影响抗A杂交瘤细胞抗体分泌的部分因素
作者：姚余有 张玲玲 王晓琴+, http://www.100md.com
单位：姚余有(安徽医科大学基础部东南医学科技发展有限公司，安徽 合肥 230032)；张玲玲(安徽医科大学基础部东南医学科技发展有限公司，安徽 合肥 230032)；王晓琴(安徽医科大学基础部东南医学科技发展有限公司，安徽 合肥 230032)+, http://www.100md.com
关键词：单克隆抗体；血型定型试剂；杂交瘤细胞+, http://www.100md.com
免疫学杂志000312 [摘 要]目的 研究影响抗A杂交瘤细胞抗体分泌的部分因素。方法 通过试管法和玻片法检测抗A抗体的效价和亲和力。结果 0.25mmol/L、0.5mmol/L丁酸钠和0.01U/ml胰岛素能明显提高抗A抗体的效价和亲和力；HAT重筛选可使部分小体积细胞迅速死亡，抗A抗体的效价和亲和力明显提高。结论 丁酸钠、胰岛素和HAT重筛选可提高抗A杂交瘤细胞抗体的分泌。+, http://www.100md.com
[中图分类号]R392-33 [文献标识码]A+, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0204-02+, http://www.100md.com
The study of fact that influence the anti-A antibody of hybridoma+, http://www.100md.com
YAO Yu-you，ZHANG Ling-ling，WANG Xiao-qing+, http://www.100md.com
(Southeastern Medical Science and Techology Development Co Ltd，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)+, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To study the fact that influenced the anti-A antibody of hybridoma.Methods The titer and affinity of anti-A secreted by hybridoma were tested by tube method and slide method.Results 0.25mmol/L and 0.5mmol/L sodium butyrate could significantly increase the titer and affinity of anti-A that could be promoted by 0.01 U/ml insulin too.Many smaller ones of the experimental cells died rapidly in the HAT medium，after which the titer and affinity of anti-A rose markedly.Conclusion The sodium butyrate and insulin can promote the titer and affinity of anti-A secreted by hybridoma，and the surviving clones in HAT medium could secreted more antibody of anti-A.
[Key words]monoclonal antibody；blood grouping reagents；hybridoma4h}{&q, 百拇医药
血型定型单克隆抗体试剂已广泛用于临床医学、法医学、考古学等工作中，与某些发达国家相比我国血型定型试剂在效价和亲和力方面仍存在一定差距，有些企业因产品效价和亲和力达不到国家标准而致产量大幅度下降，故研究出提高抗体效价和亲和力的方法将有着深远的意义。4h}{&q, 百拇医药
1 材料与方法4h}{&q, 百拇医药
1.1 细胞系抗A-6-1-G11 由本校分子生物学研究室提供。4h}{&q, 百拇医药
1.2 试剂 牛胰岛素(40U/ml)，上海生物化学试剂厂生产；RPMI1640，美国GIBCO产品；氨甲喋呤(AR级)，Fluka公司产品；丁酸钠(AR级)、次黄嘌呤(AR级)、胸腺嘧啶核苷(AR级)均为Sigma公司产品；小牛血清，合肥奶牛厂产品。4h}{&q, 百拇医药
1.3 仪器 CO2培养箱，美国IEVCO产品；倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品。4h}{&q, 百拇医药
1.4 抗A杂交瘤细胞的培养 将冻存于液氮中的抗A杂交瘤细胞复苏后，移入盛有10%小牛血清1640培养液中，置37°C，5%CO2培养箱中培养，待细胞长满底壁后传代，第3代细胞生长速度明显加快，此细胞即可作为实验细胞。4h}{&q, 百拇医药
1.5 丁酸钠对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 将实验细胞从培养瓶底壁吹下，洗涤2次后，用10%小牛血清1640培养液配成浓度为1×105/ml个细胞的细胞悬液，移入24孔培养板，每孔1ml，然后加入含不同浓度丁酸钠的1640培养液1ml，观察不同浓度丁酸钠对抗体分泌的影响。4h}{&q, 百拇医药
