一种快速分离细胞凋亡片段化DNA的简单方法——NP-40法
作者：熊世勤 朱锡华 黄云辉+, http://www.100md.com
单位：熊世勤(第三军医大学免疫学教研室，全军免疫学研究所，重庆 400038)；朱锡华(第三军医大学免疫学教研室，全军免疫学研究所，重庆 400038)；黄云辉(第三军医大学免疫学教研室，全军免疫学研究所，重庆 400038)+, http://www.100md.com
关键词：细胞凋亡；DNA片段化；NP-40法+, http://www.100md.com
免疫学杂志000320 [摘 要]目的 鉴定细胞凋亡的一个重要生化指标是凋亡细胞的核DNA通过琼脂糖凝胶电泳呈现典现的DNA“梯状”图谱。传统分离凋亡细胞片段化DNA的方法多采用酚/氯仿抽提。因此，有必要探寻一种更为灵敏、简单的分离凋亡片段化DNA的新方法。方法 通过比较传统分离凋亡片段化DNA的方法，并对HERRMANN等[1]报道的方法加以改进。结果 本文介绍一种快速分离凋亡DNA片段化的新方法(NP-40法)。结论 这种简单、快速的分离方法无需酚/氯仿反复抽提，无需大量的细胞样品，并且凋亡DNA片段化梯状图谱清晰,适用于大多数凋亡细胞片段化DNA的分离。+, http://www.100md.com
[中图分类号]R371-33；Q781 [文献标识码]A+, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0228-04+, http://www.100md.com
A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments+, http://www.100md.com
XIONG Shi-qin，ZHU Xi-hua，HUANG Yun-hui+, http://www.100md.com
(Department of Immunology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)+, http://www.100md.com
[Abstract]Objective An important biochemical index of determination of apoptosis is the hallmark of apoptotic DNA ladder by sepharose gel electrophoresis.The phenol/chloroform extraction procedure was mostly used in the conventional methods of isolation apoptotic DNA fragments.So，it is absolutely necessary that we should explore a more sensitive and more sophisticated method of isolation the apoptotic DNA fragments.Methods We made a comparision among the conventional methods for isolation of apoptotic DNA fragements，and improved the method reported by HERRMANN[1].Results A rapid and simple method of isolation the apoptotic DNA fragments was introduced in this paper.Conclusion The new method works without time consuming organic extractions and a great number of cell samples.Smear of genomic DNA，which blurs the conventional apoptotic ladder is strongly reduced.The reproducible technique is suitable for the isolation of apoptotic DNA fragments in most apoptotic cell types.
[Key words]apoptosis；DNA fragmentation；nonidet P40 method4h}{&q, 百拇医药
细胞凋亡(亦称程序化细胞死亡，PCD)是复细胞生物的一种普遍生理现象。它不仅参与机体的生长、发育、分化，而且与人体多种疾病如肝炎、肿瘤 、AIDS、自身免疫性疾病、卒中、阿尔茨海默氏(Alzheimers)病等密切相关。人们研究细胞凋亡的方法常包括凋亡形态学观察法、生物化学特征法、流式细胞仪法以及分子生物学方法(TUNEL法)等。由于细胞凋亡时，核小体断裂形成的多个180～200bp的寡核苷酸碎片经含溴化乙碇的琼脂糖凝胶电泳呈典型的“梯状”条带，因此鉴定细胞凋亡的一个重要生化指标是观察其核DNA经琼脂糖凝胶电泳是否呈现典型的DNA“梯状”图谱。传统分离凋亡DNA片段的方法多采用酚/氯仿反复抽提，其电泳结果常呈现模糊片状的条带背景，从而易将凋亡与坏死相混淆。另外传统方法耗时较长，有机试剂抽提步骤繁琐，所需细胞样品数目较多(大于106个/ml)，得率也较低。我们对HERMANN等报道的方法加以改进，通过与文献[2]和文献[3]报道的方法加以比较，提出一种新的分离凋亡DNA片段的简单方法，现将结果报告如下。4h}{&q, 百拇医药
1 材料与方法4h}{&q, 百拇医药
1.1 材料4h}{&q, 百拇医药
1.1.1 细胞培养：Jurkat、CTLL-2细胞按本室常规培养，采用抗体结合补体方法分离[4～6]小鼠CD4+T细胞。上述3种细胞均在含10%小牛血清的RPMI1640培养液37°C、5%CO2条件下培养，倒置显微镜计数。4h}{&q, 百拇医药
