猪囊尾蚴谷胱甘肽S-转移酶活性研究
作者：方强 闵宏林 夏惠 胡守锋 孙新
单位：方强(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)；闵宏林(蚌埠医学院微生物学教研室)；夏惠(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)；胡守锋(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)；孙新(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)
关键词：猪囊尾蚴；GST；活性检测
实用寄生虫病杂志000104 摘要 目的：探讨猪囊尾蚴头节及囊壁GST活性。方法：用GST底物催化测定法检测成熟、未成熟猪囊尾蚴头节及囊壁匀浆的GST活性。结果：成熟猪囊尾蚴头节、囊壁GST活性分别为0.226 5±0.028 1、0.176 5±0.019 9，未成熟猪囊尾蚴头节、囊壁GST活性分别为0.176 6±0.022 3、0.175 8±0.021 4，成熟猪囊尾蚴头节与囊壁之间、未成熟猪囊尾蚴头节与囊壁之间、成熟与未成熟猪囊尾蚴之间GST活性均无显著性差异(P>0.05)。结论：猪囊尾蚴头节及囊壁内存在相同的GST活性，且GST活性与猪囊尾蚴的成熟程度无关。
, 百拇医药
中图分类号：R383.3+4 文献标识码：A
文章编号：1005-2534(2000)01-0012-03
ACTIVITY OF GLUTATHIONE S-TRANSFERASE (GST)
IN SCOLEX AND CYST WALL OF CYSTICERCUS CELLULOSAE
Fang Qiang
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
Min Honglin
(Department of Microoganism, Bengbu Medical College)
, 百拇医药
Xia Hui
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
Hu Soufen
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
Sun Xin
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
ABSTRACT Aim: To detect the activity of GST in scolex and cyst wall of mature and unmature Cysticercus cellulosae. Method: The activity of GST in the tissues was detected by substract catalysis method. Results: The activity of GST in scolex and cyst wall of mature worm was (0.226 5±0.028 1) active unit/mg and (0.176 5±0.019 9)active unit/mg while in unmature worm (0.176 6±0.022 3)active unit/mg and (0.175 8±0.021 4)active unit/mg. There were no significant differences among various groups (P>0.05). Conclusion: The activity of GST in scolex and cyst wall of mature or unmature Cysticercus cellulosae revealed same activity.
, http://www.100md.com
Key words：Cysticercus cellulosae; glutathione S-transferase(GST)
谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase,GST)广泛存在于从单细胞原生动物到脊椎动物的多种生物体内，对机体具有重要的解毒与保护作用。迄今为止，在所有研究过的蠕虫中均证明有GST活性存在，但对链状带绦虫及猪囊尾蚴GST存在与否尚未见报道。本室孙新等近期以猪囊尾蚴囊液为样本检测GST活性，结果证明猪囊尾蚴囊液中的GST活性存在(另文待发表)。本研究试以GST底物催化测定法检测猪囊尾蚴头节及囊壁匀浆中的GST活性，以进一步证明猪囊尾蚴中有GST活性存在，并进行初步组织定位。初步结果报道如下：
1 材料与方法
1.1 猪囊尾蚴
1.1.1 取材 感染猪囊尾蚴的横纹肌取自肉联厂检验部门检出的“米猪肉”，分别选择成熟的囊液充盈的猪囊尾蚴和未成熟猪囊尾蚴自横纹肌内锐性分离，分置于不同的无菌容器，经无菌生理盐水洗涤三次后，锐性分离成熟猪囊尾蚴头节、囊壁；未成熟猪囊尾蚴头节、囊壁，经生理盐水洗涤后分别置无菌离心管-20℃备用。
, 百拇医药
1.1.2 样本处理 将成熟猪囊尾蚴头节、囊壁，未成熟猪囊尾蚴头节、囊壁分别剪碎，以玻璃匀浆管充分碾磨后以超声粉碎机粉碎(冰上操作)，将各组织匀浆以3 000r/min离心15分钟，取上清待检。
