雷公藤甲素对诱导CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用
作者：林科雄 王长征 钱桂生;, http://www.100md.com
单位：林科雄(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)； 王长征(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)； 钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037);, http://www.100md.com
关键词：T细胞；凋亡；雷公藤;, http://www.100md.com
免疫学杂志000107 摘 要：目的 探讨雷公藤甲素对CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用。方法 分离后的正常人外周血CD4+、CD8+T细胞在体外培养条件下，加入雷公藤甲素处理，然后用3′末端脱氧核苷酸基(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测凋亡细胞。结果 雷公藤甲素处理后CD4+和CD8+T细胞凋亡率比对照组显著增加(P<0.01)，但CD4+、CD8+T细胞凋亡率则无显著差别(P>0.05)。结论 雷公藤甲素能诱导活化的CD4+、CD8+T细胞凋亡，但其作用无特异性。;, http://www.100md.com
中图分类号：R932 文献标识码：A;, http://www.100md.com
Effects of triptolide on apoptosis of CD4+ and CD8+ T cells;, http://www.100md.com
LIN Ke-xiong，WANG Chang-zheng，QIAN Gui-sheng;, http://www.100md.com
(Department of Respiratory Deseases，Xinqiao Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China);, http://www.100md.com
Abstract：Objective To investigate the effects of triptolide on apoptosis of CD4+ and CD8+ T lymphocytes.Methods Purified CD4+ and CD8+ T cells were cultured in the presence or absence of triptolide for 12 hours.The apoptotic cells were detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling(TUNEL).Results The apoptotic rates of CD4+ and CD8+ T lymphocytes treated with triptolide were significantly higher than that treated with ConA alone (P<0.01)，but the apoptotic rates between CD4+ and CD8+ T cells had no difference (P>0.05).Conclusion The immunosupression roles of triptolide are associated with nonselective induction of apoptosis of activated CD4+ and CD8+ T cells.
Key words：T cells； apoptosis； triptolide▲9m21+v2, 百拇医药
雷公藤是卫茅科植物，具有抗炎、抑制免疫的作用。临床上常用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、支气管哮喘等，但其作用机制尚不完全清楚。CD4+ T细胞增多或/和CD4+/CD8+T细胞比例增加是支气管哮喘和类风湿性关节炎免疫紊乱的机制之一[1，2]。肾病综合征患者外周血CD4+、CD8+T细胞变化各家报道不尽一致[3，4]，但是CD4+T细胞因具有辅助、诱导细胞及体液免疫作用，可能对肾病综合征的免疫失调有重要作用。因此，探讨雷公藤甲素对CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用有利于阐明雷公藤对这些疾病的治疗作用。本研究采用原位细胞凋亡检测，探讨雷公藤甲素对CD4+、CD8+T细胞凋亡的影响。9m21+v2, 百拇医药
1 材料和方法9m21+v2, 百拇医药
1.1 主要试剂 淋巴细胞分离液(密度1.077)(上海试剂二厂)，伴刀豆蛋白(ConA)(Sigma公司)，小鼠抗人CD4和CD8单克隆抗体IgG1(邦定生物医学产品)，雷公藤甲素(福建中医药研究所)，S-AP法人淋巴细胞亚群检测试剂盒(中山生物有限公司)，TUNEL检测试剂盒(宝灵曼公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)。9m21+v2, 百拇医药