1.1.2 主要试剂：SEB(金黄色葡萄球菌肠毒素B，Sigma)，rIL-2(本室提供)，anti-Apo-1抗体由德国Krammer教授惠赠，NP-40(Fluka)，RNase A及蛋白酶K购于Promega公司。兔抗鼠CD4：RPE购自Serotec公司。纯化抗鼠CD8购自Pharmingen公司(深圳晶美公司代理)。碘化丙啶(Propidium iodide，PI，Sigma)。其它常规试剂均为分析纯。4h}{&q, 百拇医药
1.2 主要方法4h}{&q, 百拇医药
1.2.1 细胞凋亡的诱导：①参照文献[7]建立SEB诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡模型。②参照文献[8]建立anti-Apo-1诱导Jurkat细胞的凋亡模型。③剥离CTLL-2细胞培养液中的IL-2，建立CTLL-2细胞的凋亡模型。
1.2.2 细胞凋亡的定量分析：采用PI染色法进行细胞凋亡的流式细胞仪定量分析[9]。.x?@^, http://www.100md.com
1.2.3 采用NP-40法分离凋亡细胞的片段化DNA：①采用pH7.2，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液清洗2遍，离心收集细胞(大于105个/ml)。②采用150ul溶破缓冲液(1% NP-40 in 20mmol EDTA，蛋白酶K 2μg/μl，50mmol Tris-HCl，pH7.5)溶破沉淀细胞5h，至混合物变得清亮。③8 000r/min离心15min收集上清，用等量的溶破缓冲液重复抽提一次。④上清置于等量的1%SDS溶液，混匀。用终浓度为2μg/μl的RNase A，56°C处理2h。⑤用终浓度为2μg/μl的蛋白酶K 37°C水浴消化3～5h。⑥添加1/2体积的10mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，摇匀后-20°C过夜或置于液氮2h。⑦15 000r/min离心30min、沉淀DNA，用75%的冰冷乙醇漂洗去除残余的盐。⑧采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳2～3h，拍照、记录结果。.x?@^, http://www.100md.com
1.2.4 凋亡细胞片段化DNA的分离：采用文献[2]介绍的方法分离凋亡细胞的DNA片段.x?@^, http://www.100md.com
1.2.5 凋亡细胞片段化DNA的分离：采用文献[3]介绍的方法分离凋亡细胞的DNA片段.x?@^, http://www.100md.com
2 结果.x?@^, http://www.100md.com
2.1 NP-40法与2种传统方法分离凋亡细胞DNA的比较 采用超抗原SEB(2μg/ml)再次刺激静息的CD4+ T细胞(106/ml)4，8，16和24h后，收获细胞。按照文献[2]和文献[3]的方法分离CD4+ T细胞凋亡DNA片段，经1.8%琼脂糖凝胶电泳，结果分别如图1A 和图1B所示。按文献[2]推荐的方法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳未能呈现明显的DNA梯状图谱，更接近细胞坏死时所呈现的模糊片状样图谱(见图1A)。按文献[3]推荐的方法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳未能呈现典型的DNA梯状图谱。然而采用NP-40法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳结果呈现典型的凋亡DNA梯状图谱(见图1C)。提示；采用NP-40法比较传统方法分离细胞凋亡DNA片段的产量得到较大提高，凋亡细胞基因组DNA片状样对典型的凋亡DNA梯状样的影响大大减少。
图1 3种方法制备SEB诱导CD4+T细胞凋亡片段化DNA的比较+85w{pw, 百拇医药
Fig1 Comparison of three methods for the preparation+85w{pw, 百拇医药
of CD4+ T cell apoptotic DNA fragments by SEB+85w{pw, 百拇医药
A：M：DNA Marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)； 1：4h； 2：8h； 3：16h； 4：24h+85w{pw, 百拇医药
B：M：DNA Marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)； 1：4h； 2：8h； 3：16h； 4：24h+85w{pw, 百拇医药
C：M：DNA Marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)； 1：8h； 2：4h； 3：16h； 4：24h+85w{pw, 百拇医药
2.2 NP-0法具有较高的分离效率 采用NP-40法分离调亡细胞片段化DNA大大减少了按传统方法分离凋亡细胞DNA在琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞大片段DNA和坏死细胞DNA对凋亡细胞片段化DNA电泳“梯状”图谱的影响。因为采用NP-40法分离的凋亡片段化DNA能够大部分从上清中得到回收，然而完整染色体留在沉淀物中。很可能采用NP-40溶破缓冲液能够溶解凋亡细胞核，然而活细胞的细胞核保持完整，因而在低速离心过程中，沉积在沉淀中。实验结果表明：对沉淀物和上清液进行处理后各自电泳，沉淀物不含有凋亡片段化DNA，而上清液中出现大量的凋亡片段化DNA(见图2)。
+85w{pw, 百拇医药
图2 NP-40法制备SEB诱导CD4+T细胞凋亡上清和沉淀物所含凋亡片段化DNA的比较+85w{pw, 百拇医药
Fig2 Comparison of apoptotic DNA fragments in supernatant and+85w{pw, 百拇医药
pellet of NP-40 lysates for CD4+ T cell apoptosis induced by SEB
M：DNA marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)1rs$\(, http://www.100md.com
