西伯利亚蝗痘病毒超微结构和发育及DNA特性

http://www.100md.com 《病毒学报》 2000年第3期

     作者：王丽英 李永丹 杨红珍 阿不都.外力 余晓光 巴哈提亚尔

    单位：王丽英 李永丹 杨红珍(中国农业大学昆虫学系，北京 100094)；阿不都.外力 余晓光 巴哈提亚尔(新疆蝗虫鼠害测报防治站，新疆 乌鲁木齐 830001)

    关键词：蝗虫；西伯利亚蝗痘病毒；超微结构；DNA酶解图谱

    病毒学报000313 摘要：为寻找新的生物治蝗措施，采用显微镜和生化方法，对1992年从新疆木垒县西伯利亚蝗上分离的一株痘病毒(Gomphocerus sibiricus entomopoxvirus, GsEPV)的超微结构、发育循环和DNA特性进行了研究，结果表明：该病毒的包含体为球形，最大直径约6.90μm，最小直径约3.95μm，平均为5.33μm。脂肪体超薄切片中的病毒粒子呈椭圆形，大小为267nm×103nm。病毒粒子髓核折叠成2～3折，其横切面呈圆形，中间有3～4个电子非致密的圆点。GsEPV主要感染寄主脂肪体。接种后15～20天包含体大量形成，此时已没有游离病毒粒子存在，发育同步，并且比其它痘病毒发育周期短。GsEPV-DNA经三种限制性内切酶HindⅢ、BglⅡ和EcoRⅠ酶解后分别得到20、17和29条片段，其分子量分别为155.37×10⁶D，156.45×10⁶D和156.79×10⁶D，平均为155.37×10⁶D。与已报道的蝗虫痘病毒进行比较，这些痘病毒可分为二种类型：一种包含体为圆形的；另一种为椭圆形。形态相似的包含体病毒髓核结构相似，分子量也在一个范围内，具有椭圆形包含体的痘病毒如OaEPV、CiEPV、MsEPV、AcEPV和PnEPV，其病毒粒子中DNA链折叠较少(1～2折)，分子量也较小，通常在125×10⁶D范围；而具有圆形包含体的痘病毒如DkEPV和GsEPV，其DNA链折叠较多(2～3折)，分子量也较大，在155×10⁶D范围。

    中图分类号：Q965.8 文献标识码：A

    文章编号：1000-8721(2000)03-0252-06

    Ultrastructure Development and Some DNA Characteristics of Gomphocerus

    sibiricus (L) Entomopoxvirus

    WANG Li-ying，LI Yong-dan，YANG Hong-zhen

    (Entomology Department of China Agricultural Unviersity, Beijing 100094, China)

    Arbudo^.Waili，YU Xiao-guang，Bahetiyaer

    (Xinjiang Command Post of Grasshopper and Rodents Control, Urümqi 830001, China)

    Abstract: This paper studied a strain of EPV (Gomphocerus sibiricus entomopoxvirus-GsEPV) isolated from Gomphocerus sibiricus(L) in Mulei county, Xinjiang Autonomous Region in 1992, the EPV may be potentially a kind of bio-pesticide. Using microscopic and biochemical methods to study the ultrastructure, development and characteristics of DNA of this virus, we found that the occlusion body of the virus is spherical, and the maximum diameter is about 6.90μm, the minimum about 3.95μl, the average 5.33μm. With electron microscope, the virion observed is oval, and the size is 267nm×103nm. The core of the virion folds back 2-3 times, and its cross section appears to be round, with 3-4 electronic nondense dots in it. GsEPV mainly infects the fat body of its host. Numbers of EPV occlusion bodies can be observed 15-20 days after inoculation. At this time, there is no free virion, and GsEPV obviously develops quickly and synchronously, so the GsEPV is easy to prevail possibly relating to this character. The GsEPV-DNA, when cleaved with restriction enzymes HindⅢ, BglⅡ and EcoRⅠ, produces 20, 17, 29 DNA fragments, and the molecular weight is 155.37×10⁶D, 156.45×10⁶D and 156.79×10⁶D respectively, and the average is 156.20×10⁶D. After comparing with the reported grasshopper EPV, we can classify them into two types: One with spherical occlusion bodies, the other with oval occlusion bodies. The EPV whose occlusion bodies are similar ecah other have the similar core structure and their molecular weight are also similar. In the virion of the EPV with oval occlusion bodies, such as OaEPV, CiEPV, MsEPV, VAcEPV and PnEPV, the DNA chain folds back less (1-2times), and its molecular weight is smaller, often about 125×10⁶D; but in the EPV with spherical occlusion bodies, such as DkEPV and GsEPV, the DNA folds back much (2-3times), and its molecular weight is larger, about 155×10⁶D.