1.2 GST检测试剂盒 南京建成生物工程研究所提供，以GST底物1-氯，2，4-二硝基苯(CDNB)酶促反应后浓度变化间接测样本中GST活性。
1.3 测各组织匀浆上清蛋白含量 以双缩脲法测各组织匀浆上清蛋白含量。
1.4 测各组织匀浆上清GST活性 按建成所GST检测试剂盒提供说明进行，酶促反应37℃5分钟，反应终止后以721分光光度计于412nm波长处比色读取吸光值，与对照管比较，按试剂说明书提供的公式计算GST活性。公式如下
每毫克蛋白质GST活力单位=
, 百拇医药
1.5 统计学方法
采用t检验。
2 结果
2.1 底物标准的稀释测定
CDNB预配制的贮存液以蒸馏水分别稀释到0mmol/L，20mmol/L，40mmol/L，60mmol/L，80mmol/L，100mmol/L；比色测定显示在0～100mmol/L浓度范围内，其吸光值呈线性关系。并计算出A值为168.85[A=标准GST浓度(mmol/L)/标准GST光密度(OD)]。
2.2 猪囊尾蚴GST活性测定 每批测定GST活性均取头节20个，囊壁20个，共分三批测定。根据酶促管与对照管吸光值及各样本匀浆的蛋白含量，测得其GST活性，结果表明成熟猪囊尾蚴头节与囊壁间GST活性无显著差异(P>0.05)，未成熟猪囊尾蚴头节与囊壁间GST活性亦无显著差异，且成熟猪囊尾蚴头节未成熟猪囊尾蚴头节之间、成熟猪囊尾蚴囊壁与未成熟猪囊尾蚴囊壁之间GST活性也无显著差异(P>0.05)。(见附表)
, http://www.100md.com
附表 不同成熟程度猪囊尾蚴头节囊壁中GST活性比较
次数
头节
(活性单位/mg)
囊壁
(活性单位/mg)
t
P
成熟猪囊尾蚴
3
0.226 5±0.028 1
0.176 5±0.019 9
, http://www.100md.com
2.559 3
>0.05
未成熟猪囊尾蚴
3
0.176 6±0.022 3
0.175 8±0.021 4
0.048 8
>0.05
t
—
2.414 6
0.042 4
, http://www.100md.com
—
—
P
—
>0.05
>0.05
—
—
3 讨论
GST是一种广泛存在于单细胞原生动物到脊椎动物等多种动物体内的活性酶，具有多种生物学功能。迄今为止的研究表明，GST在已经进行活性分析的所有蠕虫成虫均有表达，可以膜结合蛋白的形式或可溶性形式存在。在绦虫纲，已确知莫氏扩张绦虫，缩小膜壳绦虫和细粒棘球绦虫等均有显著GST活性[1]。迄今对链状带绦虫尚无GST研究的报告，仅本室近期发现在猪囊尾蚴囊液中有GST活性存在。
, http://www.100md.com
本研究系以成熟的及未成熟的猪囊尾蚴头节、囊壁的组织匀浆为待测样本，结果发现各组织匀浆均有GST活性，且各组织GST活性无显著性差异(P>0.05)。此结果表明GST广泛存在于猪囊尾蚴头节、囊壁中，且分布较均匀。本研究还发现猪囊尾蚴头节、囊壁的GST活性与猪囊尾蚴的发育成熟程度无关。此结果可进一步通过组织切片酶化学方法加以证实。
据认为蠕虫GST可能具有多种功能，如一般毒物的解毒作用，配基转移功能，并具有结合宿主所产生的自由基的作用。因此，从认识致病机理的角度出发，证明链状带绦虫尤其是猪囊尾蚴GST活性存在并明确其组织分布(各组织内活性基本一致)，且证明成熟的猪囊尾蚴与未成熟的猪囊尾蚴组织内的GST活性相同，对认识寄生虫与宿主的相互关系有重要意义。另外，在肝片吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫等虫种，GST作为保护性抗原已在动物实验中表现出有意义的保护作用[2～4]，如应用重组日本血吸虫大陆株26kDa GST抗原免疫水牛，经攻击感染后减虫率为22.3%，减卵率为47.9%[5]。至于猪囊尾蚴GST是否可以作为保护性抗原尚有待于进一步研究。除此之外，相关研究提示在某些虫中GST可作为药物治疗的效应分子及潜在的诊断抗原[6，7]。因而证明猪囊尾蚴体内GST的存在及其组织分布，以及成熟猪囊尾蚴和未成熟猪囊尾蚴体内GST活性相同，可在此基础上进一步制备抗GST单克隆抗体，从而可能制备检测GST抗原的囊虫检测试剂盒，以改进猪囊虫病的免疫学诊断方法，尤其是循环抗原的检测方法；同时，对筛选潜在的保护性抗原及可能的化疗靶分子，以进一步进行猪囊尾蚴疫苗的研制及以GST为靶分子的化疗药物的开发具有积极的意义。
, 百拇医药
基金项目：安徽省教委资助课题
参考文献
1，Brophy PM，Barrett J.Blocking factors and the purification of glutathione transferases from Hymenolepis diminuta〔J〕.Parasitology,1990;100(Pt 1)∶137
2，Brophy PM,Crowley P,Barrett J.Detoxification reactions of Fasciola hepatica glutathione transferases〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1990;39(2)∶155
3，Oleary KA，Tracy JW.Purification of three cytosolic glutathione S-transferases from Schistosoma mansoni〔J〕.Arch Biochem Biophysics,1988;264(1)∶1
