家蝇二氯苯醚菊酯抗性株分化的研究
作者：董言德 朱礼华 赵彤言 于虹 陆宝麟
单位：董言德(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；朱礼华(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；赵彤言(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；于虹(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；陆宝麟(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)
关键词：家蝇；二氯苯醚菊酯；抗性株；DNA；RAPD
寄生虫与医学昆虫学报000108摘要 本研究采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术，探索了家蝇二氯苯醚菊酯抗性株(2 000倍)在DNA分子水平上的分化。实验数据采用两种分析方法：1)用RAPDPLOT计算出个体间的遗传距离，进一步用PHYLIP软件包的NEIGHBOR程序进行UPGMA(非加权对组算术平均值聚类)聚类分析；2)经bootstrip方法随机取样100次，然后再进行UPGMA分析，在PHYLIP软件包的CONSENSE中形成合意树。两种分析方法结果极为类似，在聚类树中首先是抗性与非抗性个体分成两群，然后雌、雄个体分成两群，说明抗性株在DNA分子水平上已有明显的分化。OPD-02引物在全部抗性株个体中扩增出了非抗性株所没有的特异性同一片段(100bp左右)，提示此片段有可能作为家蝇二氯苯醚菊酯抗性株的分子标记，但需进一步研究确定。
, 百拇医药
STUDIES ON THE DIFFERENTIATION OF
PERMETHRIN-RESISTANT STRAIN OF MUSCA DOMESTICA
Dong Yande
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Zhu Lihua
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Zhao Tongyan
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
, 百拇医药
Yu Hong
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Lu Baolin
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Abstract This paper presented the results of differentiation of permethrin-resistant strain of Musca domestica based on RAPD (random amplified polymorphic DNA).The data of RAPD were analyzed in two ways:UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) cluster analysis and consensus analysis after bootstrip sampling.A significant differentiation was found existence between resistant and susceptive strain of Musca domestica.A peculiar amplified DNA fragment (100 bp) was drawn out in resistant strain (OPD-02 Primer).
, http://www.100md.com
Key words Musca domestica Permethrin Resistant strain DNA RAPD
随着化学杀虫剂的大量使用，昆虫抗药性产生的速度越来越快，抗性水平不断提高，目前已成为害虫有效防治的主要障碍。因此，研究昆虫抗药性产生及寻找与抗性有关的分子标记显得极为重要。随机扩增多态DNA(RAPD)是90年代在聚合酶链反应(PCR)的基础上发展起来的一项用于分析DAN分子多态性的技术(Williams et al.，1990；Welsh et al.，1990)，其优点在于方法简捷、需材量少、灵敏度高，已广泛地应用于动植物品种(Black Ⅳ et al.，1992)和品系的鉴定(Shuichi,F. et al.，1992)、遗传关系的确定(Halward,T. et al.，1992)等。本研究采用RAPD技术，研究了二氯苯醚菊酯(Permethrin)抗性株家蝇(Musca domestica)在DNA分子水平上的分化，以探索家蝇对二氯苯醚菊酯抗药性的产生和抗性种群遗传结构的变化。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验昆虫 家蝇敏感株和二氯苯醚菊酯抗性株(点滴法测定LD50，抗性水平达2 000倍)均由本所实验室培育。
1.2 方法
1.2.1 单只家蝇DNA提取 取敏感株和二氯苯醚菊酯抗性株家蝇，切去腹部，置入300μL DNA提取裂解液(10mmol/L Tris-HCl,PH 8.0，50mmol/L NaCl,50mmol/L EDTA,1%SDS,0.15mmol/L精胺，0.5mmol/L亚精胺)中匀浆，加蛋白酶K(40mg/mL)2.5μL，50℃水浴过夜，加等体积的水饱和重蒸酚(pH8.0)，轻轻摇动后4℃6 300r/min离心10min，取上清加等体积氯仿异戊醇(24：1)，离心10min取上清，加2倍体积的无水乙醇和0.2倍体积的10mol/L乙酸胺，4℃冰箱放置3h,6 300r/min离心10min，弃上清，加75%乙醇0.5mL洗涤，再离心5min，弃上清，自然干燥后加入0.5mL纯水，置4℃冰箱备用。
, 百拇医药
