两性霉素B脂质体缓释体系的制备—治疗黑热病药物新剂型研究
作者：王雅静 李雄伟
单位：王雅静(华西医科大学寄生虫学研究室 成都 610044)；李雄伟(中国科学院成都有机化学研究所 成都 610041)
关键词：脂质体；两性霉素B；黑热病
实用寄生虫病杂志990103 提要 两性霉素B脂质体缓释体系可通过逆相蒸发法制得。所制得的含有两性霉素B的脂质体粒径在50nm左右。两性霉素B的包封效率达80%，体系中的两性霉素B含量为6%。两性霉素B在脂质体中具有优良的稳定性。本实验制得的两性霉素B脂质体可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
PREPARATION OF LIPOSOMAL AMPHOTERICIN B SLOW RELEASE SYSTEM
-A NEW FORMULATION FOR TREATING LEISHMANIASIS
, http://www.100md.com
Wang Yajing
Laboratory of Parasitology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044
Li Xiongwei
Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041
ABSTRACT
For preparation of slow release formulation, amphotericin B has been encapsulated with liposome by REV (Reverse-phase-evaporation) method. The size of liposomal amphotericin B was about 50 nm and the encapsulated rate reached 80%, while the content of amphotericin B in the system was 6%. Amphotericin B in liposome revealed fine stability. The liposomal amphotericin B obtained in the experiment would be applied in treatment of canine leishmaniasis.
, http://www.100md.com
Key words：Liposome, amphotericin B, leishmaniasis
近年来，我国山丘疫区黑热病有明显回升。犬是杜氏利什曼原虫的保虫宿主之一，如川北汶川县犬内脏利什曼病的感染率高达36.8%[1]。消灭病犬有利于控制犬源性内脏利什曼病的流行，但普遍灭犬的措施不易被群众接受。本实验制得的两性霉素B脂质体可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病[2]，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 ①卵磷脂 四川大学生化技术实验厂生产。②胆固醇(色谱级) Sigma公司。③两性霉素B 上海先锋药业公司生产。
1.2 制备 ①两性霉素B的校正曲线制备[3] 两性霉素B溶于甲醇中，浓度为40μg/ml。溶液于4℃置放并避光。该溶液于紫外—可见光谱(日本岛津120-02)扫描时，于405nm出现最大吸收峰。在405nm波长处，测试一系列已知浓度的两性霉素B溶液，记录各溶液的吸收值。②包封两性霉素B的脂质体的制备[4] 80mg(约20μmol)卵磷脂及70mg(约16μmol)胆固醇溶于10ml氯仿及10ml乙醚的混合液中。该溶液于旋转蒸发器中，在减压及40℃条件下，蒸干有机溶剂。10ml两性霉素B的甲醇溶液(0.5mg/ml)加入到已成膜脂质中，在旋转蒸发器中旋转混匀，并继续减压抽干。加入10ml 0.9%的NaCl溶液，250转/分条件下混匀，即得到包裹两性霉素B的脂质体。
, http://www.100md.com
1.3 分析测试 ①脂质体粒径的估测 通过离心技术进行。分别在离心转速15000转/分(～20000G)、20000转/分(～50000G)、30000转/分(～150000G)及50000转/分(～700000G)条件下离心20分钟，收集脂质体沉淀。冷冻干燥后称重，算出其重量百分率。②脂质体对两性霉素B的包封效率 由差减法算得。包裹两性霉素B的脂质体在50000转/分条件下离心，仔细取出上清液，在405nm处测其吸收值，对照标准曲线查找出上清液中两性霉素B的含量，再由下式求出包封率：
包封效率=加入两性霉素B总量-上清液中两性霉素B量/加入的两性霉素B总量×100%
1.4 稳定性实验 所制得的脂质体两性霉素B体系，加水50倍稀释后，稀释液用作样品在紫外—可见光谱区域(200～500nm)扫描，通过比较1天、2天、3天、1周、2周、4周各时刻所取样品的光谱，推测其分子结构的稳定性。
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 两性霉素B的校正曲线 光谱测试对两性霉素的定量是有效的，其在405nm处的吸收值随两性霉素B的浓度而增长(表1)。
表1.两性霉素B的浓度与其在405nm处吸收值的关系
Table 1.The relation between the concentration of amphotericin B and the absorbance at 405nm 两性霉素B浓度
Concentration of
amphotericin B
(μg/ml)
0
, 百拇医药
1.3
2.6
5.2
10.5
21
42
405nm处吸收值
Absorbance at 405nm
0
0.051
0.077
0.124
0.189
, 百拇医药
0.304
0.540