, 百拇医药
4，刘述先，宋光承，丁丽韵，等.日本血吸虫大陆株GST抗原〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1992；10(4)∶311
5，Liu SX,He YK,Song GC,et al.Anti-fecundity immunity to Schistosoma japonicum induced in Chinese water buffaloes(Bos buffelus) after vaccination with recombinant 26kD glutathione-S-transferase(reSjc26GST)〔J〕.Veter Parasitol,1997;69(1)∶39
6，Brophy PM，Pritchard DI.Parasitic helminth glutathione S-transferases:An update on their potential as targets ior immuno and chemotherapy〔J〕.Exp Parasitol,1994;79(1)∶89
7，Nare B,Smith JM,Prichard RK.Oltripraz induced decrease in activity of cytosolic glutathione transferase in Schistosoma mansoni〔J〕.Inter J Parasitol,1991;21(8)∶919, 百拇医药
单位：方强(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)；闵宏林(蚌埠医学院微生物学教研室)；夏惠(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)；胡守锋(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)；孙新(蚌埠医学院寄生虫学教研室，蚌埠 233003)
关键词：猪囊尾蚴；GST；活性检测
实用寄生虫病杂志000104 摘要 目的：探讨猪囊尾蚴头节及囊壁GST活性。方法：用GST底物催化测定法检测成熟、未成熟猪囊尾蚴头节及囊壁匀浆的GST活性。结果：成熟猪囊尾蚴头节、囊壁GST活性分别为0.226 5±0.028 1、0.176 5±0.019 9，未成熟猪囊尾蚴头节、囊壁GST活性分别为0.176 6±0.022 3、0.175 8±0.021 4，成熟猪囊尾蚴头节与囊壁之间、未成熟猪囊尾蚴头节与囊壁之间、成熟与未成熟猪囊尾蚴之间GST活性均无显著性差异(P>0.05)。结论：猪囊尾蚴头节及囊壁内存在相同的GST活性，且GST活性与猪囊尾蚴的成熟程度无关。
, 百拇医药
中图分类号：R383.3+4 文献标识码：A
文章编号：1005-2534(2000)01-0012-03
ACTIVITY OF GLUTATHIONE S-TRANSFERASE (GST)
IN SCOLEX AND CYST WALL OF CYSTICERCUS CELLULOSAE
Fang Qiang
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
Min Honglin
(Department of Microoganism, Bengbu Medical College)
, 百拇医药
Xia Hui
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
Hu Soufen
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
Sun Xin
(Department of Parasitology, Bengbu Medical College, Bengbu 233003)
ABSTRACT Aim: To detect the activity of GST in scolex and cyst wall of mature and unmature Cysticercus cellulosae. Method: The activity of GST in the tissues was detected by substract catalysis method. Results: The activity of GST in scolex and cyst wall of mature worm was (0.226 5±0.028 1) active unit/mg and (0.176 5±0.019 9)active unit/mg while in unmature worm (0.176 6±0.022 3)active unit/mg and (0.175 8±0.021 4)active unit/mg. There were no significant differences among various groups (P>0.05). Conclusion: The activity of GST in scolex and cyst wall of mature or unmature Cysticercus cellulosae revealed same activity.