1.2.2 PCR反应过程 反应总体积为25μL。反应液含10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2,0.01%的明胶，0.1mmol/L dATP、dCTP、dGTP和dTTP，15ng引物，7.5μL模板DNA，混匀后95℃预变性10min，迅速冷却，加1个单位的Taq酶，然后用1～2滴石蜡油封盖。扩增程序为94℃变性1min，72℃延伸2min,36℃退火1min，共45个循环，最后72℃延伸10min。引物：4种随机引物及序列为OPG-19：GTCAGGGCAA、OPD-02：GGACCCAACC、OPD-O3：GTCGDDGTCA、OPD-11：AGCGCCATTG。
1.2.3 电泳 扩增产物经1.4%的琼脂糖凝胶电泳(含0.05%的溴化乙锭)后，紫外透射仪上照相。
1.2.4 数据处理 将电泳照片上15只个体清晰可见的扩增片段统计出来，某一个体在某一位置上出现扩增带时为1，不存在时为0。实验结果用两种统计方法处理：1)用RAPDPLOT程序计算两个个体间的遗传距离，公式为M=NAB/NT(Apostol et al.,1993),NT为本试验所有个体的全部扩增片段，NAB是A和B 两个个体同时存在和不存在扩增片段的总数，1-M即为两个个体的相对遗传距离。将计算出的数据调入PHYLIP软件包(Felsenstein,1993)的NEIGHBOR程序中，应用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic analysis)进行聚类分析，并绘出聚类图；2)利用RAPD程序中的RAPDBOOT程序进行重取样分析(bootstrip,100次)，然后计算遗传距离M=NAB/NT，在PHYLIP中的NEIGHBOR进行UPGMA分析，得到100个聚类图，通过PHYLIP软件包CONSENS程序进行严格合意分析，产生合意聚类图。
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2 结果
对15只家蝇个体进行研究，发现每只个体间扩增的片段多少、大小均有差别，4种随机引物共扩增出47个随机DNA片段，分子量在100bp～4 000bp之间。从电泳结果(图1)可以看出，不仅抗性株与非抗性株之间扩增的DNA片段有差别，敏感株或抗性株内个体之间也不尽相同。特别是OPD-02引物，在抗性株雌雄8只个体中，均扩增出敏感株所没有的1个特异性片段(100bp左右)，个体间的相对遗传分化距离见表1。
OPG-19 OPD-11
, 百拇医药
OPD-03 OPD-02
图1 家蝇抗性与非抗性株个体RAPD扩增产物的电泳图
Fig.1 The electrophoretogram of RAPD of susceptive strain
and resistant strain of Musca domestica
1：λDNAEcorl+HindⅢ 2～5：r-b1～r-b4 6～9:s-b1～s-b4
10～13:r-al～r-a4 14～16:s-al～s-a3
表1 家蝇15只个体相对遗传分化距离(1-M)
Table 1 The differential distance of individuals of Musca domestica(1-M) 个体
, 百拇医药
indivi-
dual
s-a1
s-a2
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0.255
0.383
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0.000
注：s代表敏感株；r代表抗性株；a代表雌性个体；b代表雄性个体(下同)
Note:s:susceptive strain;r:resistant strain;a:female:b:male
, 百拇医药
家蝇二氯苯醚菊酯抗性株和敏感株RAPD的聚类结果见图2，从中可以更直观的看出个体间的亲缘关系，15只个体首先分成抗性和非抗性两类，然后在各类中雌、雄蝇又分别聚为两类，说明抗性与非抗性株在DNA分子水平上已有明显的分化。
图2 二氯苯醚菊酯抗性株与敏感株家蝇的UPGMA图
Fig.2 The dendrogram of susceptive strain and Permethrin-Resistant strain of
Musca domestica (UPGMA)
经bootstrip分析形成的合意树见图3，与UPGMA分析的聚类结果极为相似，仅抗性株雄性个体的亲缘关系略有差别。BlackIV(1996)认为，bootstrip分析得到的BP值(见图3合意树中交点处)大于90时，两个群体的遗传差异在统计学上具有显著性。在本实验100次随机取样的统计结果中，bootstrip分析的BP值为88，说明两个群体在遗传学上已有较高水平的分化。
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图3 家蝇抗性和非抗性株经bootstrip分析的合意聚类
Fig.3 The bootstrip analysis on Permethrin-Resistant strain and susceptive strain
of Musca domestica.The numbers are BP values
3 讨论
3.1 昆虫抗药性的产生是杀虫剂选择的结果，随着杀虫剂用量的增大，选择压力不断提高，种群内与抗性有关的基因频率越来越高，表现为昆虫的抗药性水平不断提高。本实验应用RAPD技术，在DAN分子水平上将抗性与非抗性株分成两个群体，说明这两株家蝇的基因库已有明显的不同。
3.2 在引物使用数量上，作者随机选取3个引物的扩增结果做相同的统计处理，与4个引物的聚类结果极为相似，说明本试验中4个引物的扩增结果已经能够较准确的反映抗性与非抗性株之间的差别。这与扩增片段较多(11～12个/引物)及抗性株的分化水平较高有关。由于RAPD方法简单易行，需要的DNA量极少，若运用多个引物对实验对象的整个基因组进行大规模分析，两个基因组之间的微小差别也可以分析出来，因此，抗性株较低水平的遗传分化也可以用PAPD方法检测出来。
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3.3 本实验中OPD-02引物在抗性株所有个体中扩增出了敏感株所没有的特异性同一片段，提示此片段有可能作为家蝇二氯苯醚菊酯抗性株的分子标记，但需进一步研究确定。
国家自然科学基金课题，批准号：39470643
参考文献