1.6 胰岛素对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 细胞培养及实验细胞分组同前，最后向24孔培养板中加入不同浓度胰岛素，观察胰岛素对抗体分泌的影响。4h}{&q, 百拇医药
1.7 HAT筛选对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 培养基的配制见文献[1]，用此培养基配制浓度为1×105/ml个细胞的细胞悬液，移入24孔培养板每孔2ml，置37°C，5%CO2培养箱中培养，待培养一定时间后逐渐更换成普通培养基，另设无HAT对照，观察HAT筛选组与无HAT组之间的差别。
1.8 抗A抗体效价和亲和力测定 见中国生物制品规程二部[2].x?@^, http://www.100md.com
1.9 数据处理 采用student’t检验.x?@^, http://www.100md.com
2 结果.x?@^, http://www.100md.com
2.1 丁酸钠对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 按表1分组，结果显示0.25mmol/L和0.5mmol/L的丁酸钠组抗体效价和亲和力明显提高，但当丁酸钠浓度为1mmol/L时，杂交瘤细胞生长受到抑制，抗体效价随之明显降低。.x?@^, http://www.100md.com
表1 丁酸钠对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响.x?@^, http://www.100md.com
Tab1 The effect of sodium butyrate on anti-A antibody secreted by hybridoma Sodium butyrate(mmol/L).x?@^, http://www.100md.com
Titer.x?@^, http://www.100md.com
Affinity(s).x?@^, http://www.100md.com
0.x?@^, http://www.100md.com
1∶256.x?@^, http://www.100md.com
6.21±0.13.x?@^, http://www.100md.com
0.125.x?@^, http://www.100md.com
1∶256.x?@^, http://www.100md.com
6.20±0.13.x?@^, http://www.100md.com
0.25.x?@^, http://www.100md.com
1∶512.x?@^, http://www.100md.com
5.24±0.11**.x?@^, http://www.100md.com
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1∶512.x?@^, http://www.100md.com
4.52±0.13**.x?@^, http://www.100md.com
1.0.x?@^, http://www.100md.com
1∶128
7.00±0.11+85w}pw, 百拇医药
1×105 cells per well was incubated with various concentrations of sodium butyrate at 37°C，5%CO2.The titer and affinity was tested when the cell grew fully on the bottom of bottle，n＝10，
±s；**P<0.01，compared with control(sodium butyrate＝0).+85w}pw, 百拇医药
2.2 胰岛素对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 往抗A杂交瘤细胞中加入不同浓度胰岛素，表2结果显示仅0.01U/ml胰岛素可使细胞增殖速度明显加快，抗体效价和亲和力明显升高。+85w}pw, 百拇医药
表2 胰岛素对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响+85w}pw, 百拇医药
Tab2 The effect of insulin on anti-A antibody secreted by hybridoma Insulin(U/ml)+85w}pw, 百拇医药
Titer+85w}pw, 百拇医药
Affinity(s)+85w}pw, 百拇医药
0+85w}pw, 百拇医药
1∶256+85w}pw, 百拇医药
6.21±0.13+85w}pw, 百拇医药
0.001+85w}pw, 百拇医药
1∶256+85w}pw, 百拇医药
6.20±0.13+85w}pw, 百拇医药
0.01+85w}pw, 百拇医药
1∶512+85w}pw, 百拇医药
5.32±0.11**+85w}pw, 百拇医药
0.1+85w}pw, 百拇医药
1∶2561rs$\(, http://www.100md.com
6.22±0.121rs$\(, http://www.100md.com
1.01rs$\(, http://www.100md.com
1∶2561rs$\(, http://www.100md.com
6.90±0.121rs$\(, http://www.100md.com