1.2 正常人CD4+、CD8+ T细胞的分离、培养 按XU[5]介绍的方法进行。即抽取正常健康志愿者外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用含10%小牛血清的RPMI1640液重悬细胞至1×106/ml，将细胞悬液加入已用1×Hanks液和RPMI1640洗过的尼龙纤维柱中，37°C、5%CO2孵箱中孵育1h后，收集流出的细胞悬液，用RPMI1640液洗柱两次并收集细胞。按5×105细胞加入小鼠抗人CD4或CD8单克隆抗体1μl，置冰上反应40min。用1×Hanks液漂洗两次后用RPMI1640液重悬细胞，以1×108细胞加入补体(新鲜豚鼠血清)1ml，37°C，5%CO2孵箱中反应45min。用1×Hanks液充分漂洗后用RPMI1640液重悬，并以每孔1×105细胞培养于96孔平底培养板内，每孔加入ConA至终浓度25μg/ml，总体积200μl。置37°C，5%CO2孵箱中，6h后相应孔中加入雷公藤甲素至终浓度10-5M，再培养12h后收集细胞。用台盼蓝计数细胞存活率>90%，涂片，4%多聚甲醛固定30min。用于细胞亚型鉴定和细胞凋亡检测。
1.3 CD3、CD4、CD8免疫细胞(ICC)杂色 免疫组化染色方法参见试剂盒说明书进行。主要步骤为：PBS漂洗，加入一抗20μl/片，37°C，1h。PBS漂洗，加入二抗20μl/片，37°C，1h。PBS漂洗，加入三抗20μl/片，37°C，1h。PBS漂洗，AP-Ped显色30min。在高倍光镜下，随机选择视野，至少观察200个细胞以上，分别计数CD3+、CD4+、CD8+细胞百分率。#[&-h2], 百拇医药
1.4 TUNEL染色 参见试剂盒说明书略加修正进行，即PBS漂洗，0.1%Triton X-100 4°C通透2min。PBS漂洗，0.03%H2O2/0.01%NaN3封闭30min。PBS漂洗，加入由TdT、脱氧三磷酸核苷(dNTP)和荧光素标记dUTP组成的TUNEL反应混合液20μl/片，37°C反应1h。PBS漂洗，加入过氧化物酶(POD)标记的抗荧光素抗体20μl/片，37°C反应30min。PBS漂洗，0.05%DAB/0.01% H2O2显色，光镜下控制显色深浅。苏木素复染。在高倍光镜下随机选择视野，至少观察200个细胞以上，计数CD4+、CD8+T淋巴细胞凋亡率。#[&-h2], 百拇医药
凋亡率(%)＝凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%#[&-h2], 百拇医药
2 结果#[&-h2], 百拇医药
2.1 CD3+、CD4+、CD8+细胞纯度鉴定结果 按本文方法分离的细胞，S-AP法染色可见阳性细胞胞膜被染成红色，而阴性对照无着色。CD3+、CD4+、CD8+细胞纯度均>95%。#[&-h2], 百拇医药
2.2 雷公藤甲素诱导正常人外周血CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用 对照组CD4+和CD8+T细胞的凋亡率(分别为12.2±3.7和13.4±4.3)无显著差异(P>0.05)。雷公藤甲素组CD4+和CD8+T细胞的凋亡率(分别为36.7±4.6和37.2±3.1)也无显著差别(P>0.05)。而雷公藤甲素组CD4+、CD8+T细胞凋亡率显著高于对照组的CD4+、CD8+T细胞凋亡率(P<0.01)。结果见图1。
图1 CD4+、CD8+T细胞凋亡变化(%)@2, 百拇医药
Fig1 The changes of apoptosis of CD4+、CD8+T cells(%)by comparing with normal control，P<0.01@2, 百拇医药
3 讨论@2, 百拇医药
CD4+T细胞在许多免疫性疾病的发病中起重要作用[1～3]。CD4+T细胞通过产生细胞因子等，诱导T细胞转变为效应细胞，促进B细胞产生抗体和活化巨噬细胞，具有辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。文献报道，雷公藤能抑制植物血凝素(PHA)诱导的淋巴细胞增殖、活化[6]以及IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-8、TNF等多种细胞因子的产生[7，8]。本文实验结果表明，雷公藤甲素能诱导ConA刺激活化的CD4+T细胞凋亡。因此，我们推测雷公藤可能诱导CD4+T细胞凋亡减少其细胞数量，进而减少其细胞因子的表达和分泌，是其免疫调制作用的重要机制。@2, 百拇医药
CD8+T细胞具有抑制体液免疫以及抗病毒、抗肿瘤等免疫功能。本文研究证明，雷公藤甲素也能诱导ConA刺激活化的CD8+T细胞凋亡，与其诱导CD4+T细胞凋亡的作用无显著差别，表明雷公藤甲素诱导T细胞凋亡的作用是非特异性的，既能诱导CD4+T细胞凋亡，也能诱导CD8+T细胞凋亡。所以，在临床应用时应注意雷公藤这种非特异性免疫抑制作用可能带来的副作用。@2, 百拇医药
糖皮质激素是治疗免疫反应性疾病的有效药物，但长期应用可产生一系列的全身性副作用。有研究证实[9]，雷公藤与强的松的药理作用具有互补性，但雷公藤无抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的作用。因此，糖皮质激素和雷公藤交替使用或者两药减量合用，可能对防止长期应用这两种药产生的副作用有重要意义。■@2, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870946)@2, 百拇医药
作者简介：林科雄(1969-)，男，贵州织金人，主治医师，硕士，主要从事哮喘炎症机制的研究。
参考文献：-\6w, 百拇医药
[1]CORRIGAN CJ，KAY AB.CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Relation to disease severity and atopic status[J].Am Rev Respir Dis，1990，141(3)：970～977.-\6w, 百拇医药