2.2 脂质体粒径及其分布 通过离心分级技术检测表明，所制得的脂质体大部分低于50nm(表2)，两步乳化逆相蒸发技术制得了纳米级的脂质体粒子，其粒子主要分布在50～200纳米范围内。该粒径范围内的脂质体粒子对网状内皮系统组织器官有着良好的靶向性。表2.两性霉素B脂质体的粒径及其分布
Table 2.The size and distribution of liposomal amphotericin B 离心力
Centrifuge force(G)
20000
50000
150000
, 百拇医药
700000
粒径
Size(nm)
300
200
100
50
重量百分比
Weight percent(%)
-
5
20
50
, http://www.100md.com
2.3 两性霉素B的携载 通过差减法计算出的脂质体对两性霉素B的包裹率可达到80%以上。体系中的两性霉素B含量为6%。这一结果反映了以胆固醇和卵磷脂所构成的脂质体对两性霉素B有良好的亲和性，可大量包裹两性霉素B。
2.4 被包裹的两性霉素B的稳定性 与两性霉素B的光谱特征相关。通过对在1天、2天、3天、1周、2周、4周所取两性霉素B脂质体样品进行光谱测试，结果发现其光谱图形基本未发生变化。由于任何化学物质的结构对应于一特殊光谱，故光谱图形可反映两性霉素B脂质体的化学特性。脂质体包裹的两性霉素B具有较好的贮存稳定性。
3 讨论 两性霉素B脂质体缓释体系可通过二次乳化逆相蒸发技术制得。该体系具有较高的包裹效率且其性能稳定。该体系可延长两性霉素B的作用时间。脂质体两性霉素B对降低两性霉素B的生物毒性具有重要作用。
目前临床上治疗黑热病人主要采用五价锑剂如葡萄糖酸锑钠或甲基葡萄糖胺锑，不但毒副作用大，失效率也较高，近年又有对锑产生抗性病例明显增多的报导。而且五价锑治疗病犬效果不好，脂质体无毒性和无免疫原性，选择性高，靶向性强，从而能减少用药剂量，降低毒性，减少副作用。在消灭病犬难以全面实施的情况下，本实验制得的两性霉素B脂质体可用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且可能为治疗黑热病人提供动物实验依据。
, 百拇医药
4 参考文献
1 胡孝素，等.用McAb-AST及骨髓涂片法对四川省汶川县犬感染利什曼原虫的调查研究.中国人兽共患病杂志 1991；7(4)∶5-8.
2 New PPC,et al.Anti-leishmanial activity of amphotericin and other antifungal agents entrapped in liposomes.J Antimicrob Chemother 1981;8∶373-381.
3 Lopez-Berestein G,et al.Treatment and prophylaxis of disseminated infection due to Candida albicans in mice with liposome-encapsulated amphotericin B.J Infect Dis 1983;147(5)∶939-945.
4 Desiderio JV,et al.Intraphagocytic killing of Salmonella typhimurium by liposome-encapsulated cephalothin.J Infect Dis 1983;148(3)∶563-570., http://www.100md.com
单位：王雅静(华西医科大学寄生虫学研究室 成都 610044)；李雄伟(中国科学院成都有机化学研究所 成都 610041)
关键词：脂质体；两性霉素B；黑热病
实用寄生虫病杂志990103 提要 两性霉素B脂质体缓释体系可通过逆相蒸发法制得。所制得的含有两性霉素B的脂质体粒径在50nm左右。两性霉素B的包封效率达80%，体系中的两性霉素B含量为6%。两性霉素B在脂质体中具有优良的稳定性。本实验制得的两性霉素B脂质体可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
PREPARATION OF LIPOSOMAL AMPHOTERICIN B SLOW RELEASE SYSTEM
-A NEW FORMULATION FOR TREATING LEISHMANIASIS
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Wang Yajing
Laboratory of Parasitology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044
Li Xiongwei
Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041
ABSTRACT
For preparation of slow release formulation, amphotericin B has been encapsulated with liposome by REV (Reverse-phase-evaporation) method. The size of liposomal amphotericin B was about 50 nm and the encapsulated rate reached 80%, while the content of amphotericin B in the system was 6%. Amphotericin B in liposome revealed fine stability. The liposomal amphotericin B obtained in the experiment would be applied in treatment of canine leishmaniasis.