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Key words：Cysticercus cellulosae; glutathione S-transferase(GST)
谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase,GST)广泛存在于从单细胞原生动物到脊椎动物的多种生物体内，对机体具有重要的解毒与保护作用。迄今为止，在所有研究过的蠕虫中均证明有GST活性存在，但对链状带绦虫及猪囊尾蚴GST存在与否尚未见报道。本室孙新等近期以猪囊尾蚴囊液为样本检测GST活性，结果证明猪囊尾蚴囊液中的GST活性存在(另文待发表)。本研究试以GST底物催化测定法检测猪囊尾蚴头节及囊壁匀浆中的GST活性，以进一步证明猪囊尾蚴中有GST活性存在，并进行初步组织定位。初步结果报道如下：
1 材料与方法
1.1 猪囊尾蚴
1.1.1 取材 感染猪囊尾蚴的横纹肌取自肉联厂检验部门检出的“米猪肉”，分别选择成熟的囊液充盈的猪囊尾蚴和未成熟猪囊尾蚴自横纹肌内锐性分离，分置于不同的无菌容器，经无菌生理盐水洗涤三次后，锐性分离成熟猪囊尾蚴头节、囊壁；未成熟猪囊尾蚴头节、囊壁，经生理盐水洗涤后分别置无菌离心管-20℃备用。
, 百拇医药
1.1.2 样本处理 将成熟猪囊尾蚴头节、囊壁，未成熟猪囊尾蚴头节、囊壁分别剪碎，以玻璃匀浆管充分碾磨后以超声粉碎机粉碎(冰上操作)，将各组织匀浆以3 000r/min离心15分钟，取上清待检。
1.2 GST检测试剂盒 南京建成生物工程研究所提供，以GST底物1-氯，2，4-二硝基苯(CDNB)酶促反应后浓度变化间接测样本中GST活性。
1.3 测各组织匀浆上清蛋白含量 以双缩脲法测各组织匀浆上清蛋白含量。
1.4 测各组织匀浆上清GST活性 按建成所GST检测试剂盒提供说明进行，酶促反应37℃5分钟，反应终止后以721分光光度计于412nm波长处比色读取吸光值，与对照管比较，按试剂说明书提供的公式计算GST活性。公式如下
每毫克蛋白质GST活力单位=
, 百拇医药
1.5 统计学方法
采用t检验。
2 结果
2.1 底物标准的稀释测定
CDNB预配制的贮存液以蒸馏水分别稀释到0mmol/L，20mmol/L，40mmol/L，60mmol/L，80mmol/L，100mmol/L；比色测定显示在0～100mmol/L浓度范围内，其吸光值呈线性关系。并计算出A值为168.85[A=标准GST浓度(mmol/L)/标准GST光密度(OD)]。
2.2 猪囊尾蚴GST活性测定 每批测定GST活性均取头节20个，囊壁20个，共分三批测定。根据酶促管与对照管吸光值及各样本匀浆的蛋白含量，测得其GST活性，结果表明成熟猪囊尾蚴头节与囊壁间GST活性无显著差异(P>0.05)，未成熟猪囊尾蚴头节与囊壁间GST活性亦无显著差异，且成熟猪囊尾蚴头节未成熟猪囊尾蚴头节之间、成熟猪囊尾蚴囊壁与未成熟猪囊尾蚴囊壁之间GST活性也无显著差异(P>0.05)。(见附表)
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附表 不同成熟程度猪囊尾蚴头节囊壁中GST活性比较
次数
头节
(活性单位/mg)
囊壁
(活性单位/mg)
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成熟猪囊尾蚴
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0.226 5±0.028 1
0.176 5±0.019 9
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2.559 3
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未成熟猪囊尾蚴
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3 讨论
GST是一种广泛存在于单细胞原生动物到脊椎动物等多种动物体内的活性酶，具有多种生物学功能。迄今为止的研究表明，GST在已经进行活性分析的所有蠕虫成虫均有表达，可以膜结合蛋白的形式或可溶性形式存在。在绦虫纲，已确知莫氏扩张绦虫，缩小膜壳绦虫和细粒棘球绦虫等均有显著GST活性[1]。迄今对链状带绦虫尚无GST研究的报告，仅本室近期发现在猪囊尾蚴囊液中有GST活性存在。