[2]王国秦，吴东海.雷公藤对类风湿性关节炎患者淋巴细胞亚群的影响[J].中华内科杂志，1994，33(1)：41～43.-\6w, 百拇医药
[3]梁大才，杨锡强.李成荣，等.儿童肾病综合征外周血T淋巴细胞亚群的检测[J].上海免疫学杂志，1989，9(2)：107～109.-\6w, 百拇医药
[4]LIN CY，YANG YM，FU YE.T cell subset in glo-merulonephritis[J].Int J Pediatr Nephro，1986；7(2)：63～66.-\6w, 百拇医药
[5]XU H，HEEGER PS，FAIRCHILD RL.Distinct role for B7-1 determinants during priming of effector CD8+ Tcl and regulatory CD4+ Th2 cell for contact hypersensitivity[J].J Immunol，1997，159(29)：4217～4226.-\6w, 百拇医药
[6]吴国福，朱立平.崔莲仙，等.雷公藤总甙(TⅡ)对IL-2和IL-2R基因转录的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，1993，13(3)：193～197.-\6w, 百拇医药
[7]金远林，王长征，王春霞，等.哮喘豚鼠细胞因子表达及雷公藤的影响[J].第三军医大学学报，1998，20(3)：202～204.-\6w, 百拇医药
[8]王长征，王春霞，金远林，等.哮喘豚鼠IL-5、IL-3、GM-CSFmRNA表达及雷公藤内酯醇的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(2)：145～148.-\6w, 百拇医药
[9]胡大伟，刘沛霖.雷公藤与强的松药理作用的互补性[J].中国中西医结合杂志，1997，17(2)：94～96.-\6w, 百拇医药
收稿日期：1999-06-17-\6w, 百拇医药
修回日期：1999-09-11(林科雄 王长征 钱桂生)
单位：林科雄(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)； 王长征(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037)； 钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸内科研究所，重庆 400037);, http://www.100md.com
关键词：T细胞；凋亡；雷公藤;, http://www.100md.com
免疫学杂志000107 摘 要：目的 探讨雷公藤甲素对CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用。方法 分离后的正常人外周血CD4+、CD8+T细胞在体外培养条件下，加入雷公藤甲素处理，然后用3′末端脱氧核苷酸基(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测凋亡细胞。结果 雷公藤甲素处理后CD4+和CD8+T细胞凋亡率比对照组显著增加(P<0.01)，但CD4+、CD8+T细胞凋亡率则无显著差别(P>0.05)。结论 雷公藤甲素能诱导活化的CD4+、CD8+T细胞凋亡，但其作用无特异性。;, http://www.100md.com
中图分类号：R932 文献标识码：A;, http://www.100md.com
Effects of triptolide on apoptosis of CD4+ and CD8+ T cells;, http://www.100md.com
LIN Ke-xiong，WANG Chang-zheng，QIAN Gui-sheng;, http://www.100md.com
(Department of Respiratory Deseases，Xinqiao Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China);, http://www.100md.com
Abstract：Objective To investigate the effects of triptolide on apoptosis of CD4+ and CD8+ T lymphocytes.Methods Purified CD4+ and CD8+ T cells were cultured in the presence or absence of triptolide for 12 hours.The apoptotic cells were detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling(TUNEL).Results The apoptotic rates of CD4+ and CD8+ T lymphocytes treated with triptolide were significantly higher than that treated with ConA alone (P<0.01)，but the apoptotic rates between CD4+ and CD8+ T cells had no difference (P>0.05).Conclusion The immunosupression roles of triptolide are associated with nonselective induction of apoptosis of activated CD4+ and CD8+ T cells.