1，3：supernatant；2，4：pellet；1，2：16h；3，4：8h1rs$\(, http://www.100md.com
2.3 NP-40法的细胞样品需要量 NP-40法分离凋亡片段化DNA比较传统方法所需细胞数目较少。在1×107～5×104个细胞绝对数目范围内(至少有104个/ml凋亡细胞)，按照NP-40法分离的凋亡片段化DNA通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳，都能呈现典型的凋亡DNA“梯状”图谱(见图3)。
1rs$\(, http://www.100md.com
图3 NP-40法制备不同细胞总数的CD4+T细胞凋亡片段化DNA，按PI染色法知其凋亡率49%1rs$\(, http://www.100md.com
Fig3 The percentage of apoptotic cell was 49%1rs$\(, http://www.100md.com
according to propidium iodide staining method1rs$\(, http://www.100md.com
total cell count：1.1×107；2.5×106； 3.5×105； 4.1×105； 5.1×1041rs$\(, http://www.100md.com
2.4 NP-40法的应用 采用NP-40法不仅对分离杂交瘤细胞凋亡片段化DNA有效，而且也适宜分离非转化细胞凋亡片段化DNA。例如，抗Apo-1抗体诱导Jurkat细胞凋亡，剥离IL-2诱导CTLL-2细胞凋亡及超抗原SEB诱导CD4 T淋巴细胞的凋亡(见图4)。
1rs$\(, http://www.100md.com
图4 NP-40法制备CD4+T细胞，CTLL-2细胞，Jurkat细胞凋亡片段化DNA1rs$\(, http://www.100md.com
Fig 4Preparation of apoptotic DNA fragments by NP-40
lysis for CD4+ T cells，CTLL-2 cells and Jurkat cellsm*@p1cd, http://www.100md.com
M：DNA marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)m*@p1cd, http://www.100md.com
1：normal CD4+ T cells； 2：apoptotic CD4+ T cells by SEBm*@p1cd, http://www.100md.com
3：apoptotic CTLL-2 cells by IL-2 deprivation for 12hm*@p1cd, http://www.100md.com
4：apoptotic Jurkat cells by anti-Apo-1m*@p1cd, http://www.100md.com
3 讨论m*@p1cd, http://www.100md.com
Nonidet P40(NP-40)称为乙基苯基聚乙二醇或乙基酚聚乙二醇醚，它是一种非离子型去污剂。采用NP-40配制的溶解缓冲液能够快速、有效地溶破细胞，经低速离心可使凋亡细胞片段化DNA从胞核释放于溶解缓冲液上清，而活细胞细胞核保持完整，因而沉积在离心后的沉淀物中。采用NP-40法的离心步骤其离心速度对分离效果的影响最为关键。因为过低的离心力可能导致大片段DNA甚至活细胞完整的染色体不能沉积在管底，电泳结果可能出现模糊的片状图谱；相反，较高的离心力会导致凋亡片段化DNA随同大片段DNA或完整的染色体一起沉入管底，从而影响凋亡片段化DNA的分离效率。经过反复实验，我们通常采用7 000～8 000r/min分离经NP-40溶解缓冲液处理过的凋亡细胞片段化DNA，效果较好。m*@p1cd, http://www.100md.com
比较传统方法，采用NP-40法分离细胞凋亡片段化DNA具有以下优点。首先，它省去了传统方法所需酚/氯仿反复抽提等繁琐步骤，省时省力、价格也较低廉。其次，该方法在离心后可在单一离心管内操作，不仅方便快捷，而且减少了因多次换管操作导致的凋亡片段化DNA的得率，因而较传统方法更适宜检测凋亡率较低的细胞样品。最后，采用NP-40法分离凋亡细胞片段化DNA，比较传统方法，其电泳结果凋亡DNA“梯状”图谱清晰可辩，易于分辩凋亡与坏死，而且适宜分离不同刺激信号引起多种类型细胞凋亡的片段化DNA。m*@p1cd, http://www.100md.com
[作者简介]熊世勤(1971-)，男，重庆市人，博士生，主要从事分子免疫学研究。
[参考文献]:]y/|6a, http://www.100md.com
[1]HERRMANN M，LORENZ HM，VOLL K，et al.A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments[J].Nucleic Acids Res，1994，22(24)：5506～5507.:]y/|6a, http://www.100md.com
[2]姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，1996.176～177.:]y/|6a, http://www.100md.com
[3]巴德年.当代免疫学技术与应用[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.571～572.:]y/|6a, http://www.100md.com
[4]SIMON TM， LORBER A，HOLMES HT.A rapid method for preparing Ficoll-Hypaque step gradients and gradient overlays[J].J Immunol Methods，1976，12：193～195.:]y/|6a, http://www.100md.com
[5]PAPAMICHAIL M，GUTIERREZ C，HOLBOROW EJ.The use of nylon fibre as a method of separation human lymphocyte subpopulations[J].J Immunol Methods，1976，11：225～229.:]y/|6a, http://www.100md.com