    Key words: grasshopper and locust; Gomphocerus sibiricus entomopoxvirus; ultrastructure; DNA restriction endonuclease analysis

    西伯利亚蝗〔Gomphocerus sibiricus(L)〕国外分布于俄罗斯的西伯利亚和蒙古国,国内分布在新疆、黑龙江、内蒙古和吉林等地。在新疆常年发生，数量大，不仅危害牧草造成严重损失，还影响牧草开花结种，抑制草地更新复壮；严重发生年份也摄食小麦等禾本科作物，是新疆早期优势种蝗虫种类^[1]。

    1981年西伯利亚蝗痘病毒(Gomphocerus sibiricus entomopoxvirus，简称GsEPV)先在新疆阿勒泰后又在巴里坤草原蝗虫上大流行，使大批蝗虫死亡，颇引人瞩目^[2]。一些科技工作者试图利用这种病原物防治蝗虫，但由于种种困难未能进行下去。80年代中期，我国从国外引入微孢子虫治蝗取得成效^[3，4]，然而由于杀虫速度缓慢，杀虫效果尚不够理想。为此我们试图寻找新的生物治蝗措施。

    蝗虫痘病毒是一类昆虫特异性DNA病毒，寄主域仅限于昆虫钢。不同昆虫痘病毒属以及与脊椎动物痘病毒间均无血清学关系^[5]。动物试验表明，昆虫痘病毒用于生物防治是安全的。一些研究表明，昆虫痘病毒致病力较强^[6，7]，易引起流行病并能较长期贮存，是值得研究和利用的病毒类群。新疆地区当地领导和科技人员对利用这种痘病毒治蝗也颇感兴趣，他们克服很多困难，翻山越岭到当年GsEPV大流行的地块采集蝗虫，希望能再次分离到GsEPV，遗憾的是没有采到。1992年作者在新疆木垒县进行微孢子虫防治试验时，偶然从1头病死的西伯利亚蝗上分离到痘病毒，并置于冰箱内保存，直到1996年将之取出重新繁殖起来，并观察了该病毒的形态结构，在寄主体内的发育循环及DNA酶解图谱等。

    材料与方法

    1 GsEPV病毒来源 从新疆木垒县采到的西伯利亚蝗痘病毒病虫尸，从冰箱取出，加无菌水研磨过滤，差速离心得到粗提纯痘病毒包含体，-20℃保存备用。

    2 感染试验 新疆草原上采集西伯利亚蝗虫2～3龄，室内饲养至3～4龄接种痘病毒。将上述粗提纯的西伯利亚蝗痘病毒包含体稀释成1×10⁹OBS/L，涂于麦苗或苔草饲料块上，单头饲喂，取吃光毒叶的若虫作试虫，置养虫笼内正常饲养。一部分试虫用于接种，接种后不同天数取样制超薄切片，另一部分试虫用于繁殖痘病毒，收集病死虫尸，置-20℃冰箱保存备用。

    3 显微镜观察 光学显微镜：取接种发病的西伯利亚蝗虫解剖，取出消化道、马氏管、气管组织、表皮和脂肪体组织，用生理盐水洗涤，取小块组织涂片光学显微镜观察。透射电镜：另取接种后不同天数的蝗虫脂肪体小块，用2.5%戊二醛和1%锇酸进行双固定，丙酮系列脱水，Epon812包埋，制超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，TEM-100CX透射电镜观察拍片。扫描电镜：取提纯的西伯利亚蝗痘病毒包含体，稀释成适宜浓度，涂于盖玻片上凉干，2B型离子溅射器喷金，SEM-505扫描电镜观察拍片。

    4 GsEPV包含体和病毒粒子提取纯化 将粗提纯痘病毒包含体经蔗糖密度梯度(50%～65%)离心，4℃22 000r/min 1h，收集58%～60%之间的深褐色带，洗去蔗糖即为纯化的痘病毒包含体。取纯化的痘病毒包含体加碱性裂解液混匀，置37℃水浴碱解20～30min，痘病毒包含体逐渐膨胀释放出病毒粒子，待95%以上包含体裂开后，冰浴终止碱解，并将其置于蔗糖密度梯度(40%～55%)离心，4℃ 22 000r/min 1h，收集45%处的白色带，洗去蔗糖即为纯化的病毒粒子，悬浮于TE缓冲液中电镜检查纯度，4℃保存备用。