1×105 cells per well was incubated with various concentrations of insulin at 37°C，5%CO2.The titer and affinity was tested when the cell grew fully on the bottom of bottle，n＝10，±s；**P<0.01，compared with control(insulin＝0).1rs$\(, http://www.100md.com
2.3 HAT筛选对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 按表3将实验分成HAT筛选组和无HAT对照组，结果显示，最初几天筛选组小体积细胞迅速死亡，未死亡细胞缓慢增殖，待细胞长满底壁后传代，将传代后细胞逐渐更换为普通培养基，继续培养并与无HAT组进行比较，表3结果显示筛选组抗体效价明显提高，是未筛选组的2倍，亲和力也相应提高。1rs$\(, http://www.100md.com
表 3 HAT筛选对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响1rs$\(, http://www.100md.com
Tab3 The effect of screening with HAT medium on anti-A antibody secreted by hybridoma Group1rs$\(, http://www.100md.com
Titer1rs$\(, http://www.100md.com
Affinity(s)1rs$\(, http://www.100md.com
non-HAT1rs$\(, http://www.100md.com
1∶2561rs$\(, http://www.100md.com
6.21±0.131rs$\(, http://www.100md.com
HAT1rs$\(, http://www.100md.com
1∶512
4.52±0.13**m*@p1cd, http://www.100md.com
2×105 cells per well was placed into 24-well plates with 10% NCS RPMI-1640 medium in the presence or absence of HAT，n＝10，±s；**P<0.01，compared with control (HAT＝0).m*@p1cd, http://www.100md.com
3 讨论m*@p1cd, http://www.100md.com
血库，临床医学，法医以及血液免疫学，人类遗传学方面都迫切需要高效价、高亲和力、高特异性的血型单克隆抗体定型试剂。m*@p1cd, http://www.100md.com
近年来发现某些脂肪酸钠盐可提高杂交瘤细胞抗体分泌的能力，其作用机制可能是抑制组蛋白脱酰基酶引起组蛋白超酰基化，从而促进基因的表达[3]，此次实验结果显示0.25mmol/L和0.5mmol/L丁酸钠可明显提高抗A杂交瘤细胞分泌抗体的效价和亲和力，提示丁酸钠可促进抗体分泌，此结果与文献基本相似[4].m*@p1cd, http://www.100md.com
胰岛素具有加速糖和氨基酸进入细胞，促进细胞内糖代谢和蛋白质合成作用，此次实验结果显示0.01U/ml胰岛素可明显加快细胞增殖速度和提高抗体效价及亲和力，这与文献[5]研究结果基本相似。m*@p1cd, http://www.100md.com
保持杂交瘤细胞持续稳定地分泌特异性单抗具有相当重要的意义，从杂交瘤群体来看，抗体分泌不稳定的原因可能是染色体丢失，不分泌细胞过度增生，我们实验发现当HAT加到细胞培养液中后，最初几天大量小体积细胞死亡，说明实验细胞有部分恢复了对HAT的敏感性，故经重筛选的细胞分泌了浓度较高的抗体。因此我们认为根据杂交瘤细胞的具体情况，适时地用培养液再处理，将有助于提高抗A抗体的分泌量。m*@p1cd, http://www.100md.com
[基金项目]96国家火炬计划资助项目(97D231B3600291)m*@p1cd, http://www.100md.com
[作者简介]姚余有(1966-)，男，安徽黄山市人，讲师，硕士，主要从事血型定型大规模生产的研究。m*@p1cd, http://www.100md.com
[参考文献]m*@p1cd, http://www.100md.com
[1]司徒镇强.杂交瘤技术[A].见：司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养[M].北京：世界图书出版公司，1996.232～242.m*@p1cd, http://www.100md.com
[2]抗A抗B血型定型试剂制造和检定规程.见：卫生部，主编.中国生物制品规程 二部[M].北京：卫生部生物制品标准化委员会编辑出版，1993.247～248.m*@p1cd, http://www.100md.com
[3]GORMAN CM.Effect of lipid on monoclonal antibody-production by hybridoma cells[J].Nucleic Acids Res，1983，11：7631～7636.m*@p1cd, http://www.100md.com
[4]丁 皓，吴晓俐.丁酸钠对杂交瘤细胞增殖及抗体分泌的影响[J].中国免疫学杂志，1991，7(6)：51～53.m*@p1cd, http://www.100md.com
