环磷酰胺诱导的Fas／FasL依赖的鼠胸腺细胞凋亡
作者：李薇 高素君 王冠军 蔡露&5.(0c;, 百拇医药
单位：李薇(白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科，吉林 长春 130021)；高素君(白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科，吉林 长春 130021)；王冠军(白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科，吉林 长春 130021)；蔡露(加拿大西安大略大学病理科)&5.(0c;, 百拇医药
关键词：环磷酰胺；细胞凋亡；P53；Fas/FasL&5.(0c;, 百拇医药
免疫学杂志000423 [中图分类号] R371.22 [文献标识码] B&5.(0c;, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)04-0315-01&5.(0c;, 百拇医药
Cyclophosphamie induces a Fas/FasL-dependent apoptotic cell death in rat thymus&5.(0c;, 百拇医药
LI Wei，GAO Su-jun，WANG Guan-jun，CAI Lu&5.(0c;, 百拇医药
环磷酰胺(Cyclophosphamide，CPA)是具有抗肿瘤及免疫抑制双重药理作用的药物。研究已发现其对肿瘤细胞的杀伤作用是通过诱导细胞调亡而实现的[1]，胸腺作为中枢性免疫器官，在免疫疫系统中起重要作用，本研究探讨CPA能否在体内诱导大鼠胸腺细胞调亡及其作用途径。&5.(0c;, 百拇医药
1 材料和方法&5.(0c;, 百拇医药
1.1 材料 雄性SD大鼠，重375～400 g，白求恩医科大学动物中心喂养。细胞调亡原位末端标记试剂盒为美国Oncor公司产品，P53、Fas多克隆抗体及ABC试剂盒为Vector公司产品。环磷酰胺为奥地利ASTA药厂产品。&5.(0c;, 百拇医药
1.2 动物处理 实验分两大组：第一组大鼠经灌胃给予0、2、7、20和70 mg/kg CPA处理12 h后取胸腺，第二组给予70 mg/kg CPA后于不同时间(0、4、12、18、24和48 h)取胸腺，部分组织用于DNA分离，另一部分福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚切片。每个剂量或时间点用3只鼠。&5.(0c;, 百拇医药
1.3 细胞凋亡原位末端标记检测 采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)将地高辛偶联的d-UTP标记在凋亡细胞的DNA3’(-OH)末端，再与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育，DAB染色，苏木素复染。
1.4 DNA凝胶电泳分析 按文献[1]的方法。;jx, 百拇医药
1.5 Fas蛋白及P53蛋白免疫组化染色 切片脱蜡脱水后，浸入含3%H2O2的甲醇中30 min以消除内生酶活性，正常羊血清孵育1 h后用1：500稀释的兔多克隆Fas抗体孵育30 min或多克隆P53抗体孵育1 h，之后用生物素标记的抗兔或抗羊二抗处理。常规ABC法染色，DAB显色。;jx, 百拇医药
2 结果;jx, 百拇医药
2.1 DNA凝胶电泳及细胞凋亡原位染色分析 DNA凝胶电泳显示不同剂量组中20和70 mg/kg CPA处理12 h出现明显的梯形图像，<20 mg/kg时未见梯形DNA图像，70 mg/kg CPA处理组于8～24 h出现明显DNA梯形图像，48 h消失。细胞凋亡原位染色基本上显示相似的结论：对照组及7 mg/kg CPA组出现低比率的凋亡细胞染色，20及70 mg/kg组出现高比率的细胞凋亡染色，后者呈大边状(见图1)。;jx, 百拇医药
2.2 Fas蛋白及P53蛋白的染色 Fas蛋白染色显示正常鼠胸腺Fas蛋白位于细胞膜和细胞浆，70 mg/kg CPA作用组发现4～8 h Fas染色强度明显增加，以后逐渐减少至正常水平。Fas蛋白的表达增强发生在细胞凋亡之前。P53染色对照组与CPA组相比未显示出与细胞凋亡的任何相关性。
;jx, 百拇医药
图1鼠胸腺细胞凋亡原位末端标记染色(400×);jx, 百拇医药
