号传递分子。IL-6等细胞因子首先与其特异性α受体结合，此复合物随后与gp130胞外区结合，达到细胞因子信号传递的目的[1～3]。本研究采用痘苗病毒载体pJSA1175作为表达载体，构建可溶性gp130(sgp130)重组载体，然后与野生型痘苗病毒发生同源重组，以此感染动物细胞表达sgp130基因。c*8o, 百拇医药
1 材料和方法c*8o, 百拇医药
1.1 质粒、细胞、病毒及酶和试剂 含有人gp130全长cDNA的质粒pBluescript/gp130由日本Hirano教授赠送。含人sgp130基因的质粒载体(pSVL/sgp130)由倪长源博士构建[4]。sgp130片段含gp130胞外区全长597个氨基酸，DNA全长约2.0kb。pJSA1175质粒、人骨肉瘤细胞系(TK-143)及天坛株痘苗病毒均由预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。限制性内切酶，Klenow酶和T4DNA连接酶均购自Promega公司和Sigma公司。5-溴脱氧尿苷(BudR)和X-gal为Sigma产品。抗人gp130单克隆抗体(McAb)由美国Ben Chen教授惠赠。c*8o, 百拇医药
1.2 sgp130重组痘苗病毒载体的构建 见图1。将经BamHI酶切的pSVL/sgp130用低熔点凝胶电泳法回收目的基因sgp130片段，用Klenow酶补平后，插入到已用SmaI酶切的pJSA 1175载体中，再用T4 DNA连接酶作平端连接，转化MC 1061受体菌，最后通过挑取菌落、抽提质粒和酶切鉴定筛选重组载体。
c*8o, 百拇医药
图1 重组痘苗病毒表达载体pJSA1175/sgp130的构建c*8o, 百拇医药
Fig 1 Construction of recombinant expression vector pJSA1175/sgp130
1.3 重组痘苗病毒的构建和筛选 TK-143细胞传代至80%成片后，用0.1pfu/ml剂量的天坛株痘苗病毒感染细胞，37°C吸附2h后移出病毒，用无血清、无抗生素的DMEM洗细胞两次，加适量无血清培养基后，缓慢加入重组质粒DNA与脂质体的混合物(按LipofectinTM产品说明书配制)。37°C培养5h，补加等量含4%FCS的DMEM，37°C继续培养48h。然后将转染细胞连瓶反复冻融3次以破碎细胞，1 000r/min离心5min，除去沉淀，上清作为重组病毒液用维持液(含2%FCS的DMEM)稀释不同浓度后感染80%成片的TK-143细胞。此时培养液中含有25μg/ml BudR以抑制非重组的痘苗病毒，48h后在感染细胞上铺盖含有200μg/ml X-gal的1%营养琼脂，37°C培养24h，挑取单个蓝色病毒蚀斑，冻融3次后再接种TK-143细胞，连续纯化三代。nr}*%, 百拇医药
1.4 重组痘苗病毒的扩增和纯化 挑取已纯化至100%的单个蓝色病毒蚀斑，冻融3次后接种到80%成片的TK-143细胞；37°C吸附2h，补2%DMEM后置37°C 48h，吹打细胞至离心管中；冻融3次，冰浴超声粉碎细胞；800r/min低速离心5min，除去大的细胞碎片；上清再12 000r/min离心20min，沉淀即为重组病毒(Vsgp130)。取沉淀再感染细胞，如此反复扩增纯化6次，使病毒滴度达108pfu/ml。重组病毒用无菌PBS洗2次，溶于无菌PBS中，分装，于-70°C保存准备免疫动物用。nr}*%, 百拇医药
1.5 Western Blotting 收集感染重组病毒(V-sgp130)及野生型痘苗病毒(VTT)48h的TK-143细胞，12 000r/min离心20min；取上清浓缩10倍后，各取400μl加100μl样品处理液，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳(100V，1.5h)；然后用电转印仪(Bio-Rad)转印至硝酸纤维素膜(0.45μm，Schleicher ＆ Schue 11产品)，转印条件40V，4h，取出转印膜后浸泡于5%脱脂奶粉，37°C封闭1h；洗涤3次后依次浸泡于标准大鼠抗人gp130 McAb和HRP-兔抗大鼠IgG，室温下各反应1h；洗后加入DAB-H2O2显色。nr}*%, 百拇医药
1.6 免疫斑点结合试验(IDA) 取感染VTT和重组病毒48h的细胞上清，用PBS倍比稀释(原液1∶2，1∶4，1∶8，1∶16)后各取200μl用点样器点于硝酸纤维素膜上；抽干液体后置15%酪蛋白中37°C封闭1h；洗涤后依次浸泡于标准抗gp130 McAb、兔抗大鼠IgG-HRP中，最后用DAB-H2O2显色。