Key words：T cells； apoptosis； triptolide▲9m21+v2, 百拇医药
雷公藤是卫茅科植物，具有抗炎、抑制免疫的作用。临床上常用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、支气管哮喘等，但其作用机制尚不完全清楚。CD4+ T细胞增多或/和CD4+/CD8+T细胞比例增加是支气管哮喘和类风湿性关节炎免疫紊乱的机制之一[1，2]。肾病综合征患者外周血CD4+、CD8+T细胞变化各家报道不尽一致[3，4]，但是CD4+T细胞因具有辅助、诱导细胞及体液免疫作用，可能对肾病综合征的免疫失调有重要作用。因此，探讨雷公藤甲素对CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用有利于阐明雷公藤对这些疾病的治疗作用。本研究采用原位细胞凋亡检测，探讨雷公藤甲素对CD4+、CD8+T细胞凋亡的影响。9m21+v2, 百拇医药
1 材料和方法9m21+v2, 百拇医药
1.1 主要试剂 淋巴细胞分离液(密度1.077)(上海试剂二厂)，伴刀豆蛋白(ConA)(Sigma公司)，小鼠抗人CD4和CD8单克隆抗体IgG1(邦定生物医学产品)，雷公藤甲素(福建中医药研究所)，S-AP法人淋巴细胞亚群检测试剂盒(中山生物有限公司)，TUNEL检测试剂盒(宝灵曼公司)，RPMI1640培养基(Gibco公司)。9m21+v2, 百拇医药
1.2 正常人CD4+、CD8+ T细胞的分离、培养 按XU[5]介绍的方法进行。即抽取正常健康志愿者外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液的密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用含10%小牛血清的RPMI1640液重悬细胞至1×106/ml，将细胞悬液加入已用1×Hanks液和RPMI1640洗过的尼龙纤维柱中，37°C、5%CO2孵箱中孵育1h后，收集流出的细胞悬液，用RPMI1640液洗柱两次并收集细胞。按5×105细胞加入小鼠抗人CD4或CD8单克隆抗体1μl，置冰上反应40min。用1×Hanks液漂洗两次后用RPMI1640液重悬细胞，以1×108细胞加入补体(新鲜豚鼠血清)1ml，37°C，5%CO2孵箱中反应45min。用1×Hanks液充分漂洗后用RPMI1640液重悬，并以每孔1×105细胞培养于96孔平底培养板内，每孔加入ConA至终浓度25μg/ml，总体积200μl。置37°C，5%CO2孵箱中，6h后相应孔中加入雷公藤甲素至终浓度10-5M，再培养12h后收集细胞。用台盼蓝计数细胞存活率>90%，涂片，4%多聚甲醛固定30min。用于细胞亚型鉴定和细胞凋亡检测。
1.3 CD3、CD4、CD8免疫细胞(ICC)杂色 免疫组化染色方法参见试剂盒说明书进行。主要步骤为：PBS漂洗，加入一抗20μl/片，37°C，1h。PBS漂洗，加入二抗20μl/片，37°C，1h。PBS漂洗，加入三抗20μl/片，37°C，1h。PBS漂洗，AP-Ped显色30min。在高倍光镜下，随机选择视野，至少观察200个细胞以上，分别计数CD3+、CD4+、CD8+细胞百分率。#[&-h2], 百拇医药
1.4 TUNEL染色 参见试剂盒说明书略加修正进行，即PBS漂洗，0.1%Triton X-100 4°C通透2min。PBS漂洗，0.03%H2O2/0.01%NaN3封闭30min。PBS漂洗，加入由TdT、脱氧三磷酸核苷(dNTP)和荧光素标记dUTP组成的TUNEL反应混合液20μl/片，37°C反应1h。PBS漂洗，加入过氧化物酶(POD)标记的抗荧光素抗体20μl/片，37°C反应30min。PBS漂洗，0.05%DAB/0.01% H2O2显色，光镜下控制显色深浅。苏木素复染。在高倍光镜下随机选择视野，至少观察200个细胞以上，计数CD4+、CD8+T淋巴细胞凋亡率。#[&-h2], 百拇医药
凋亡率(%)＝凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%#[&-h2], 百拇医药
2 结果#[&-h2], 百拇医药
2.1 CD3+、CD4+、CD8+细胞纯度鉴定结果 按本文方法分离的细胞，S-AP法染色可见阳性细胞胞膜被染成红色，而阴性对照无着色。CD3+、CD4+、CD8+细胞纯度均>95%。#[&-h2], 百拇医药
2.2 雷公藤甲素诱导正常人外周血CD4+、CD8+T细胞凋亡的作用 对照组CD4+和CD8+T细胞的凋亡率(分别为12.2±3.7和13.4±4.3)无显著差异(P>0.05)。雷公藤甲素组CD4+和CD8+T细胞的凋亡率(分别为36.7±4.6和37.2±3.1)也无显著差别(P>0.05)。而雷公藤甲素组CD4+、CD8+T细胞凋亡率显著高于对照组的CD4+、CD8+T细胞凋亡率(P<0.01)。结果见图1。