[6]MORIMOTO C，REINHERZ EL，BOREL Y，et al.Direct demonstration of the human suppressor induced subset by anti- T cell antibodies[J].J Immunol，1983，130：157～161.:]y/|6a, http://www.100md.com
[7]ETTINGER R，PANKA D，WANG JKM，et al.Fas ligand mediated cytotoxicity is directly responsible for apoptosis of normal CD4+ T cells responding to a bacterial superantigen[J].J Immunol，1995，154：4302～4308.:]y/|6a, http://www.100md.com
[8]DHEIN J，WALCZAK H，BAUMLER C，et al.Au-tocrine T-cell suicide mediated by Apo-1/(Fas/CD95)[J].Nature，1995，373：438～441.:]y/|6a, http://www.100md.com
[9]NICOLETTI I，MIGLIORATI G，PAGLIACCI MC，et al.A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry[J].J Immunol Methods，1991，139：271～279.:]y/|6a, http://www.100md.com
[收稿日期]1999-10-18； [修回日期]1999-12-28(熊世勤 朱锡华 黄云辉)
单位：熊世勤(第三军医大学免疫学教研室，全军免疫学研究所，重庆 400038)；朱锡华(第三军医大学免疫学教研室，全军免疫学研究所，重庆 400038)；黄云辉(第三军医大学免疫学教研室，全军免疫学研究所，重庆 400038)+, http://www.100md.com
关键词：细胞凋亡；DNA片段化；NP-40法+, http://www.100md.com
免疫学杂志000320 [摘 要]目的 鉴定细胞凋亡的一个重要生化指标是凋亡细胞的核DNA通过琼脂糖凝胶电泳呈现典现的DNA“梯状”图谱。传统分离凋亡细胞片段化DNA的方法多采用酚/氯仿抽提。因此，有必要探寻一种更为灵敏、简单的分离凋亡片段化DNA的新方法。方法 通过比较传统分离凋亡片段化DNA的方法，并对HERRMANN等[1]报道的方法加以改进。结果 本文介绍一种快速分离凋亡DNA片段化的新方法(NP-40法)。结论 这种简单、快速的分离方法无需酚/氯仿反复抽提，无需大量的细胞样品，并且凋亡DNA片段化梯状图谱清晰,适用于大多数凋亡细胞片段化DNA的分离。+, http://www.100md.com
[中图分类号]R371-33；Q781 [文献标识码]A+, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0228-04+, http://www.100md.com
A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments+, http://www.100md.com
XIONG Shi-qin，ZHU Xi-hua，HUANG Yun-hui+, http://www.100md.com
(Department of Immunology，the Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)+, http://www.100md.com
[Abstract]Objective An important biochemical index of determination of apoptosis is the hallmark of apoptotic DNA ladder by sepharose gel electrophoresis.The phenol/chloroform extraction procedure was mostly used in the conventional methods of isolation apoptotic DNA fragments.So，it is absolutely necessary that we should explore a more sensitive and more sophisticated method of isolation the apoptotic DNA fragments.Methods We made a comparision among the conventional methods for isolation of apoptotic DNA fragements，and improved the method reported by HERRMANN[1].Results A rapid and simple method of isolation the apoptotic DNA fragments was introduced in this paper.Conclusion The new method works without time consuming organic extractions and a great number of cell samples.Smear of genomic DNA，which blurs the conventional apoptotic ladder is strongly reduced.The reproducible technique is suitable for the isolation of apoptotic DNA fragments in most apoptotic cell types.
