日本血吸虫(中国大陆株)26kDa基因重组蛋白(rSjc26GST)对虫卵肉芽肿形成的影响
作者：蒋健敏 杨明瑾 屠乐鸣 张素娥 宋昌存
单位：浙江省医学科学院寄生虫病研究所 杭州 310013
关键词：日本血吸虫；rSjc26GST；虫卵肉芽肿
实用寄生虫病杂志990101 提要 用日本血吸虫虫卵肉芽肿的小鼠肺模型进行研究。ICR雄性小鼠32只，分成免疫组和佐剂对照组各16只，免疫组小鼠经rSjc26GST免疫。免疫结束后第5天两组小鼠均由尾静脉注射新鲜日本血吸虫虫卵悬液0.2ml(内含活卵1500-2000个)，于注卵后第8天、16天和21天分批剖杀小鼠，观察肺部形成的虫卵肉芽肿病变。结果发现免疫鼠肺内肉芽肿大小受到明显抑制，免疫后第8天、16天、21天肺肉芽肿平均直径分别为100.00±12.6μm，106.43±11.4μm，105.70±11.8μm，对照鼠在相应时间分别为141.90±23.4μm，176.67±34.9μm，199.53±21.7μm，抑制率从8天的29.5%、16天的39.8%到21天的47.0%逐渐增加，并且免疫组肺相对湿重也较佐剂对照组有所减少，证实rSjc26GST具有明确的抗肉芽肿病变效应。
, http://www.100md.com
EFFECT OF RECOMBINANT Sjc26GST ON GRANULOMATOUS
RESPONSE TO SCHISTOSOMA JAPONICUM EGG IN MICE
Jiang Jianmin, Yang Mingjin,Tu Leming,Zhang Sue, Song Changcun
Institute of Parasitic Diseases, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013
ABSTRACT
The effect of rSjc26GST on granulomatous response to Schistosoma japonicum egg has been studied in male ICR mice.Each mouse in experiment group was immunized with rSjc26GST. Five days after final immunization, the mice in both immunized and control groups were inoculated with 1500-2000 mature eggs of S.japonicum via tail vein. The mice were sacrificed at 8, 16, and 21 days respectively after injection of eggs.The results showed that the relative wet weight of lung in immunized group was lower than that in control group while the mean granuloma size reduced by 29.5%-47.0% in immunized group as compared with that in control group. It has been suggested that the rSjc26GST could induce definite anti-granuloma effect.
, 百拇医药
Key words: Schistosoma japonicum, recombinant Sjc26GST, egg granuloma
控制血吸虫病是一项长期而艰巨的工作，疫苗研究仍为当今的重点，日本血吸虫中国大陆株26kDa基因重组谷胱甘肽转移酶(rSjc26GST)是日本血吸虫病主要候选疫苗之一，已被证明免疫小鼠能诱导明显的抗虫免疫、抗生殖免疫等作用[1]。日本血吸虫虫卵肉芽肿是引起血吸虫病严重病理损害的基础，在自然感染情况下，由于成虫在宿主体内逐日产生虫卵，不断沉积在组织中，造成组织中的虫卵在成熟程度上的参差不齐，影响了对肉芽肿的研究[2]。因此，本文应用日本血吸虫小鼠肺肉芽肿模型，观察尾静脉注卵后rSjc26GST对肺内同步形成的肉芽肿的影响，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 ①rSjc26GST抗原 由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供。②实验ICR雄鼠(体重18～22g) 由浙江省动物中心提供。③新鲜虫卵悬液的制备 剖杀感染日本血吸虫尾蚴1000条45天的家兔，摘取肝脏，按本所集卵常规，获得纯净血吸虫卵，用无菌生理盐水充分洗涤制成虫卵悬液，4℃冰箱放置。
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1.2 方法 ①实验分组 32只鼠分成免疫组和佐剂对照组各16只，免疫组每鼠足垫或背部皮下多点注射rSjc26GST 50μg加等量福氏完全佐剂，14天后同样方法注射rSjc26GST 50μg加等量福氏不完全佐剂，再7天后静脉注射10μg rSjc26GST作加强免疫。对照组用生理盐水代替rSjc26GST,其余相同。两组各鼠于免疫结束后5天按Von Lichtenbery(1962)方法[3]，由尾静脉注射新鲜虫卵悬液0.2ml(约含活虫卵1500-2000个)，并于注入虫卵后的第8天、16天和21天分三批剖杀小鼠(各5，5，6只)，取出肺脏，用滤纸吸去血份，除去粘附的其它组织，经分析天平称肺湿重。②肺相对湿重的测量 以肺湿重(mg)除以小鼠体重(g)即为肺相对湿重。③鼠肺组织切片及肉芽肿大小测量 取出的肺组织放入含10%福尔马林的PBS中固定1周，制成病理标本，以7μm厚度连续切片，H.E染色后，光学显微镜检查。选择单卵肉芽肿，用目镜测微尺在同一倍数下按直角方向测量成熟虫卵及其肉芽肿周围炎症反应最大截面的两个直径(长径和横径)，取两个直径的平均值为该肉芽肿的直径。每组测15个单卵肉芽肿，取其均值为该组小鼠肺虫卵肉芽肿的平均大小。