1，Apostol,B.L.,W.C.Black IV,B.R.Miller et al.1993 Estimation of the number of full sibling families at an oviposition site using RAPD-PCR markers:application to the mosquito Aedes aegypti.Theor.Appl.Gen.86:991～1000.
2，Black,W.C.IV,N.M.Duteau,G.J.Puterka et al.1992 Use of the random amplified polymorphic DNA polymerase chair reaction (RAPD-PCR) to detect DNA polymorphisms in aphids.Bull.Entomol.Res.82:151～159.
, 百拇医药
3，Black,W.C.IV 1996 RAPD Software.University of Colorado.
4，Felsenstein,J.1993 PHYLIP(Phylogeny Inference Package).Version 3.5c.University of Washington.Seattle.
5，Halward,T.,T.Stalker，E.Larue et al.1992 Use of sing-primer DNA amplification in genetic studies of peanut(Arachis hypogaea L.) Plant.Mol.Biol,18(2):315～326.
6，Shuichi,F.,H.Kazuyoshi et al.1992 Use of random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) for identification of rice accessions.Jpn.J.Genet.67:243～252.
7，Welsh,J.and M.McCleliang 1990 Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.Nucl.Acids Res.18:7213～7218.
8，Williams,J.G.K.,A.R.Kubelik,K.J.Livak et al.1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful genetic markers.Nucl.Acids Res.18:6531～6535.
收稿日期：1998-06-15, http://www.100md.com
单位：董言德(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；朱礼华(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；赵彤言(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；于虹(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)；陆宝麟(军事医学科学院微生物流行病研究所 北京 100071)
关键词：家蝇；二氯苯醚菊酯；抗性株；DNA；RAPD
寄生虫与医学昆虫学报000108摘要 本研究采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术，探索了家蝇二氯苯醚菊酯抗性株(2 000倍)在DNA分子水平上的分化。实验数据采用两种分析方法：1)用RAPDPLOT计算出个体间的遗传距离，进一步用PHYLIP软件包的NEIGHBOR程序进行UPGMA(非加权对组算术平均值聚类)聚类分析；2)经bootstrip方法随机取样100次，然后再进行UPGMA分析，在PHYLIP软件包的CONSENSE中形成合意树。两种分析方法结果极为类似，在聚类树中首先是抗性与非抗性个体分成两群，然后雌、雄个体分成两群，说明抗性株在DNA分子水平上已有明显的分化。OPD-02引物在全部抗性株个体中扩增出了非抗性株所没有的特异性同一片段(100bp左右)，提示此片段有可能作为家蝇二氯苯醚菊酯抗性株的分子标记，但需进一步研究确定。
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STUDIES ON THE DIFFERENTIATION OF
PERMETHRIN-RESISTANT STRAIN OF MUSCA DOMESTICA
Dong Yande
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Zhu Lihua
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Zhao Tongyan
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
, 百拇医药
Yu Hong
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Lu Baolin
(Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071)
Abstract This paper presented the results of differentiation of permethrin-resistant strain of Musca domestica based on RAPD (random amplified polymorphic DNA).The data of RAPD were analyzed in two ways:UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) cluster analysis and consensus analysis after bootstrip sampling.A significant differentiation was found existence between resistant and susceptive strain of Musca domestica.A peculiar amplified DNA fragment (100 bp) was drawn out in resistant strain (OPD-02 Primer).