2 结果i&aier, 百拇医药
2.1 表达载体的构建和鉴定 酶切电泳图谱(见图2)显示：构建的载体经EcoRI酶切可得到一个约2.4kb的片段，为正向插入的重组子，其中含2.0kb sgp130及400bp的痘苗病毒启动子序列；经XhoI及PstI双酶切，可得到一个约520bp的片段。PstI为sgp130基因中的一个酶切位点，距离SmaI位点约124bp。上述结果证实已成功构建了表达载体pJSA 1175/sgp130。
i&aier, 百拇医药
图2 表达载体的酶切鉴定i&aier, 百拇医药
Fig 2 Restriction analysis of recombinant expression vectori&aier, 百拇医药
1：pBR322/BstNI marker； 2：pJSA1175-sgp130/PstI+XhoI；i&aier, 百拇医药
3：pJSA1175-sgp130/EcoRI； 4：pJSA1175/EcoRIi&aier, 百拇医药
5：pJSA1175-sgp130； 6：pJSA1175i&aier, 百拇医药
7：λ DNA/EcoRI+HindⅢ markeri&aier, 百拇医药
2.2 重组痘苗病毒的鉴定 构建好的表达载体用脂质体转染技术导入在1～2h前已用野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞，插入的sgp130基因利用其两侧的TK基因区与天坛株痘苗病毒基因组发生同源重组，获得带有sgp130的全痘苗病毒DNA。这种重组病毒由于TK基因的插入失活，可在BudR存在下存活，而非重组痘苗病毒则受BudR抑制而死亡。另外，与外源基因同时表达的LacZ基因，在底物X-gal的存在下可显示蓝色蚀斑。这样，在BudR和X-gal的双重选择下，通过挑取单个蓝色蚀斑进行病毒纯化，共纯化3次，最终得到了sgp130重组痘苗病毒，3次出现的蓝斑数与白斑数之比为1∶8、30∶28和188∶2；获得的蓝斑率分别为0.1%、51.7%和98.9%。i&aier, 百拇医药
2.3 重组痘苗病毒表达产物的鉴定 IDA法结果提示：用不同浓度的重组痘苗病毒感染上清点膜后，与标准单抗及酶标记物反应，膜上可出现明显的黄褐色斑点，其呈色深浅与点样量成显著的正相关关系(见图3)。进一步用Western Blotting法证实，重组病毒感染上清液在分子量约100kD处有明显的单一条带，VTT感染上清液则未出现同样色带。
图3 IDA法检测sgp130的表达ep, 百拇医药
Fig 3 Detection of sgp130 expression by IDAep, 百拇医药
Lane A：supernatant of TK-143 cell infected by Vsgp130(diluted by 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16 from left to right)ep, 百拇医药
Lane B：supernatant of TK-143 cell infected by VTT(diluted by 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16 from left to right)ep, 百拇医药
3 讨论ep, 百拇医药
gp130作为一种Ⅰ型跨膜蛋白，由597个氨基酸胞外区，22个氨基酸跨膜区及277个氨基酸胞内区组成。其胞外区第二、三个Ⅲ型Fn构成细胞因子受体区域，能与IL-6、LIF、CNTF、IL-11等细胞因子及其受体的复合物发生偶联，三者形成有生物活性的复合体，并通过激活细胞内多种激酶导致蛋白磷酸化和基因表达。含胞外区全长的gp130分子在介导上述细胞因子信号传导的过程中起重要作用。国外研究资料表明：含gp130胞外区的可溶性片段(sgp130)能与IL-6及sIL-6R复合物发生结合，拮抗IL-6的生物学活性[5，6]。ep, 百拇医药