, 百拇医药
2 结果
2.1 rSjc26GST免疫后对虫卵肉芽肿模型肺湿重的影响 注卵后第8天、16天、21天免疫组小鼠肺相对湿重均小于佐剂对照组，尤以第16天最为显著，减少率达33.1%，到第21天两组差异未见有统计学意义。(表1)
表1.rSjc26GST免疫对注卵后小鼠肺相对湿重的影响
Table 1.Influence of rSjc26GST immunization on the reduciton of relative wet weight of mouse lungs(Wet weight of lung(mg)/Body weight(g))
注卵后不同时间肺相对湿重
Relative wet weight of mouse lungs in different
, http://www.100md.com
days after inoculation of eggs(
±s)
8
16
21天(Day)
免疫组
(Immunized group)
1.97±0.07
1.78±0.08
4.58±0.15
佐剂对照组
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(Control group)
2.69±0.34
2.66±0.28
4.83±0.39
减少率
Reduction rate(%)
26.8*
33.1**
5.2***
* P<0.005 ** P<0.001 *** P>0.05
2.2 rSjc26GST免疫小鼠后对肺肉芽肿形成的影响 尾静脉注卵后第8天、16天、21天，免疫组的肺虫卵肉芽肿直径明显小于佐剂对照组，直径减少率为29.5%-47.0%(表2，图1—6)(图见封三)。浸润细胞以嗜酸粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞为主。
, 百拇医药
图①②③④⑤⑥.注卵后不同天数鼠肺肉芽肿反应(130×)
Fig.①②③④⑤⑥.Egg granuloma in the lungs of mice at different day after inoculation(130×)
①②为第8天(At 8th day)；③④为第16天(At 16th day)；⑤⑥为第21天(At 21st day)
①③⑤为对照鼠(Controt mice)；②④⑥为免疫鼠(Immunized mice)
表2.rSjc26GST免疫小鼠后肺肉芽肿直径的测量结果
Table 2.Influence of rSjc26GST immunization on the inhibition of granuloma size in lungs
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注卵后不同时间肉芽肿的直径
Mean granuloma size after inoculation(μm)(±s)
8
16
21天(Day)
免疫组
(Immunized group)
100.00±12.6
106.43±11.4
105.70±11.8
, 百拇医药
佐剂对照组
(Control group)
141.90±23.4
176.67±34.9
199.53±21.7
减少率
Reduction rate(%)
29.5
39.8*
47.0*
* P<0.001
, http://www.100md.com
3 讨论 用日本血吸虫小鼠肺虫卵肉芽肿模型，经rSjc26GST免疫后，使肺相对湿重减轻，明显抑制小鼠肺肉芽肿的形成，且随着时间的推移，抑制率逐渐提高。至于肺相对湿重于注卵后第21天两组未见明显差异，是否因为小鼠饲养时间增加，体重增加较快，导致相对湿重的差别不明显。Adel(1974)曾利用小鼠肺肉芽肿模型研究酒石酸锑钾和硝咪唑治疗药物对肉芽肿的抑制作用，发现肉芽肿反应受抑50%[4]。Olds(1981)用氢化可的松和硝咪唑治疗小鼠，显著减少肺模型肉芽肿的数量[5]。这些均为以小鼠肺肉芽肿模型研究药物的作用，而在研究疫苗的保护作用中用小鼠肺肉芽肿模型尚少见报道。由于血吸虫虫卵肉芽肿是引起血吸虫病严重病理损害的基础，本次实验证明rSjc26GST对日本血吸虫虫卵肉芽肿有29.5%-47.0%的抑制率，可以减轻对机体的病理损害，其意义说明了该疫苗具有抑制虫卵导致虫卵肉芽肿的作用，从而具有应用的前景。
对一些血吸虫病候选分子抗原在易感宿主体内诱导的保护性免疫的机制至今尚未完全阐明，因为不同的保护性抗原诱导的保护性免疫，其效应机制不同，如Sm97主要表现为T细胞依赖，细胞介导的免疫[6]；而155kDa表现为抗体介导的体液免疫，能够被动转移[7]；Sm28诱导的保护力包括体液与细胞免疫[8，9]。rSjc26GST诱导的抗感染免疫，有报导测到免疫鼠体内特异性抗rSjc26GST抗体水平明显升高[1]，而本实验rSjc26GST诱导的免疫性抑制日本血吸虫虫卵肉芽肿的机制尚有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：本工作得到浙江省自然科学基金资助。
The project received financial support from the Natural Sciences Fund of Zhejiang Province.