[5]萧西宾，张昌卿.胰岛素对杂交瘤细胞生长的影响[J].单克隆抗体通讯，1990，6(2)：51～53.m*@p1cd, http://www.100md.com
[收稿日期]1999-06-21；[修回日期]1999-10-08(姚余有 张玲玲 王晓琴)
单位：姚余有(安徽医科大学基础部东南医学科技发展有限公司，安徽 合肥 230032)；张玲玲(安徽医科大学基础部东南医学科技发展有限公司，安徽 合肥 230032)；王晓琴(安徽医科大学基础部东南医学科技发展有限公司，安徽 合肥 230032)+, http://www.100md.com
关键词：单克隆抗体；血型定型试剂；杂交瘤细胞+, http://www.100md.com
免疫学杂志000312 [摘 要]目的 研究影响抗A杂交瘤细胞抗体分泌的部分因素。方法 通过试管法和玻片法检测抗A抗体的效价和亲和力。结果 0.25mmol/L、0.5mmol/L丁酸钠和0.01U/ml胰岛素能明显提高抗A抗体的效价和亲和力；HAT重筛选可使部分小体积细胞迅速死亡，抗A抗体的效价和亲和力明显提高。结论 丁酸钠、胰岛素和HAT重筛选可提高抗A杂交瘤细胞抗体的分泌。+, http://www.100md.com
[中图分类号]R392-33 [文献标识码]A+, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0204-02+, http://www.100md.com
The study of fact that influence the anti-A antibody of hybridoma+, http://www.100md.com
YAO Yu-you，ZHANG Ling-ling，WANG Xiao-qing+, http://www.100md.com
(Southeastern Medical Science and Techology Development Co Ltd，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)+, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To study the fact that influenced the anti-A antibody of hybridoma.Methods The titer and affinity of anti-A secreted by hybridoma were tested by tube method and slide method.Results 0.25mmol/L and 0.5mmol/L sodium butyrate could significantly increase the titer and affinity of anti-A that could be promoted by 0.01 U/ml insulin too.Many smaller ones of the experimental cells died rapidly in the HAT medium，after which the titer and affinity of anti-A rose markedly.Conclusion The sodium butyrate and insulin can promote the titer and affinity of anti-A secreted by hybridoma，and the surviving clones in HAT medium could secreted more antibody of anti-A.
[Key words]monoclonal antibody；blood grouping reagents；hybridoma4h}{&q, 百拇医药
血型定型单克隆抗体试剂已广泛用于临床医学、法医学、考古学等工作中，与某些发达国家相比我国血型定型试剂在效价和亲和力方面仍存在一定差距，有些企业因产品效价和亲和力达不到国家标准而致产量大幅度下降，故研究出提高抗体效价和亲和力的方法将有着深远的意义。4h}{&q, 百拇医药
1 材料与方法4h}{&q, 百拇医药
1.1 细胞系抗A-6-1-G11 由本校分子生物学研究室提供。4h}{&q, 百拇医药
1.2 试剂 牛胰岛素(40U/ml)，上海生物化学试剂厂生产；RPMI1640，美国GIBCO产品；氨甲喋呤(AR级)，Fluka公司产品；丁酸钠(AR级)、次黄嘌呤(AR级)、胸腺嘧啶核苷(AR级)均为Sigma公司产品；小牛血清，合肥奶牛厂产品。4h}{&q, 百拇医药
1.3 仪器 CO2培养箱，美国IEVCO产品；倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品。4h}{&q, 百拇医药
1.4 抗A杂交瘤细胞的培养 将冻存于液氮中的抗A杂交瘤细胞复苏后，移入盛有10%小牛血清1640培养液中，置37°C，5%CO2培养箱中培养，待细胞长满底壁后传代，第3代细胞生长速度明显加快，此细胞即可作为实验细胞。4h}{&q, 百拇医药
1.5 丁酸钠对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 将实验细胞从培养瓶底壁吹下，洗涤2次后，用10%小牛血清1640培养液配成浓度为1×105/ml个细胞的细胞悬液，移入24孔培养板，每孔1ml，然后加入含不同浓度丁酸钠的1640培养液1ml，观察不同浓度丁酸钠对抗体分泌的影响。4h}{&q, 百拇医药