    5 GsEPV-DNA的提纯及限制性内切酶酶解 取纯化的病毒粒子离心，取沉淀，加2×SDS裂解缓冲液，蛋白酶K和β-巯基乙醇混匀后置50℃水浴30min，冷却至室温。用等体积的水饱和酚和氯仿反复抽提除去蛋白质提纯的DNA，溶解于TE缓冲液中，-20℃保存备用。在GsEPV-DNA酶反应缓冲液中，分别用3种限制性内切酶EcoR Ⅰ，BglⅡ和HindⅢ酶解，37℃水浴2～3h。

    6 琼脂糖凝胶电泳 采用平板式琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0.5%，并加入溴化乙锭、TBE电泳缓冲液，电压30V，室温下电泳18h，紫外透射仪观察并拍片。

    结果与结论

    1 GsEPV球状体和病毒粒子的形态和超微结构

    在光学显微镜下观察，西伯利亚蝗痘病毒包含体为球形，又称球状体(spheroid)，这与已报道的具有圆形包含体的戟纹蝗痘病毒(DkEPV)颇相似^[8]。扫描电镜观察到这两种痘病毒的立体图象有些差异，GsEPV的形状为圆球形，DkEPV的形状大多为方圆形，且前者的个体比后者大。此外，DkEPV成熟包含体中常看到有许多表面呈蜂窝状的小孔，称为未成熟包含体，这在GsEPV中则很少见到。痘病毒发育后期仍有许多未成熟包含体存在，可能与这种痘病毒发育周期不同步有关。作者观察了上述两种痘病毒在寄主体内发育过程后发现，GsEPV发育周期较短，在包含体发育成熟阶段没有观察到游离的病毒粒子，病毒粒子发育成熟比较一致，然后同步进入包含体发育阶段，发育同步；但DkEPV则相反，发育周期拖的较长，病毒粒子和包含体阶段发育不同步，如已有大量包含体处于成熟阶段，同时又有许多游离病毒粒子存在，有的还处于包埋过程中。

    从病毒包含体超薄切片的横切面观察，GsEPV的无病毒粒子外层比DkEPV的薄，经碱裂解速度也较DkEPV快，可见碱裂解快慢与包含体无病毒粒子层厚度呈负相关。西伯利亚蝗痘病毒频频发生自然流行是否与这些特征有关尚待研究。

    透射电镜观察病虫脂肪体的超薄切片，可见GsEPV包含体内的病毒粒子的纵切面为椭圆形，大小为267nm×103nm。病毒粒子核心折叠成2～3折的电子非致密的绳索结构，其横切面中髓核呈圆形，中间有3～4个电子非致密的圆点(图7、8)，与DkEPV相似。但与具有椭圆形包含体的亚洲小车蝗痘病毒(OaEPV)和意大利蝗痘病毒(CiEPV)不同，核心折叠成1～2折，横切面有2～3个圆点^[2，9，10]。由此可见，形态相似的痘病毒间，如具有圆形包含体的GsEPV和DkEPV，或具有椭圆形包含体的OaEPV和CiEPV之间，它们病毒髓核的结构也颇相似。

    2 GsEPV在寄主脂肪体细胞内的发育

    解剖病虫各组织器官并在显微镜下观察，可见GsEPV主要感染蝗虫脂肪体。病虫脂肪体的颜色变浅，失去网状结构。取小块脂肪体制水压片，显微镜下可见到许多球形的病毒包含体，滴入少量碱液，包含体立即膨胀，释放出病毒粒子(相差显微镜下看的更清楚)。

    病毒包含体经口摄入蝗虫体内，在碱性消化液作用下裂解，释放出的病毒粒子吸附在中肠细胞微绒毛上，穿过肠壁细胞进入体腔，侵染敏感组织并在其中复制和增殖。

    透射电镜观察到脂肪体细胞质，尤其是靠近细胞核附近的细胞中首先出现电子致密的形状不规则的团块，这就是病毒发生基质(viroplasm)，是病毒DNA复制和早期装配的基地(图2)。病毒发生基质通常以出芽方式向外伸出，在细胞质内靠近病毒发生基质附近形成许多球形颗粒，逐渐与原病毒发生基质脱离释放到细胞质中，即为未成熟的双膜病毒粒子(图2、3)，进一步发育分化出侧体、衣壳和髓核，病毒粒子逐渐成熟并由圆形变为单膜的椭圆形(图4)。成熟病毒粒子逐渐被包埋进入具有晶格结构的包含体内(图5)，病毒粒子在包含体呈放射状排列(图6)。成熟包含体在细胞内以单个形式存在，偶见2～3个在一起，但没看到象OaEPV多个包含体聚集成“嵌合体”。DkEPV接种后20～30天包函体才大量形成，同时也有大量游离病毒以及带有蜂窝状小孔的未成熟包含体存在，发育不同步，发育周期较长。而GsEPV在寄主体内发育较快，发育周期较短，接种后15～20天即有大量成熟包含体形成，此时很难观察到游离病毒粒子，看来其发育是同步的。这些特性与病毒毒力及易引起流行病是否有关尚待进一步研究。