致谢：研究工作得到中国预防医学科学院寄生虫病研究所刘述先研究员指导帮助，特此致谢。
4 参考文献
1 Liu SX, et al. Immunization of mice with recombinant Sjc26GST induces a pronounced anti-fecundity effect after experimental infection with Chinese Schistosoma japonicum.Vaccine 1995;13(6)∶603-607.
, 百拇医药
2 赵慰先主编.人体寄生虫学.第二版.人民卫生出版社，1994：370-376.
3 Von Lichtenbery F. Host response to eggs of S. mansoni. I.Granuloma formation in the unsensitized laboratory mouse. Am J Pathol 1962;41∶711-731.
4 Adel AF, et al.Anti-inflammatory effects of tartar emetic and niridazole:suppression of schistosome egg granuloma. J Immunol 1974; 112(1)∶222-228.
5 Olds GR, et al. Kinetics and mechanisms of pulmonary granuloma formation around Schistosoma japonicum eggs infected into mice. Cellular Immunol 1981;60∶251-260.
, 百拇医药
6 Lanar, DE. Identification of paramyosin as schistosome antigen recognized by intradermally vaccined mice. Science 1986;234∶593-596.
7 Smith MA, et al. Vaccination against Schistosoma mansoni with purified surface antigens.Science 1985;227∶535-538.
8 Capron A, et al. Vaccine strategies against schistosomiasis. Mem Inst Oswaldo Cruz 1992;87(Suppl 5)∶1-9.
9 Boulanger D, et al. Immunization of mice and baboons with the recombinant Sm28GST effects both worm viability and fecundity after experimental infection with Schistosoma manosoni.Parasit Immunol 1991;13∶473-490., 百拇医药
单位：浙江省医学科学院寄生虫病研究所 杭州 310013
关键词：日本血吸虫；rSjc26GST；虫卵肉芽肿
实用寄生虫病杂志990101 提要 用日本血吸虫虫卵肉芽肿的小鼠肺模型进行研究。ICR雄性小鼠32只，分成免疫组和佐剂对照组各16只，免疫组小鼠经rSjc26GST免疫。免疫结束后第5天两组小鼠均由尾静脉注射新鲜日本血吸虫虫卵悬液0.2ml(内含活卵1500-2000个)，于注卵后第8天、16天和21天分批剖杀小鼠，观察肺部形成的虫卵肉芽肿病变。结果发现免疫鼠肺内肉芽肿大小受到明显抑制，免疫后第8天、16天、21天肺肉芽肿平均直径分别为100.00±12.6μm，106.43±11.4μm，105.70±11.8μm，对照鼠在相应时间分别为141.90±23.4μm，176.67±34.9μm，199.53±21.7μm，抑制率从8天的29.5%、16天的39.8%到21天的47.0%逐渐增加，并且免疫组肺相对湿重也较佐剂对照组有所减少，证实rSjc26GST具有明确的抗肉芽肿病变效应。
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EFFECT OF RECOMBINANT Sjc26GST ON GRANULOMATOUS
RESPONSE TO SCHISTOSOMA JAPONICUM EGG IN MICE
Jiang Jianmin, Yang Mingjin,Tu Leming,Zhang Sue, Song Changcun
Institute of Parasitic Diseases, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013
ABSTRACT
The effect of rSjc26GST on granulomatous response to Schistosoma japonicum egg has been studied in male ICR mice.Each mouse in experiment group was immunized with rSjc26GST. Five days after final immunization, the mice in both immunized and control groups were inoculated with 1500-2000 mature eggs of S.japonicum via tail vein. The mice were sacrificed at 8, 16, and 21 days respectively after injection of eggs.The results showed that the relative wet weight of lung in immunized group was lower than that in control group while the mean granuloma size reduced by 29.5%-47.0% in immunized group as compared with that in control group. It has been suggested that the rSjc26GST could induce definite anti-granuloma effect.