为有效表达sgp130并为制备抗gp130 McAb打下基础，我们选择痘苗病毒载体作为表达系统表达sgp130并获得成功。痘苗病毒表达系统是一种有效的真核细胞表达系统[7]，它插入外源基因容量大、表达量高，表达产物可以进行加工如糖基化，使其接近天然产物的生物学活性并能分泌至胞外或定位于细胞膜上。pJSA1175质粒含有天坛株痘苗病毒11k晚期蛋白启动子(P11)和P7.5早晚期反向串联启动子，进行同源重组的TK基因及便于选择重组痘苗病毒的LacZ基因，我们采用pJSA1175作为痘苗病毒载体。将sgp130 cDNA平端插入其SmaI位点，使其位于P7.5K启动子下游，构建成sgp130重组表达载体，再将此重组质粒采用脂质体转染法导入在2h前已感染了VTT的TK-143细胞，使重组痘苗病毒载体与VTT发生TK基因同源重组，获得了带有sgp130基因的全痘苗病毒，用此病毒感染TK-143宿主细胞表达sgp130。我们用IDA和Western Blotting均已证实，在Vsgp130感染的细胞上清中有明显的sgp130的表达，表达产物分子量在100kD左右。重组痘苗病毒表达sgp130的成功，为我们进一步研究细胞因子的信号传导机制及抗sgp130单克隆抗体的制备提供了有利的基础。
第一作者：女，36岁，硕士，副主任技师m, 百拇医药
参考文献m, 百拇医药
[1] Taga T，Hibi M，Hirata Y，et al.Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer，gp130.Cell，1989，58：573m, 百拇医药
[2] Hibi M，Murakami M，Saito M，et al.Molecular cloning and expression of an IL-6 signal transducer，gp130.Cell，1990，63：1149m, 百拇医药
[3] Horsten U，Schmitz-Van de Leur H，Mullberg J，et al.The membrane distal half of gp130 is responsible for the formation of a ternary complex with IL-6 and the IL-6 receptor.FEBS Letters，1995，360：43m, 百拇医药
[4] 倪长源，沈倍奋，黎 燕，等.可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究.中华实验与临床病毒学杂志，1996，10：347m, 百拇医药
[5] Paonessa G，Graziani R，De Serio A，et al.Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gp130 dimer formation and signalling.EMBO J，1995，14：1942m, 百拇医药
[6] Yasukawa K，Futatsugi K，Saito T，et al.Association of recombinant soluble IL-6-signal transducer，gp130，with a complex of IL-6 and soluble IL-6 receptor，and establishment of an ELISA for soluble gp130.Immunol Lett，1992，31：123m, 百拇医药
[7] Sandhu JS，Kennedy JF.Expression of the merozoite surface protein gp195 in vaccinia virus.Vaccine，1994，12：56m, 百拇医药
(1998-01-04收稿；1998-05-15修回)(李晓军1 董家新2 倪长源2 黎 燕2 沈倍奋2)
单位：李晓军 南京军区南京总医院检验科 南京 210002； 董家新 倪长源 黎 燕 沈倍奋 军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850x{)z\2, 百拇医药
关键词：gp130 痘苗病毒 基因表达x{)z\2, 百拇医药
免疫学杂志990108 摘 要 gp130是一种分子量为130kD的细胞膜糖蛋白，是IL-6等多种细胞因子共用的信号传递分子。本研究将含gp130胞外区全长的可溶性片段的基因(sgp 130 cDNA)构建到痘苗病毒载体中，并与野生型痘苗病毒在TK-143细胞中发生同源重组，用BudR和X-gal双重选择，得到带有人sgp130的重组痘苗病毒(Vsgp130)。采用IDA和Western Blotting法证实：感染Vsgp130的TK-143细胞上清中有较强的sgp130表达，表达产物分子量为100kD左右。x{)z\2, 百拇医药