[Key words]apoptosis；DNA fragmentation；nonidet P40 method4h}{&q, 百拇医药
细胞凋亡(亦称程序化细胞死亡，PCD)是复细胞生物的一种普遍生理现象。它不仅参与机体的生长、发育、分化，而且与人体多种疾病如肝炎、肿瘤 、AIDS、自身免疫性疾病、卒中、阿尔茨海默氏(Alzheimers)病等密切相关。人们研究细胞凋亡的方法常包括凋亡形态学观察法、生物化学特征法、流式细胞仪法以及分子生物学方法(TUNEL法)等。由于细胞凋亡时，核小体断裂形成的多个180～200bp的寡核苷酸碎片经含溴化乙碇的琼脂糖凝胶电泳呈典型的“梯状”条带，因此鉴定细胞凋亡的一个重要生化指标是观察其核DNA经琼脂糖凝胶电泳是否呈现典型的DNA“梯状”图谱。传统分离凋亡DNA片段的方法多采用酚/氯仿反复抽提，其电泳结果常呈现模糊片状的条带背景，从而易将凋亡与坏死相混淆。另外传统方法耗时较长，有机试剂抽提步骤繁琐，所需细胞样品数目较多(大于106个/ml)，得率也较低。我们对HERMANN等报道的方法加以改进，通过与文献[2]和文献[3]报道的方法加以比较，提出一种新的分离凋亡DNA片段的简单方法，现将结果报告如下。4h}{&q, 百拇医药
1 材料与方法4h}{&q, 百拇医药
1.1 材料4h}{&q, 百拇医药
1.1.1 细胞培养：Jurkat、CTLL-2细胞按本室常规培养，采用抗体结合补体方法分离[4～6]小鼠CD4+T细胞。上述3种细胞均在含10%小牛血清的RPMI1640培养液37°C、5%CO2条件下培养，倒置显微镜计数。4h}{&q, 百拇医药
1.1.2 主要试剂：SEB(金黄色葡萄球菌肠毒素B，Sigma)，rIL-2(本室提供)，anti-Apo-1抗体由德国Krammer教授惠赠，NP-40(Fluka)，RNase A及蛋白酶K购于Promega公司。兔抗鼠CD4：RPE购自Serotec公司。纯化抗鼠CD8购自Pharmingen公司(深圳晶美公司代理)。碘化丙啶(Propidium iodide，PI，Sigma)。其它常规试剂均为分析纯。4h}{&q, 百拇医药
1.2 主要方法4h}{&q, 百拇医药
1.2.1 细胞凋亡的诱导：①参照文献[7]建立SEB诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡模型。②参照文献[8]建立anti-Apo-1诱导Jurkat细胞的凋亡模型。③剥离CTLL-2细胞培养液中的IL-2，建立CTLL-2细胞的凋亡模型。
1.2.2 细胞凋亡的定量分析：采用PI染色法进行细胞凋亡的流式细胞仪定量分析[9]。.x?@^, http://www.100md.com
1.2.3 采用NP-40法分离凋亡细胞的片段化DNA：①采用pH7.2，0.1mol/L的磷酸盐缓冲液清洗2遍，离心收集细胞(大于105个/ml)。②采用150ul溶破缓冲液(1% NP-40 in 20mmol EDTA，蛋白酶K 2μg/μl，50mmol Tris-HCl，pH7.5)溶破沉淀细胞5h，至混合物变得清亮。③8 000r/min离心15min收集上清，用等量的溶破缓冲液重复抽提一次。④上清置于等量的1%SDS溶液，混匀。用终浓度为2μg/μl的RNase A，56°C处理2h。⑤用终浓度为2μg/μl的蛋白酶K 37°C水浴消化3～5h。⑥添加1/2体积的10mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，摇匀后-20°C过夜或置于液氮2h。⑦15 000r/min离心30min、沉淀DNA，用75%的冰冷乙醇漂洗去除残余的盐。⑧采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳2～3h，拍照、记录结果。.x?@^, http://www.100md.com
1.2.4 凋亡细胞片段化DNA的分离：采用文献[2]介绍的方法分离凋亡细胞的DNA片段.x?@^, http://www.100md.com
1.2.5 凋亡细胞片段化DNA的分离：采用文献[3]介绍的方法分离凋亡细胞的DNA片段.x?@^, http://www.100md.com
2 结果.x?@^, http://www.100md.com