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Key words Musca domestica Permethrin Resistant strain DNA RAPD
随着化学杀虫剂的大量使用，昆虫抗药性产生的速度越来越快，抗性水平不断提高，目前已成为害虫有效防治的主要障碍。因此，研究昆虫抗药性产生及寻找与抗性有关的分子标记显得极为重要。随机扩增多态DNA(RAPD)是90年代在聚合酶链反应(PCR)的基础上发展起来的一项用于分析DAN分子多态性的技术(Williams et al.，1990；Welsh et al.，1990)，其优点在于方法简捷、需材量少、灵敏度高，已广泛地应用于动植物品种(Black Ⅳ et al.，1992)和品系的鉴定(Shuichi,F. et al.，1992)、遗传关系的确定(Halward,T. et al.，1992)等。本研究采用RAPD技术，研究了二氯苯醚菊酯(Permethrin)抗性株家蝇(Musca domestica)在DNA分子水平上的分化，以探索家蝇对二氯苯醚菊酯抗药性的产生和抗性种群遗传结构的变化。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验昆虫 家蝇敏感株和二氯苯醚菊酯抗性株(点滴法测定LD50，抗性水平达2 000倍)均由本所实验室培育。
1.2 方法
1.2.1 单只家蝇DNA提取 取敏感株和二氯苯醚菊酯抗性株家蝇，切去腹部，置入300μL DNA提取裂解液(10mmol/L Tris-HCl,PH 8.0，50mmol/L NaCl,50mmol/L EDTA,1%SDS,0.15mmol/L精胺，0.5mmol/L亚精胺)中匀浆，加蛋白酶K(40mg/mL)2.5μL，50℃水浴过夜，加等体积的水饱和重蒸酚(pH8.0)，轻轻摇动后4℃6 300r/min离心10min，取上清加等体积氯仿异戊醇(24：1)，离心10min取上清，加2倍体积的无水乙醇和0.2倍体积的10mol/L乙酸胺，4℃冰箱放置3h,6 300r/min离心10min，弃上清，加75%乙醇0.5mL洗涤，再离心5min，弃上清，自然干燥后加入0.5mL纯水，置4℃冰箱备用。
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1.2.2 PCR反应过程 反应总体积为25μL。反应液含10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2,0.01%的明胶，0.1mmol/L dATP、dCTP、dGTP和dTTP，15ng引物，7.5μL模板DNA，混匀后95℃预变性10min，迅速冷却，加1个单位的Taq酶，然后用1～2滴石蜡油封盖。扩增程序为94℃变性1min，72℃延伸2min,36℃退火1min，共45个循环，最后72℃延伸10min。引物：4种随机引物及序列为OPG-19：GTCAGGGCAA、OPD-02：GGACCCAACC、OPD-O3：GTCGDDGTCA、OPD-11：AGCGCCATTG。
1.2.3 电泳 扩增产物经1.4%的琼脂糖凝胶电泳(含0.05%的溴化乙锭)后，紫外透射仪上照相。
1.2.4 数据处理 将电泳照片上15只个体清晰可见的扩增片段统计出来，某一个体在某一位置上出现扩增带时为1，不存在时为0。实验结果用两种统计方法处理：1)用RAPDPLOT程序计算两个个体间的遗传距离，公式为M=NAB/NT(Apostol et al.,1993),NT为本试验所有个体的全部扩增片段，NAB是A和B 两个个体同时存在和不存在扩增片段的总数，1-M即为两个个体的相对遗传距离。将计算出的数据调入PHYLIP软件包(Felsenstein,1993)的NEIGHBOR程序中，应用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic analysis)进行聚类分析，并绘出聚类图；2)利用RAPD程序中的RAPDBOOT程序进行重取样分析(bootstrip,100次)，然后计算遗传距离M=NAB/NT，在PHYLIP中的NEIGHBOR进行UPGMA分析，得到100个聚类图，通过PHYLIP软件包CONSENS程序进行严格合意分析，产生合意聚类图。
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2 结果
对15只家蝇个体进行研究，发现每只个体间扩增的片段多少、大小均有差别，4种随机引物共扩增出47个随机DNA片段，分子量在100bp～4 000bp之间。从电泳结果(图1)可以看出，不仅抗性株与非抗性株之间扩增的DNA片段有差别，敏感株或抗性株内个体之间也不尽相同。特别是OPD-02引物，在抗性株雌雄8只个体中，均扩增出敏感株所没有的1个特异性片段(100bp左右)，个体间的相对遗传分化距离见表1。