中图号 R392.1.11x{)z\2, 百拇医药
EXPRESSION OF SOLUBLE gp130 GENE IN VACCINIA VIRUS SYSTEMx{)z\2, 百拇医药
Li Xiaojun，Dong Jiaxin，Ni Changyuan，Li Yan，Shen Beifenx{)z\2, 百拇医药
(Department of Laboratory Science，Nanjing General Hospital of Nanjing Command，Nanjing 210002)x{)z\2, 百拇医药
Abstract gp130 is a cell membrane glycoprotein of 130 kDa.Some cytokines such as IL-6，ciliary neurotrophic factor(CNTF)，oncostatin M(OM)and leukemia inhibitory factor(LIF) share the gp130 as a common signal transducer.We have constructed soluble gp130(sgp130)-recombinant expression vector by inserting the sgp130 cDNA into the vaccinia virus expression plasmid pJSA1175.This recombinant plasmid was then used for homologous recombination with the wild type vaccinia virus genome in TK-143 cells.sgp130-recombinant vaccinia virus(Vsgp130) was then obtained by the BudR and X-gal double sellections.Immunodot assay and Western blotting analysis showed that the recombinant vaccinia virus could express sgp130 into the supernatant of TK-143 cells and the molecular weight of expression product was about 100 kDa.
Key words gp130，Vaccinia virus，Gene expressionc*8o, 百拇医药
gp130是一种分子量为130kD，由896个氨基酸组成的细胞膜糖蛋白，其胞外区六个Ⅲ型Fn是细胞因子受体区域。gp130是IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)及IL-11等多种细胞因子共用的信号传递分子。IL-6等细胞因子首先与其特异性α受体结合，此复合物随后与gp130胞外区结合，达到细胞因子信号传递的目的[1～3]。本研究采用痘苗病毒载体pJSA1175作为表达载体，构建可溶性gp130(sgp130)重组载体，然后与野生型痘苗病毒发生同源重组，以此感染动物细胞表达sgp130基因。c*8o, 百拇医药
1 材料和方法c*8o, 百拇医药
1.1 质粒、细胞、病毒及酶和试剂 含有人gp130全长cDNA的质粒pBluescript/gp130由日本Hirano教授赠送。含人sgp130基因的质粒载体(pSVL/sgp130)由倪长源博士构建[4]。sgp130片段含gp130胞外区全长597个氨基酸，DNA全长约2.0kb。pJSA1175质粒、人骨肉瘤细胞系(TK-143)及天坛株痘苗病毒均由预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。限制性内切酶，Klenow酶和T4DNA连接酶均购自Promega公司和Sigma公司。5-溴脱氧尿苷(BudR)和X-gal为Sigma产品。抗人gp130单克隆抗体(McAb)由美国Ben Chen教授惠赠。c*8o, 百拇医药