2.1 NP-40法与2种传统方法分离凋亡细胞DNA的比较 采用超抗原SEB(2μg/ml)再次刺激静息的CD4+ T细胞(106/ml)4，8，16和24h后，收获细胞。按照文献[2]和文献[3]的方法分离CD4+ T细胞凋亡DNA片段，经1.8%琼脂糖凝胶电泳，结果分别如图1A 和图1B所示。按文献[2]推荐的方法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳未能呈现明显的DNA梯状图谱，更接近细胞坏死时所呈现的模糊片状样图谱(见图1A)。按文献[3]推荐的方法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳未能呈现典型的DNA梯状图谱。然而采用NP-40法分离的凋亡DNA片段经琼脂糖凝胶电泳结果呈现典型的凋亡DNA梯状图谱(见图1C)。提示；采用NP-40法比较传统方法分离细胞凋亡DNA片段的产量得到较大提高，凋亡细胞基因组DNA片状样对典型的凋亡DNA梯状样的影响大大减少。
图1 3种方法制备SEB诱导CD4+T细胞凋亡片段化DNA的比较+85w{pw, 百拇医药
Fig1 Comparison of three methods for the preparation+85w{pw, 百拇医药
of CD4+ T cell apoptotic DNA fragments by SEB+85w{pw, 百拇医药
A：M：DNA Marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)； 1：4h； 2：8h； 3：16h； 4：24h+85w{pw, 百拇医药
B：M：DNA Marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)； 1：4h； 2：8h； 3：16h； 4：24h+85w{pw, 百拇医药
C：M：DNA Marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)； 1：8h； 2：4h； 3：16h； 4：24h+85w{pw, 百拇医药
2.2 NP-0法具有较高的分离效率 采用NP-40法分离调亡细胞片段化DNA大大减少了按传统方法分离凋亡细胞DNA在琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞大片段DNA和坏死细胞DNA对凋亡细胞片段化DNA电泳“梯状”图谱的影响。因为采用NP-40法分离的凋亡片段化DNA能够大部分从上清中得到回收，然而完整染色体留在沉淀物中。很可能采用NP-40溶破缓冲液能够溶解凋亡细胞核，然而活细胞的细胞核保持完整，因而在低速离心过程中，沉积在沉淀中。实验结果表明：对沉淀物和上清液进行处理后各自电泳，沉淀物不含有凋亡片段化DNA，而上清液中出现大量的凋亡片段化DNA(见图2)。
+85w{pw, 百拇医药图2 NP-40法制备SEB诱导CD4+T细胞凋亡上清和沉淀物所含凋亡片段化DNA的比较+85w{pw, 百拇医药
Fig2 Comparison of apoptotic DNA fragments in supernatant and+85w{pw, 百拇医药
pellet of NP-40 lysates for CD4+ T cell apoptosis induced by SEB
M：DNA marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)1rs$\(, http://www.100md.com
1，3：supernatant；2，4：pellet；1，2：16h；3，4：8h1rs$\(, http://www.100md.com
2.3 NP-40法的细胞样品需要量 NP-40法分离凋亡片段化DNA比较传统方法所需细胞数目较少。在1×107～5×104个细胞绝对数目范围内(至少有104个/ml凋亡细胞)，按照NP-40法分离的凋亡片段化DNA通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳，都能呈现典型的凋亡DNA“梯状”图谱(见图3)。