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本研究系以成熟的及未成熟的猪囊尾蚴头节、囊壁的组织匀浆为待测样本，结果发现各组织匀浆均有GST活性，且各组织GST活性无显著性差异(P>0.05)。此结果表明GST广泛存在于猪囊尾蚴头节、囊壁中，且分布较均匀。本研究还发现猪囊尾蚴头节、囊壁的GST活性与猪囊尾蚴的发育成熟程度无关。此结果可进一步通过组织切片酶化学方法加以证实。
据认为蠕虫GST可能具有多种功能，如一般毒物的解毒作用，配基转移功能，并具有结合宿主所产生的自由基的作用。因此，从认识致病机理的角度出发，证明链状带绦虫尤其是猪囊尾蚴GST活性存在并明确其组织分布(各组织内活性基本一致)，且证明成熟的猪囊尾蚴与未成熟的猪囊尾蚴组织内的GST活性相同，对认识寄生虫与宿主的相互关系有重要意义。另外，在肝片吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫等虫种，GST作为保护性抗原已在动物实验中表现出有意义的保护作用[2～4]，如应用重组日本血吸虫大陆株26kDa GST抗原免疫水牛，经攻击感染后减虫率为22.3%，减卵率为47.9%[5]。至于猪囊尾蚴GST是否可以作为保护性抗原尚有待于进一步研究。除此之外，相关研究提示在某些虫中GST可作为药物治疗的效应分子及潜在的诊断抗原[6，7]。因而证明猪囊尾蚴体内GST的存在及其组织分布，以及成熟猪囊尾蚴和未成熟猪囊尾蚴体内GST活性相同，可在此基础上进一步制备抗GST单克隆抗体，从而可能制备检测GST抗原的囊虫检测试剂盒，以改进猪囊虫病的免疫学诊断方法，尤其是循环抗原的检测方法；同时，对筛选潜在的保护性抗原及可能的化疗靶分子，以进一步进行猪囊尾蚴疫苗的研制及以GST为靶分子的化疗药物的开发具有积极的意义。
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基金项目：安徽省教委资助课题
参考文献
1，Brophy PM，Barrett J.Blocking factors and the purification of glutathione transferases from Hymenolepis diminuta〔J〕.Parasitology,1990;100(Pt 1)∶137
2，Brophy PM,Crowley P,Barrett J.Detoxification reactions of Fasciola hepatica glutathione transferases〔J〕.Mol Biochem Parasitol,1990;39(2)∶155
3，Oleary KA，Tracy JW.Purification of three cytosolic glutathione S-transferases from Schistosoma mansoni〔J〕.Arch Biochem Biophysics,1988;264(1)∶1
, 百拇医药
4，刘述先，宋光承，丁丽韵，等.日本血吸虫大陆株GST抗原〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1992；10(4)∶311
5，Liu SX,He YK,Song GC,et al.Anti-fecundity immunity to Schistosoma japonicum induced in Chinese water buffaloes(Bos buffelus) after vaccination with recombinant 26kD glutathione-S-transferase(reSjc26GST)〔J〕.Veter Parasitol,1997;69(1)∶39
6，Brophy PM，Pritchard DI.Parasitic helminth glutathione S-transferases:An update on their potential as targets ior immuno and chemotherapy〔J〕.Exp Parasitol,1994;79(1)∶89
7，Nare B,Smith JM,Prichard RK.Oltripraz induced decrease in activity of cytosolic glutathione transferase in Schistosoma mansoni〔J〕.Inter J Parasitol,1991;21(8)∶919, 百拇医药