1.2 sgp130重组痘苗病毒载体的构建 见图1。将经BamHI酶切的pSVL/sgp130用低熔点凝胶电泳法回收目的基因sgp130片段，用Klenow酶补平后，插入到已用SmaI酶切的pJSA 1175载体中，再用T4 DNA连接酶作平端连接，转化MC 1061受体菌，最后通过挑取菌落、抽提质粒和酶切鉴定筛选重组载体。
c*8o, 百拇医药图1 重组痘苗病毒表达载体pJSA1175/sgp130的构建c*8o, 百拇医药
Fig 1 Construction of recombinant expression vector pJSA1175/sgp130
1.3 重组痘苗病毒的构建和筛选 TK-143细胞传代至80%成片后，用0.1pfu/ml剂量的天坛株痘苗病毒感染细胞，37°C吸附2h后移出病毒，用无血清、无抗生素的DMEM洗细胞两次，加适量无血清培养基后，缓慢加入重组质粒DNA与脂质体的混合物(按LipofectinTM产品说明书配制)。37°C培养5h，补加等量含4%FCS的DMEM，37°C继续培养48h。然后将转染细胞连瓶反复冻融3次以破碎细胞，1 000r/min离心5min，除去沉淀，上清作为重组病毒液用维持液(含2%FCS的DMEM)稀释不同浓度后感染80%成片的TK-143细胞。此时培养液中含有25μg/ml BudR以抑制非重组的痘苗病毒，48h后在感染细胞上铺盖含有200μg/ml X-gal的1%营养琼脂，37°C培养24h，挑取单个蓝色病毒蚀斑，冻融3次后再接种TK-143细胞，连续纯化三代。nr}*%, 百拇医药
1.4 重组痘苗病毒的扩增和纯化 挑取已纯化至100%的单个蓝色病毒蚀斑，冻融3次后接种到80%成片的TK-143细胞；37°C吸附2h，补2%DMEM后置37°C 48h，吹打细胞至离心管中；冻融3次，冰浴超声粉碎细胞；800r/min低速离心5min，除去大的细胞碎片；上清再12 000r/min离心20min，沉淀即为重组病毒(Vsgp130)。取沉淀再感染细胞，如此反复扩增纯化6次，使病毒滴度达108pfu/ml。重组病毒用无菌PBS洗2次，溶于无菌PBS中，分装，于-70°C保存准备免疫动物用。nr}*%, 百拇医药
1.5 Western Blotting 收集感染重组病毒(V-sgp130)及野生型痘苗病毒(VTT)48h的TK-143细胞，12 000r/min离心20min；取上清浓缩10倍后，各取400μl加100μl样品处理液，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳(100V，1.5h)；然后用电转印仪(Bio-Rad)转印至硝酸纤维素膜(0.45μm，Schleicher ＆ Schue 11产品)，转印条件40V，4h，取出转印膜后浸泡于5%脱脂奶粉，37°C封闭1h；洗涤3次后依次浸泡于标准大鼠抗人gp130 McAb和HRP-兔抗大鼠IgG，室温下各反应1h；洗后加入DAB-H2O2显色。nr}*%, 百拇医药
1.6 免疫斑点结合试验(IDA) 取感染VTT和重组病毒48h的细胞上清，用PBS倍比稀释(原液1∶2，1∶4，1∶8，1∶16)后各取200μl用点样器点于硝酸纤维素膜上；抽干液体后置15%酪蛋白中37°C封闭1h；洗涤后依次浸泡于标准抗gp130 McAb、兔抗大鼠IgG-HRP中，最后用DAB-H2O2显色。
2 结果i&aier, 百拇医药
2.1 表达载体的构建和鉴定 酶切电泳图谱(见图2)显示：构建的载体经EcoRI酶切可得到一个约2.4kb的片段，为正向插入的重组子，其中含2.0kb sgp130及400bp的痘苗病毒启动子序列；经XhoI及PstI双酶切，可得到一个约520bp的片段。PstI为sgp130基因中的一个酶切位点，距离SmaI位点约124bp。上述结果证实已成功构建了表达载体pJSA 1175/sgp130。
i&aier, 百拇医药图2 表达载体的酶切鉴定i&aier, 百拇医药
Fig 2 Restriction analysis of recombinant expression vectori&aier, 百拇医药
1：pBR322/BstNI marker； 2：pJSA1175-sgp130/PstI+XhoI；i&aier, 百拇医药
3：pJSA1175-sgp130/EcoRI； 4：pJSA1175/EcoRIi&aier, 百拇医药
5：pJSA1175-sgp130； 6：pJSA1175i&aier, 百拇医药