1rs$\(, http://www.100md.com图3 NP-40法制备不同细胞总数的CD4+T细胞凋亡片段化DNA，按PI染色法知其凋亡率49%1rs$\(, http://www.100md.com
Fig3 The percentage of apoptotic cell was 49%1rs$\(, http://www.100md.com
according to propidium iodide staining method1rs$\(, http://www.100md.com
total cell count：1.1×107；2.5×106； 3.5×105； 4.1×105； 5.1×1041rs$\(, http://www.100md.com
2.4 NP-40法的应用 采用NP-40法不仅对分离杂交瘤细胞凋亡片段化DNA有效，而且也适宜分离非转化细胞凋亡片段化DNA。例如，抗Apo-1抗体诱导Jurkat细胞凋亡，剥离IL-2诱导CTLL-2细胞凋亡及超抗原SEB诱导CD4 T淋巴细胞的凋亡(见图4)。
1rs$\(, http://www.100md.com图4 NP-40法制备CD4+T细胞，CTLL-2细胞，Jurkat细胞凋亡片段化DNA1rs$\(, http://www.100md.com
Fig 4Preparation of apoptotic DNA fragments by NP-40
lysis for CD4+ T cells，CTLL-2 cells and Jurkat cellsm*@p1cd, http://www.100md.com
M：DNA marker(λ DNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ)m*@p1cd, http://www.100md.com
1：normal CD4+ T cells； 2：apoptotic CD4+ T cells by SEBm*@p1cd, http://www.100md.com
3：apoptotic CTLL-2 cells by IL-2 deprivation for 12hm*@p1cd, http://www.100md.com
4：apoptotic Jurkat cells by anti-Apo-1m*@p1cd, http://www.100md.com
3 讨论m*@p1cd, http://www.100md.com
Nonidet P40(NP-40)称为乙基苯基聚乙二醇或乙基酚聚乙二醇醚，它是一种非离子型去污剂。采用NP-40配制的溶解缓冲液能够快速、有效地溶破细胞，经低速离心可使凋亡细胞片段化DNA从胞核释放于溶解缓冲液上清，而活细胞细胞核保持完整，因而沉积在离心后的沉淀物中。采用NP-40法的离心步骤其离心速度对分离效果的影响最为关键。因为过低的离心力可能导致大片段DNA甚至活细胞完整的染色体不能沉积在管底，电泳结果可能出现模糊的片状图谱；相反，较高的离心力会导致凋亡片段化DNA随同大片段DNA或完整的染色体一起沉入管底，从而影响凋亡片段化DNA的分离效率。经过反复实验，我们通常采用7 000～8 000r/min分离经NP-40溶解缓冲液处理过的凋亡细胞片段化DNA，效果较好。m*@p1cd, http://www.100md.com
比较传统方法，采用NP-40法分离细胞凋亡片段化DNA具有以下优点。首先，它省去了传统方法所需酚/氯仿反复抽提等繁琐步骤，省时省力、价格也较低廉。其次，该方法在离心后可在单一离心管内操作，不仅方便快捷，而且减少了因多次换管操作导致的凋亡片段化DNA的得率，因而较传统方法更适宜检测凋亡率较低的细胞样品。最后，采用NP-40法分离凋亡细胞片段化DNA，比较传统方法，其电泳结果凋亡DNA“梯状”图谱清晰可辩，易于分辩凋亡与坏死，而且适宜分离不同刺激信号引起多种类型细胞凋亡的片段化DNA。m*@p1cd, http://www.100md.com
[作者简介]熊世勤(1971-)，男，重庆市人，博士生，主要从事分子免疫学研究。
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[收稿日期]1999-10-18； [修回日期]1999-12-28(熊世勤 朱锡华 黄云辉)