    3 GsEPV-DNA酶解图谱及分子量

    纯化的病毒粒子经SDS和蛋白酶K降解，氯仿酚抽提得到病毒DNA，经HindⅢ、BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶解后，分别得到20、17和29条酶解片段(图9)。以λ噬菌体DNA的HindⅢ酶解片段为标准，测得GsEPV病毒的分子量分别为155.37×10⁶D、156.45×10⁶D和156.79×10⁶D，平均为156.20×10⁶D(表1)。Streett等报道^[11]，美国发现的6种蝗虫痘病毒的分子量大约在125～155×10⁶D范围。比较已报道的蝗虫痘病毒可看出，病毒包含体的形态结构与DNA结构及其分子量有关，如具有圆形包含体的痘病毒DkEPV和GsEPV，其病毒DNA链折叠较多(2～3折)，其横切面电子致密圆点为3～4个，分子量较大，分别为155.5×10⁶D和156.20×10⁶D，在155×10⁶D范围内^[8]；而具有椭圆形包含体的痘病毒如：OaEPV、CiEPV、MsEPV、AcEPV和PnEPV^[11，12]，其DNA链折叠较少(1～2折)，分子量也较少，分别为122.7×10⁶D，135.7×10⁶D、120×10⁶D、129×10⁶D和125×10⁶D，在125×10⁶D范围内。

    图1-8 GsEPV的形态及在脂肪体细胞内的发育

    Figure 1-8 Morphology of GsEPV and development in fat bodies of its host

    1. Morphological characteristics of spheroid of GsEPV， showing as ellipsoids under scanning microscope; 2. The viroplasm appears in the cytoplasm showing as irregular electron dense masses and budding out to form spherical particles (30，000×)； 3. Immature virion with double membrane in the cytoplasm (30，000×)；4. Immature virion with single membrane in the cytoplasm (39，000×).

    5. Mature virion being embedded into the occlusion body(18，000×); 6. Virions arranged radially in the occlusion body(49，500×); 7. Longitudinal section of mature virions showing core of virion folded 2-3 times (8，300×); 8. Cross section of mature virions showing rounded core and the virion with 3-4 dots in it (39,000×).

    图9 GsEPV-DNA 经EcoRⅠ(B)、BglⅡ(C)、HindⅢ(D)酶解图谱

    Figure 9 Cleavage of GsEPV-DNA with restriction endonucleases EcoRⅠ

    (Lane B)，BglⅡ(Lane C)and HindⅢ(Lane D)，Lane A. λ-phage DNA HindⅢ fragments.

    表1 GsEPV-DNA限制性内切酶酶解片段的分子量

    及总分子量(×10⁶D)

    Table 1 Molecular weight of GsEPV-DNA

    fragments produced by endonuclease cleavage

    with EcoRⅠ、BglⅡand HindⅢ(×10⁶D) Band

    EcoRⅠ

    BglⅡ

    HindⅢ

    1

    13.48

    21.38

    17.14(2)

    2

    12.88

    18.98

    12.67

    3

    11.23

    15.45(2)

    12.49

    4

    10.54

    13.09(2)

    12.02

    5

    10.00

    12.52

    11.23

    6

    9.15

    9.33

    10.23(2)

    7

    8.60(2)

    7.80

    7.74

    8

    8.30

    6.34(2)

    6.77(2)

    9

    7.22

    4.56

    6.13

    10

    6.45(2)

    3.21

    5.58(2)

    11

    4.70(2)

    2.70

    4.37

    12

    4.34

    2.29

    2.24(2)

    13

    3.78(2)

    2.09

    1.64(2)

    14

    3.63

    1.83

    1.52

    15

    2.71(2)

    16

    2.24

    17

    1.70

    18

    1.58(2)

    19

    1.44(2)

    20

    1.31

    21

    1.22

    22

    1.03

    Total

    156.79

    156.45

    155.37

    Average

    156.20

    Note：(2) means two fragments there with same molecular weight

    基金项目：国家自然科学基金(39770512)

    作者简介：王丽英(1942-)，女，硕士，教授，昆虫病理与生物防治。

    参考文献：

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    收稿日期：1999-08-02；修改日期：2000-01-06

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/28/58/472.htm