, 百拇医药
Key words: Schistosoma japonicum, recombinant Sjc26GST, egg granuloma
控制血吸虫病是一项长期而艰巨的工作，疫苗研究仍为当今的重点，日本血吸虫中国大陆株26kDa基因重组谷胱甘肽转移酶(rSjc26GST)是日本血吸虫病主要候选疫苗之一，已被证明免疫小鼠能诱导明显的抗虫免疫、抗生殖免疫等作用[1]。日本血吸虫虫卵肉芽肿是引起血吸虫病严重病理损害的基础，在自然感染情况下，由于成虫在宿主体内逐日产生虫卵，不断沉积在组织中，造成组织中的虫卵在成熟程度上的参差不齐，影响了对肉芽肿的研究[2]。因此，本文应用日本血吸虫小鼠肺肉芽肿模型，观察尾静脉注卵后rSjc26GST对肺内同步形成的肉芽肿的影响，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 ①rSjc26GST抗原 由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供。②实验ICR雄鼠(体重18～22g) 由浙江省动物中心提供。③新鲜虫卵悬液的制备 剖杀感染日本血吸虫尾蚴1000条45天的家兔，摘取肝脏，按本所集卵常规，获得纯净血吸虫卵，用无菌生理盐水充分洗涤制成虫卵悬液，4℃冰箱放置。
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1.2 方法 ①实验分组 32只鼠分成免疫组和佐剂对照组各16只，免疫组每鼠足垫或背部皮下多点注射rSjc26GST 50μg加等量福氏完全佐剂，14天后同样方法注射rSjc26GST 50μg加等量福氏不完全佐剂，再7天后静脉注射10μg rSjc26GST作加强免疫。对照组用生理盐水代替rSjc26GST,其余相同。两组各鼠于免疫结束后5天按Von Lichtenbery(1962)方法[3]，由尾静脉注射新鲜虫卵悬液0.2ml(约含活虫卵1500-2000个)，并于注入虫卵后的第8天、16天和21天分三批剖杀小鼠(各5，5，6只)，取出肺脏，用滤纸吸去血份，除去粘附的其它组织，经分析天平称肺湿重。②肺相对湿重的测量 以肺湿重(mg)除以小鼠体重(g)即为肺相对湿重。③鼠肺组织切片及肉芽肿大小测量 取出的肺组织放入含10%福尔马林的PBS中固定1周，制成病理标本，以7μm厚度连续切片，H.E染色后，光学显微镜检查。选择单卵肉芽肿，用目镜测微尺在同一倍数下按直角方向测量成熟虫卵及其肉芽肿周围炎症反应最大截面的两个直径(长径和横径)，取两个直径的平均值为该肉芽肿的直径。每组测15个单卵肉芽肿，取其均值为该组小鼠肺虫卵肉芽肿的平均大小。
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2 结果
2.1 rSjc26GST免疫后对虫卵肉芽肿模型肺湿重的影响 注卵后第8天、16天、21天免疫组小鼠肺相对湿重均小于佐剂对照组，尤以第16天最为显著，减少率达33.1%，到第21天两组差异未见有统计学意义。(表1)
表1.rSjc26GST免疫对注卵后小鼠肺相对湿重的影响
Table 1.Influence of rSjc26GST immunization on the reduciton of relative wet weight of mouse lungs(Wet weight of lung(mg)/Body weight(g))
注卵后不同时间肺相对湿重
Relative wet weight of mouse lungs in different
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days after inoculation of eggs(
±s)8
16
21天(Day)
免疫组
(Immunized group)
1.97±0.07
1.78±0.08
4.58±0.15
佐剂对照组
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(Control group)
2.69±0.34
2.66±0.28
4.83±0.39
减少率
Reduction rate(%)
26.8*
33.1**
5.2***
* P<0.005 ** P<0.001 *** P>0.05
2.2 rSjc26GST免疫小鼠后对肺肉芽肿形成的影响 尾静脉注卵后第8天、16天、21天，免疫组的肺虫卵肉芽肿直径明显小于佐剂对照组，直径减少率为29.5%-47.0%(表2，图1—6)(图见封三)。浸润细胞以嗜酸粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞为主。
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图①②③④⑤⑥.注卵后不同天数鼠肺肉芽肿反应(130×)
Fig.①②③④⑤⑥.Egg granuloma in the lungs of mice at different day after inoculation(130×)
①②为第8天(At 8th day)；③④为第16天(At 16th day)；⑤⑥为第21天(At 21st day)
①③⑤为对照鼠(Controt mice)；②④⑥为免疫鼠(Immunized mice)
表2.rSjc26GST免疫小鼠后肺肉芽肿直径的测量结果
Table 2.Influence of rSjc26GST immunization on the inhibition of granuloma size in lungs
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注卵后不同时间肉芽肿的直径