Fig 1Apoptotic cell staning in thymus measured by;jx, 百拇医药
TUNULtechmique;jx, 百拇医药
a：contnol group； b，c，d：7、20、70 mg/kg CPA treated group;jx, 百拇医药
3 讨论;jx, 百拇医药
通过CPA对大鼠胸腺的作用研究表明：20 mg/kg和70 mg/kg CPA即能引起胸腺细胞凋亡。故该药作为化疗药物杀伤肿瘤细胞的同时将会引起免疫损伤，导致免疫抑制而影响治疗效果[2]，因此，如何在化放疗时选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，减少免疫细胞、造血细胞的凋亡将具有重要的研究价值。Fas/FasL是广泛涉及淋巴和非淋巴细胞凋亡的主要信号系统[3]。本研究首次发现CPA引起鼠胸腺细胞凋亡是通过Fas途径，而非P53途径而实现的。;jx, 百拇医药
[作者简介]李薇 (1957-)，女，吉林长春市人，副教授，硕士，主要从事造血调控方面的研究。;jx, 百拇医药
[参考文献];jx, 百拇医药
[1] HOALLEM SA， HALES BF. Induction of apoptosis and Cathepsin D in limbs exposed in vitro to a activated analog of cyclophosphamide [J]. Teratology， 1995， 52：(1)3-14.;jx, 百拇医药
[2] BERGE RJ， WITER AH， VAYX DL. Immunosuppressive drugs in clinical medicine[J]. Netherlands J Med， 1994， 45(2)：392-338;jx, 百拇医药
[3] FRIESEN C， HERR I， KRAMMER PH， et al. Ivolvement of the CD95(APO-1/FAS) receptor/ligent system in drung-induced apoptosis in leukemia cell[J]. Nat Med， 1997，2(1)：257-577.;jx, 百拇医药
[收稿日期]2000-02-21；[修回日期]2000-04-28(李薇 高素君 王冠军 蔡露)
单位：李薇(白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科，吉林 长春 130021)；高素君(白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科，吉林 长春 130021)；王冠军(白求恩医科大学第一临床学院血液肿瘤科，吉林 长春 130021)；蔡露(加拿大西安大略大学病理科)&5.(0c;, 百拇医药
关键词：环磷酰胺；细胞凋亡；P53；Fas/FasL&5.(0c;, 百拇医药
免疫学杂志000423 [中图分类号] R371.22 [文献标识码] B&5.(0c;, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)04-0315-01&5.(0c;, 百拇医药
Cyclophosphamie induces a Fas/FasL-dependent apoptotic cell death in rat thymus&5.(0c;, 百拇医药
LI Wei，GAO Su-jun，WANG Guan-jun，CAI Lu&5.(0c;, 百拇医药
环磷酰胺(Cyclophosphamide，CPA)是具有抗肿瘤及免疫抑制双重药理作用的药物。研究已发现其对肿瘤细胞的杀伤作用是通过诱导细胞调亡而实现的[1]，胸腺作为中枢性免疫器官，在免疫疫系统中起重要作用，本研究探讨CPA能否在体内诱导大鼠胸腺细胞调亡及其作用途径。&5.(0c;, 百拇医药
1 材料和方法&5.(0c;, 百拇医药
1.1 材料 雄性SD大鼠，重375～400 g，白求恩医科大学动物中心喂养。细胞调亡原位末端标记试剂盒为美国Oncor公司产品，P53、Fas多克隆抗体及ABC试剂盒为Vector公司产品。环磷酰胺为奥地利ASTA药厂产品。&5.(0c;, 百拇医药