图1 CD4+、CD8+T细胞凋亡变化(%)@2, 百拇医药
Fig1 The changes of apoptosis of CD4+、CD8+T cells(%)by comparing with normal control，P<0.01@2, 百拇医药
3 讨论@2, 百拇医药
CD4+T细胞在许多免疫性疾病的发病中起重要作用[1～3]。CD4+T细胞通过产生细胞因子等，诱导T细胞转变为效应细胞，促进B细胞产生抗体和活化巨噬细胞，具有辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。文献报道，雷公藤能抑制植物血凝素(PHA)诱导的淋巴细胞增殖、活化[6]以及IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-8、TNF等多种细胞因子的产生[7，8]。本文实验结果表明，雷公藤甲素能诱导ConA刺激活化的CD4+T细胞凋亡。因此，我们推测雷公藤可能诱导CD4+T细胞凋亡减少其细胞数量，进而减少其细胞因子的表达和分泌，是其免疫调制作用的重要机制。@2, 百拇医药
CD8+T细胞具有抑制体液免疫以及抗病毒、抗肿瘤等免疫功能。本文研究证明，雷公藤甲素也能诱导ConA刺激活化的CD8+T细胞凋亡，与其诱导CD4+T细胞凋亡的作用无显著差别，表明雷公藤甲素诱导T细胞凋亡的作用是非特异性的，既能诱导CD4+T细胞凋亡，也能诱导CD8+T细胞凋亡。所以，在临床应用时应注意雷公藤这种非特异性免疫抑制作用可能带来的副作用。@2, 百拇医药
糖皮质激素是治疗免疫反应性疾病的有效药物，但长期应用可产生一系列的全身性副作用。有研究证实[9]，雷公藤与强的松的药理作用具有互补性，但雷公藤无抑制下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的作用。因此，糖皮质激素和雷公藤交替使用或者两药减量合用，可能对防止长期应用这两种药产生的副作用有重要意义。■@2, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870946)@2, 百拇医药
作者简介：林科雄(1969-)，男，贵州织金人，主治医师，硕士，主要从事哮喘炎症机制的研究。
参考文献：-\6w, 百拇医药
[1]CORRIGAN CJ，KAY AB.CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Relation to disease severity and atopic status[J].Am Rev Respir Dis，1990，141(3)：970～977.-\6w, 百拇医药
[2]王国秦，吴东海.雷公藤对类风湿性关节炎患者淋巴细胞亚群的影响[J].中华内科杂志，1994，33(1)：41～43.-\6w, 百拇医药
[3]梁大才，杨锡强.李成荣，等.儿童肾病综合征外周血T淋巴细胞亚群的检测[J].上海免疫学杂志，1989，9(2)：107～109.-\6w, 百拇医药
[4]LIN CY，YANG YM，FU YE.T cell subset in glo-merulonephritis[J].Int J Pediatr Nephro，1986；7(2)：63～66.-\6w, 百拇医药
[5]XU H，HEEGER PS，FAIRCHILD RL.Distinct role for B7-1 determinants during priming of effector CD8+ Tcl and regulatory CD4+ Th2 cell for contact hypersensitivity[J].J Immunol，1997，159(29)：4217～4226.-\6w, 百拇医药
[6]吴国福，朱立平.崔莲仙，等.雷公藤总甙(TⅡ)对IL-2和IL-2R基因转录的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，1993，13(3)：193～197.-\6w, 百拇医药
[7]金远林，王长征，王春霞，等.哮喘豚鼠细胞因子表达及雷公藤的影响[J].第三军医大学学报，1998，20(3)：202～204.-\6w, 百拇医药
[8]王长征，王春霞，金远林，等.哮喘豚鼠IL-5、IL-3、GM-CSFmRNA表达及雷公藤内酯醇的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(2)：145～148.-\6w, 百拇医药
[9]胡大伟，刘沛霖.雷公藤与强的松药理作用的互补性[J].中国中西医结合杂志，1997，17(2)：94～96.-\6w, 百拇医药
收稿日期：1999-06-17-\6w, 百拇医药
修回日期：1999-09-11(林科雄 王长征 钱桂生)