Mean granuloma size after inoculation(μm)(
±s)8
16
21天(Day)
免疫组
(Immunized group)
100.00±12.6
106.43±11.4
105.70±11.8
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佐剂对照组
(Control group)
141.90±23.4
176.67±34.9
199.53±21.7
减少率
Reduction rate(%)
29.5
39.8*
47.0*
* P<0.001
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3 讨论 用日本血吸虫小鼠肺虫卵肉芽肿模型，经rSjc26GST免疫后，使肺相对湿重减轻，明显抑制小鼠肺肉芽肿的形成，且随着时间的推移，抑制率逐渐提高。至于肺相对湿重于注卵后第21天两组未见明显差异，是否因为小鼠饲养时间增加，体重增加较快，导致相对湿重的差别不明显。Adel(1974)曾利用小鼠肺肉芽肿模型研究酒石酸锑钾和硝咪唑治疗药物对肉芽肿的抑制作用，发现肉芽肿反应受抑50%[4]。Olds(1981)用氢化可的松和硝咪唑治疗小鼠，显著减少肺模型肉芽肿的数量[5]。这些均为以小鼠肺肉芽肿模型研究药物的作用，而在研究疫苗的保护作用中用小鼠肺肉芽肿模型尚少见报道。由于血吸虫虫卵肉芽肿是引起血吸虫病严重病理损害的基础，本次实验证明rSjc26GST对日本血吸虫虫卵肉芽肿有29.5%-47.0%的抑制率，可以减轻对机体的病理损害，其意义说明了该疫苗具有抑制虫卵导致虫卵肉芽肿的作用，从而具有应用的前景。
对一些血吸虫病候选分子抗原在易感宿主体内诱导的保护性免疫的机制至今尚未完全阐明，因为不同的保护性抗原诱导的保护性免疫，其效应机制不同，如Sm97主要表现为T细胞依赖，细胞介导的免疫[6]；而155kDa表现为抗体介导的体液免疫，能够被动转移[7]；Sm28诱导的保护力包括体液与细胞免疫[8，9]。rSjc26GST诱导的抗感染免疫，有报导测到免疫鼠体内特异性抗rSjc26GST抗体水平明显升高[1]，而本实验rSjc26GST诱导的免疫性抑制日本血吸虫虫卵肉芽肿的机制尚有待进一步研究。
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基金项目：本工作得到浙江省自然科学基金资助。
The project received financial support from the Natural Sciences Fund of Zhejiang Province.
致谢：研究工作得到中国预防医学科学院寄生虫病研究所刘述先研究员指导帮助，特此致谢。
4 参考文献
1 Liu SX, et al. Immunization of mice with recombinant Sjc26GST induces a pronounced anti-fecundity effect after experimental infection with Chinese Schistosoma japonicum.Vaccine 1995;13(6)∶603-607.
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2 赵慰先主编.人体寄生虫学.第二版.人民卫生出版社，1994：370-376.
3 Von Lichtenbery F. Host response to eggs of S. mansoni. I.Granuloma formation in the unsensitized laboratory mouse. Am J Pathol 1962;41∶711-731.
4 Adel AF, et al.Anti-inflammatory effects of tartar emetic and niridazole:suppression of schistosome egg granuloma. J Immunol 1974; 112(1)∶222-228.
5 Olds GR, et al. Kinetics and mechanisms of pulmonary granuloma formation around Schistosoma japonicum eggs infected into mice. Cellular Immunol 1981;60∶251-260.
, 百拇医药
6 Lanar, DE. Identification of paramyosin as schistosome antigen recognized by intradermally vaccined mice. Science 1986;234∶593-596.
7 Smith MA, et al. Vaccination against Schistosoma mansoni with purified surface antigens.Science 1985;227∶535-538.
8 Capron A, et al. Vaccine strategies against schistosomiasis. Mem Inst Oswaldo Cruz 1992;87(Suppl 5)∶1-9.
9 Boulanger D, et al. Immunization of mice and baboons with the recombinant Sm28GST effects both worm viability and fecundity after experimental infection with Schistosoma manosoni.Parasit Immunol 1991;13∶473-490., 百拇医药