1.2 动物处理 实验分两大组：第一组大鼠经灌胃给予0、2、7、20和70 mg/kg CPA处理12 h后取胸腺，第二组给予70 mg/kg CPA后于不同时间(0、4、12、18、24和48 h)取胸腺，部分组织用于DNA分离，另一部分福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚切片。每个剂量或时间点用3只鼠。&5.(0c;, 百拇医药
1.3 细胞凋亡原位末端标记检测 采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)将地高辛偶联的d-UTP标记在凋亡细胞的DNA3’(-OH)末端，再与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体孵育，DAB染色，苏木素复染。
1.4 DNA凝胶电泳分析 按文献[1]的方法。;jx, 百拇医药
1.5 Fas蛋白及P53蛋白免疫组化染色 切片脱蜡脱水后，浸入含3%H2O2的甲醇中30 min以消除内生酶活性，正常羊血清孵育1 h后用1：500稀释的兔多克隆Fas抗体孵育30 min或多克隆P53抗体孵育1 h，之后用生物素标记的抗兔或抗羊二抗处理。常规ABC法染色，DAB显色。;jx, 百拇医药
2 结果;jx, 百拇医药
2.1 DNA凝胶电泳及细胞凋亡原位染色分析 DNA凝胶电泳显示不同剂量组中20和70 mg/kg CPA处理12 h出现明显的梯形图像，<20 mg/kg时未见梯形DNA图像，70 mg/kg CPA处理组于8～24 h出现明显DNA梯形图像，48 h消失。细胞凋亡原位染色基本上显示相似的结论：对照组及7 mg/kg CPA组出现低比率的凋亡细胞染色，20及70 mg/kg组出现高比率的细胞凋亡染色，后者呈大边状(见图1)。;jx, 百拇医药
2.2 Fas蛋白及P53蛋白的染色 Fas蛋白染色显示正常鼠胸腺Fas蛋白位于细胞膜和细胞浆，70 mg/kg CPA作用组发现4～8 h Fas染色强度明显增加，以后逐渐减少至正常水平。Fas蛋白的表达增强发生在细胞凋亡之前。P53染色对照组与CPA组相比未显示出与细胞凋亡的任何相关性。
;jx, 百拇医药图1鼠胸腺细胞凋亡原位末端标记染色(400×);jx, 百拇医药
Fig 1Apoptotic cell staning in thymus measured by;jx, 百拇医药
TUNULtechmique;jx, 百拇医药
a：contnol group； b，c，d：7、20、70 mg/kg CPA treated group;jx, 百拇医药
3 讨论;jx, 百拇医药
通过CPA对大鼠胸腺的作用研究表明：20 mg/kg和70 mg/kg CPA即能引起胸腺细胞凋亡。故该药作为化疗药物杀伤肿瘤细胞的同时将会引起免疫损伤，导致免疫抑制而影响治疗效果[2]，因此，如何在化放疗时选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，减少免疫细胞、造血细胞的凋亡将具有重要的研究价值。Fas/FasL是广泛涉及淋巴和非淋巴细胞凋亡的主要信号系统[3]。本研究首次发现CPA引起鼠胸腺细胞凋亡是通过Fas途径，而非P53途径而实现的。;jx, 百拇医药
[作者简介]李薇 (1957-)，女，吉林长春市人，副教授，硕士，主要从事造血调控方面的研究。;jx, 百拇医药
[参考文献];jx, 百拇医药
[1] HOALLEM SA， HALES BF. Induction of apoptosis and Cathepsin D in limbs exposed in vitro to a activated analog of cyclophosphamide [J]. Teratology， 1995， 52：(1)3-14.;jx, 百拇医药
[2] BERGE RJ， WITER AH， VAYX DL. Immunosuppressive drugs in clinical medicine[J]. Netherlands J Med， 1994， 45(2)：392-338;jx, 百拇医药
[3] FRIESEN C， HERR I， KRAMMER PH， et al. Ivolvement of the CD95(APO-1/FAS) receptor/ligent system in drung-induced apoptosis in leukemia cell[J]. Nat Med， 1997，2(1)：257-577.;jx, 百拇医药
[收稿日期]2000-02-21；[修回日期]2000-04-28(李薇 高素君 王冠军 蔡露)