7：λ DNA/EcoRI+HindⅢ markeri&aier, 百拇医药
2.2 重组痘苗病毒的鉴定 构建好的表达载体用脂质体转染技术导入在1～2h前已用野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞，插入的sgp130基因利用其两侧的TK基因区与天坛株痘苗病毒基因组发生同源重组，获得带有sgp130的全痘苗病毒DNA。这种重组病毒由于TK基因的插入失活，可在BudR存在下存活，而非重组痘苗病毒则受BudR抑制而死亡。另外，与外源基因同时表达的LacZ基因，在底物X-gal的存在下可显示蓝色蚀斑。这样，在BudR和X-gal的双重选择下，通过挑取单个蓝色蚀斑进行病毒纯化，共纯化3次，最终得到了sgp130重组痘苗病毒，3次出现的蓝斑数与白斑数之比为1∶8、30∶28和188∶2；获得的蓝斑率分别为0.1%、51.7%和98.9%。i&aier, 百拇医药
2.3 重组痘苗病毒表达产物的鉴定 IDA法结果提示：用不同浓度的重组痘苗病毒感染上清点膜后，与标准单抗及酶标记物反应，膜上可出现明显的黄褐色斑点，其呈色深浅与点样量成显著的正相关关系(见图3)。进一步用Western Blotting法证实，重组病毒感染上清液在分子量约100kD处有明显的单一条带，VTT感染上清液则未出现同样色带。
图3 IDA法检测sgp130的表达ep, 百拇医药
Fig 3 Detection of sgp130 expression by IDAep, 百拇医药
Lane A：supernatant of TK-143 cell infected by Vsgp130(diluted by 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16 from left to right)ep, 百拇医药
Lane B：supernatant of TK-143 cell infected by VTT(diluted by 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16 from left to right)ep, 百拇医药
3 讨论ep, 百拇医药
gp130作为一种Ⅰ型跨膜蛋白，由597个氨基酸胞外区，22个氨基酸跨膜区及277个氨基酸胞内区组成。其胞外区第二、三个Ⅲ型Fn构成细胞因子受体区域，能与IL-6、LIF、CNTF、IL-11等细胞因子及其受体的复合物发生偶联，三者形成有生物活性的复合体，并通过激活细胞内多种激酶导致蛋白磷酸化和基因表达。含胞外区全长的gp130分子在介导上述细胞因子信号传导的过程中起重要作用。国外研究资料表明：含gp130胞外区的可溶性片段(sgp130)能与IL-6及sIL-6R复合物发生结合，拮抗IL-6的生物学活性[5，6]。ep, 百拇医药
为有效表达sgp130并为制备抗gp130 McAb打下基础，我们选择痘苗病毒载体作为表达系统表达sgp130并获得成功。痘苗病毒表达系统是一种有效的真核细胞表达系统[7]，它插入外源基因容量大、表达量高，表达产物可以进行加工如糖基化，使其接近天然产物的生物学活性并能分泌至胞外或定位于细胞膜上。pJSA1175质粒含有天坛株痘苗病毒11k晚期蛋白启动子(P11)和P7.5早晚期反向串联启动子，进行同源重组的TK基因及便于选择重组痘苗病毒的LacZ基因，我们采用pJSA1175作为痘苗病毒载体。将sgp130 cDNA平端插入其SmaI位点，使其位于P7.5K启动子下游，构建成sgp130重组表达载体，再将此重组质粒采用脂质体转染法导入在2h前已感染了VTT的TK-143细胞，使重组痘苗病毒载体与VTT发生TK基因同源重组，获得了带有sgp130基因的全痘苗病毒，用此病毒感染TK-143宿主细胞表达sgp130。我们用IDA和Western Blotting均已证实，在Vsgp130感染的细胞上清中有明显的sgp130的表达，表达产物分子量在100kD左右。重组痘苗病毒表达sgp130的成功，为我们进一步研究细胞因子的信号传导机制及抗sgp130单克隆抗体的制备提供了有利的基础。
第一作者：女，36岁，硕士，副主任技师m, 百拇医药
参考文献m, 百拇医药
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(1998-01-04收稿；1998-05-15修回)(李晓军1 董家新2 倪长源2 黎 燕2 沈倍奋2)