1.6 胰岛素对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 细胞培养及实验细胞分组同前，最后向24孔培养板中加入不同浓度胰岛素，观察胰岛素对抗体分泌的影响。4h}{&q, 百拇医药
1.7 HAT筛选对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 培养基的配制见文献[1]，用此培养基配制浓度为1×105/ml个细胞的细胞悬液，移入24孔培养板每孔2ml，置37°C，5%CO2培养箱中培养，待培养一定时间后逐渐更换成普通培养基，另设无HAT对照，观察HAT筛选组与无HAT组之间的差别。
1.8 抗A抗体效价和亲和力测定 见中国生物制品规程二部[2].x?@^, http://www.100md.com
1.9 数据处理 采用student’t检验.x?@^, http://www.100md.com
2 结果.x?@^, http://www.100md.com
2.1 丁酸钠对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 按表1分组，结果显示0.25mmol/L和0.5mmol/L的丁酸钠组抗体效价和亲和力明显提高，但当丁酸钠浓度为1mmol/L时，杂交瘤细胞生长受到抑制，抗体效价随之明显降低。.x?@^, http://www.100md.com
表1 丁酸钠对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响.x?@^, http://www.100md.com
Tab1 The effect of sodium butyrate on anti-A antibody secreted by hybridoma Sodium butyrate(mmol/L).x?@^, http://www.100md.com
Titer.x?@^, http://www.100md.com
Affinity(s).x?@^, http://www.100md.com
0.x?@^, http://www.100md.com
1∶256.x?@^, http://www.100md.com
6.21±0.13.x?@^, http://www.100md.com
0.125.x?@^, http://www.100md.com
1∶256.x?@^, http://www.100md.com
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1∶512.x?@^, http://www.100md.com
5.24±0.11**.x?@^, http://www.100md.com
0.5.x?@^, http://www.100md.com
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4.52±0.13**.x?@^, http://www.100md.com
1.0.x?@^, http://www.100md.com
1∶128
7.00±0.11+85w}pw, 百拇医药
1×105 cells per well was incubated with various concentrations of sodium butyrate at 37°C，5%CO2.The titer and affinity was tested when the cell grew fully on the bottom of bottle，n＝10，
±s；**P<0.01，compared with control(sodium butyrate＝0).+85w}pw, 百拇医药2.2 胰岛素对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响 往抗A杂交瘤细胞中加入不同浓度胰岛素，表2结果显示仅0.01U/ml胰岛素可使细胞增殖速度明显加快，抗体效价和亲和力明显升高。+85w}pw, 百拇医药
表2 胰岛素对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响+85w}pw, 百拇医药
Tab2 The effect of insulin on anti-A antibody secreted by hybridoma Insulin(U/ml)+85w}pw, 百拇医药
Titer+85w}pw, 百拇医药
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0+85w}pw, 百拇医药
1∶256+85w}pw, 百拇医药
6.21±0.13+85w}pw, 百拇医药
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6.20±0.13+85w}pw, 百拇医药
0.01+85w}pw, 百拇医药
1∶512+85w}pw, 百拇医药
5.32±0.11**+85w}pw, 百拇医药
0.1+85w}pw, 百拇医药
1∶2561rs$\(, http://www.100md.com
6.22±0.121rs$\(, http://www.100md.com