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Key words：Liposome, amphotericin B, leishmaniasis
近年来，我国山丘疫区黑热病有明显回升。犬是杜氏利什曼原虫的保虫宿主之一，如川北汶川县犬内脏利什曼病的感染率高达36.8%[1]。消灭病犬有利于控制犬源性内脏利什曼病的流行，但普遍灭犬的措施不易被群众接受。本实验制得的两性霉素B脂质体可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病[2]，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 ①卵磷脂 四川大学生化技术实验厂生产。②胆固醇(色谱级) Sigma公司。③两性霉素B 上海先锋药业公司生产。
1.2 制备 ①两性霉素B的校正曲线制备[3] 两性霉素B溶于甲醇中，浓度为40μg/ml。溶液于4℃置放并避光。该溶液于紫外—可见光谱(日本岛津120-02)扫描时，于405nm出现最大吸收峰。在405nm波长处，测试一系列已知浓度的两性霉素B溶液，记录各溶液的吸收值。②包封两性霉素B的脂质体的制备[4] 80mg(约20μmol)卵磷脂及70mg(约16μmol)胆固醇溶于10ml氯仿及10ml乙醚的混合液中。该溶液于旋转蒸发器中，在减压及40℃条件下，蒸干有机溶剂。10ml两性霉素B的甲醇溶液(0.5mg/ml)加入到已成膜脂质中，在旋转蒸发器中旋转混匀，并继续减压抽干。加入10ml 0.9%的NaCl溶液，250转/分条件下混匀，即得到包裹两性霉素B的脂质体。
, http://www.100md.com
1.3 分析测试 ①脂质体粒径的估测 通过离心技术进行。分别在离心转速15000转/分(～20000G)、20000转/分(～50000G)、30000转/分(～150000G)及50000转/分(～700000G)条件下离心20分钟，收集脂质体沉淀。冷冻干燥后称重，算出其重量百分率。②脂质体对两性霉素B的包封效率 由差减法算得。包裹两性霉素B的脂质体在50000转/分条件下离心，仔细取出上清液，在405nm处测其吸收值，对照标准曲线查找出上清液中两性霉素B的含量，再由下式求出包封率：
包封效率=加入两性霉素B总量-上清液中两性霉素B量/加入的两性霉素B总量×100%
1.4 稳定性实验 所制得的脂质体两性霉素B体系，加水50倍稀释后，稀释液用作样品在紫外—可见光谱区域(200～500nm)扫描，通过比较1天、2天、3天、1周、2周、4周各时刻所取样品的光谱，推测其分子结构的稳定性。
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 两性霉素B的校正曲线 光谱测试对两性霉素的定量是有效的，其在405nm处的吸收值随两性霉素B的浓度而增长(表1)。
表1.两性霉素B的浓度与其在405nm处吸收值的关系
Table 1.The relation between the concentration of amphotericin B and the absorbance at 405nm 两性霉素B浓度
Concentration of
amphotericin B
(μg/ml)
0
, 百拇医药
1.3
2.6
5.2
10.5
21
42
405nm处吸收值
Absorbance at 405nm
0
0.051
0.077
0.124
0.189
, 百拇医药
0.304
0.540
2.2 脂质体粒径及其分布 通过离心分级技术检测表明，所制得的脂质体大部分低于50nm(表2)，两步乳化逆相蒸发技术制得了纳米级的脂质体粒子，其粒子主要分布在50～200纳米范围内。该粒径范围内的脂质体粒子对网状内皮系统组织器官有着良好的靶向性。表2.两性霉素B脂质体的粒径及其分布
Table 2.The size and distribution of liposomal amphotericin B 离心力
Centrifuge force(G)
20000
50000
150000
, 百拇医药
700000
粒径
Size(nm)
300
200
100
50
重量百分比
Weight percent(%)
-
5
20
50
, http://www.100md.com
2.3 两性霉素B的携载 通过差减法计算出的脂质体对两性霉素B的包裹率可达到80%以上。体系中的两性霉素B含量为6%。这一结果反映了以胆固醇和卵磷脂所构成的脂质体对两性霉素B有良好的亲和性，可大量包裹两性霉素B。
2.4 被包裹的两性霉素B的稳定性 与两性霉素B的光谱特征相关。通过对在1天、2天、3天、1周、2周、4周所取两性霉素B脂质体样品进行光谱测试，结果发现其光谱图形基本未发生变化。由于任何化学物质的结构对应于一特殊光谱，故光谱图形可反映两性霉素B脂质体的化学特性。脂质体包裹的两性霉素B具有较好的贮存稳定性。
3 讨论 两性霉素B脂质体缓释体系可通过二次乳化逆相蒸发技术制得。该体系具有较高的包裹效率且其性能稳定。该体系可延长两性霉素B的作用时间。脂质体两性霉素B对降低两性霉素B的生物毒性具有重要作用。
目前临床上治疗黑热病人主要采用五价锑剂如葡萄糖酸锑钠或甲基葡萄糖胺锑，不但毒副作用大，失效率也较高，近年又有对锑产生抗性病例明显增多的报导。而且五价锑治疗病犬效果不好，脂质体无毒性和无免疫原性，选择性高，靶向性强，从而能减少用药剂量，降低毒性，减少副作用。在消灭病犬难以全面实施的情况下，本实验制得的两性霉素B脂质体可用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且可能为治疗黑热病人提供动物实验依据。
, 百拇医药
4 参考文献
1 胡孝素，等.用McAb-AST及骨髓涂片法对四川省汶川县犬感染利什曼原虫的调查研究.中国人兽共患病杂志 1991；7(4)∶5-8.
2 New PPC,et al.Anti-leishmanial activity of amphotericin and other antifungal agents entrapped in liposomes.J Antimicrob Chemother 1981;8∶373-381.
3 Lopez-Berestein G,et al.Treatment and prophylaxis of disseminated infection due to Candida albicans in mice with liposome-encapsulated amphotericin B.J Infect Dis 1983;147(5)∶939-945.
4 Desiderio JV,et al.Intraphagocytic killing of Salmonella typhimurium by liposome-encapsulated cephalothin.J Infect Dis 1983;148(3)∶563-570., http://www.100md.com