OPG-19 OPD-11
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OPD-03 OPD-02
图1 家蝇抗性与非抗性株个体RAPD扩增产物的电泳图
Fig.1 The electrophoretogram of RAPD of susceptive strain
and resistant strain of Musca domestica
1：λDNAEcorl+HindⅢ 2～5：r-b1～r-b4 6～9:s-b1～s-b4
10～13:r-al～r-a4 14～16:s-al～s-a3
表1 家蝇15只个体相对遗传分化距离(1-M)
Table 1 The differential distance of individuals of Musca domestica(1-M) 个体
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indivi-
dual
s-a1
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0.468
0.213
0.319
0.340
, 百拇医药
0.362
0.426
0.468
0.489
0.489
0.298
0.149
0.170
0.000
注：s代表敏感株；r代表抗性株；a代表雌性个体；b代表雄性个体(下同)
Note:s:susceptive strain;r:resistant strain;a:female:b:male
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家蝇二氯苯醚菊酯抗性株和敏感株RAPD的聚类结果见图2，从中可以更直观的看出个体间的亲缘关系，15只个体首先分成抗性和非抗性两类，然后在各类中雌、雄蝇又分别聚为两类，说明抗性与非抗性株在DNA分子水平上已有明显的分化。
图2 二氯苯醚菊酯抗性株与敏感株家蝇的UPGMA图
Fig.2 The dendrogram of susceptive strain and Permethrin-Resistant strain of
Musca domestica (UPGMA)
经bootstrip分析形成的合意树见图3，与UPGMA分析的聚类结果极为相似，仅抗性株雄性个体的亲缘关系略有差别。BlackIV(1996)认为，bootstrip分析得到的BP值(见图3合意树中交点处)大于90时，两个群体的遗传差异在统计学上具有显著性。在本实验100次随机取样的统计结果中，bootstrip分析的BP值为88，说明两个群体在遗传学上已有较高水平的分化。
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图3 家蝇抗性和非抗性株经bootstrip分析的合意聚类
Fig.3 The bootstrip analysis on Permethrin-Resistant strain and susceptive strain
of Musca domestica.The numbers are BP values
3 讨论
3.1 昆虫抗药性的产生是杀虫剂选择的结果，随着杀虫剂用量的增大，选择压力不断提高，种群内与抗性有关的基因频率越来越高，表现为昆虫的抗药性水平不断提高。本实验应用RAPD技术，在DAN分子水平上将抗性与非抗性株分成两个群体，说明这两株家蝇的基因库已有明显的不同。
3.2 在引物使用数量上，作者随机选取3个引物的扩增结果做相同的统计处理，与4个引物的聚类结果极为相似，说明本试验中4个引物的扩增结果已经能够较准确的反映抗性与非抗性株之间的差别。这与扩增片段较多(11～12个/引物)及抗性株的分化水平较高有关。由于RAPD方法简单易行，需要的DNA量极少，若运用多个引物对实验对象的整个基因组进行大规模分析，两个基因组之间的微小差别也可以分析出来，因此，抗性株较低水平的遗传分化也可以用PAPD方法检测出来。
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3.3 本实验中OPD-02引物在抗性株所有个体中扩增出了敏感株所没有的特异性同一片段，提示此片段有可能作为家蝇二氯苯醚菊酯抗性株的分子标记，但需进一步研究确定。
国家自然科学基金课题，批准号：39470643
参考文献
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收稿日期：1998-06-15, http://www.100md.com