1.01rs$\(, http://www.100md.com
1∶2561rs$\(, http://www.100md.com
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1×105 cells per well was incubated with various concentrations of insulin at 37°C，5%CO2.The titer and affinity was tested when the cell grew fully on the bottom of bottle，n＝10，
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表 3 HAT筛选对抗A杂交瘤细胞抗体分泌的影响1rs$\(, http://www.100md.com
Tab3 The effect of screening with HAT medium on anti-A antibody secreted by hybridoma Group1rs$\(, http://www.100md.com
Titer1rs$\(, http://www.100md.com
Affinity(s)1rs$\(, http://www.100md.com
non-HAT1rs$\(, http://www.100md.com
1∶2561rs$\(, http://www.100md.com
6.21±0.131rs$\(, http://www.100md.com
HAT1rs$\(, http://www.100md.com
1∶512
4.52±0.13**m*@p1cd, http://www.100md.com
2×105 cells per well was placed into 24-well plates with 10% NCS RPMI-1640 medium in the presence or absence of HAT，n＝10，
±s；**P<0.01，compared with control (HAT＝0).m*@p1cd, http://www.100md.com3 讨论m*@p1cd, http://www.100md.com
血库，临床医学，法医以及血液免疫学，人类遗传学方面都迫切需要高效价、高亲和力、高特异性的血型单克隆抗体定型试剂。m*@p1cd, http://www.100md.com
近年来发现某些脂肪酸钠盐可提高杂交瘤细胞抗体分泌的能力，其作用机制可能是抑制组蛋白脱酰基酶引起组蛋白超酰基化，从而促进基因的表达[3]，此次实验结果显示0.25mmol/L和0.5mmol/L丁酸钠可明显提高抗A杂交瘤细胞分泌抗体的效价和亲和力，提示丁酸钠可促进抗体分泌，此结果与文献基本相似[4].m*@p1cd, http://www.100md.com
胰岛素具有加速糖和氨基酸进入细胞，促进细胞内糖代谢和蛋白质合成作用，此次实验结果显示0.01U/ml胰岛素可明显加快细胞增殖速度和提高抗体效价及亲和力，这与文献[5]研究结果基本相似。m*@p1cd, http://www.100md.com
保持杂交瘤细胞持续稳定地分泌特异性单抗具有相当重要的意义，从杂交瘤群体来看，抗体分泌不稳定的原因可能是染色体丢失，不分泌细胞过度增生，我们实验发现当HAT加到细胞培养液中后，最初几天大量小体积细胞死亡，说明实验细胞有部分恢复了对HAT的敏感性，故经重筛选的细胞分泌了浓度较高的抗体。因此我们认为根据杂交瘤细胞的具体情况，适时地用培养液再处理，将有助于提高抗A抗体的分泌量。m*@p1cd, http://www.100md.com
[基金项目]96国家火炬计划资助项目(97D231B3600291)m*@p1cd, http://www.100md.com
[作者简介]姚余有(1966-)，男，安徽黄山市人，讲师，硕士，主要从事血型定型大规模生产的研究。m*@p1cd, http://www.100md.com
[参考文献]m*@p1cd, http://www.100md.com
[1]司徒镇强.杂交瘤技术[A].见：司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养[M].北京：世界图书出版公司，1996.232～242.m*@p1cd, http://www.100md.com
[2]抗A抗B血型定型试剂制造和检定规程.见：卫生部，主编.中国生物制品规程 二部[M].北京：卫生部生物制品标准化委员会编辑出版，1993.247～248.m*@p1cd, http://www.100md.com
[3]GORMAN CM.Effect of lipid on monoclonal antibody-production by hybridoma cells[J].Nucleic Acids Res，1983，11：7631～7636.m*@p1cd, http://www.100md.com
[4]丁 皓，吴晓俐.丁酸钠对杂交瘤细胞增殖及抗体分泌的影响[J].中国免疫学杂志，1991，7(6)：51～53.m*@p1cd, http://www.100md.com
[5]萧西宾，张昌卿.胰岛素对杂交瘤细胞生长的影响[J].单克隆抗体通讯，1990，6(2)：51～53.m*@p1cd, http://www.100md.com
[收稿日期]1999-06-21；[修回日期]1999-10-08(姚余有 张玲玲 王晓琴)