卵丘细胞及胞外基质诱发中国仓鼠精子顶体反应*
作者：袁玉英 张振汉** 石其贤
单位：浙江省医学科学院药物研究所生殖生理学研究室，杭州 310013；**宁夏农学院生物学系，银川
关键词：卵丘细胞及胞外基质；孕酮；糖胺多糖；顶体反应；中国仓鼠精子
解剖学报/980416 摘 要 为了探讨中国仓鼠(CHA)卵丘细胞及其胞外基质(COM)和细胞外基质(ECM)对精子获能、顶体反应(AR)和受精能力的作用，以及COM中何种因子影响上述受精环节，分别采用阿利新蓝8 GX法和放射免疫法(RIA)测定COM中糖胺多糖(GAG)总量和孕酮(P4)含量，并以精子穿卵试验(SPA)评价精子的受精能力。结果表明：CHA精子在COM中AR率随获能培养时间的延长而增加，呈时间依赖关系。ECM是诱发CHA精子AR的主要部位。它含P4、透明质酸(HA)和肝素(HE)等。它们均可引起CHA体外获能精子发生AR，AR率随P4和GAG剂量而增加，并存在着明显的量效关系。P4不能引起未获能精子发生AR，据此，它可以作为一种评价精子是否获能的探针。此外，P4还可明显地提高CHA精子穿卵能力。由此可得出结论，ECM中P4和GAG是引起CHA精子获能、AR和受精的因子。
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绝大多数哺乳动物新排出的卵子，其外层由多层卵丘细胞(cumulus oophorus cells,COC或cumulus cells,CC)及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成。我们将它通称为卵丘细胞及其胞外基质(cumulus oophorus and matrix,COM)。ECM是在卵母细胞减数分裂重新启动期间，为排卵前迅速膨胀的COC所分泌[1]，在电镜下，完全膨胀的ECM象一张纤维构成的网络，它可伸入透明带(ZP)外层的微孔中[1]。近几年来，COM在哺乳动物受精中的作用日益引起人们的重视[2～4]。据这些作者报道，COM的存在对体外受精具有促进作用。含COM的卵子受精率明显增高而且稳定(85%～100%)；而无COM的卵子受精率明显下降并且波动较大(10%～80%)[1]。因此，COM的存在对于提高和稳定受精率具有十分重要的意义。COM提高受精率是通过精子获能还是顶体反应(AR)，或是直接作用于受精阶段，尚不了解。然而，某些种类(如羊等)的卵子，在体内、外没有完整的COM时仍能受精。因此，一些学者认为，受精过程并不需要COM。
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近几年来，Yanagimachi等[1]和Shi等[5]发现中国仓鼠(CHA)体外受精完全依赖于其自身COM之存在。在缺乏COM时，几乎不能受精。因此，CHA是研究COM与受精关系较为理想的动物模型。但他们并未分析COM中存在着何种物质或因子支持精子受精?因此，本研究的目的是：(1)探讨CHA的COM分别对精子获能、AR和受精能力的作用；(2)分析COM中何种物质或因子影响精子获能、AR和受精能力?这一研究可望发展一种简易的评价精子获能和AR的分子探针。
材料和方法
1.培养基
所有无机盐试剂(分析纯)均购自上海化学试剂一厂。孕酮(P4)、糖胺多糖(GAG)、透明质酸、BSA、丙酮酸钠、乳酸钠、forskolin、dbcAMP、肝素、牛磺酸、阿利新蓝8 GX和肾上腺素等购自Sigma化学试剂公司。CHA配子培养基采用改良的Tyrode液(mTS)，含15 g/L BSA，0.5m mol/L牛磺酸和0.5m mol/L肾上腺素等。该培养基可使CHA精子体外获能但不能引起精子AR[5]。孕马血清(PMSG)为长春生物制品研究所产品，人绒毛膜促性腺激素(hCG)为浙江宁波激素制品厂生产。
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2.精子和卵子
采用6月龄雄性中国仓鼠(Cricetulus griseus,CHA)。部分动物为四川省计划生育科学技术研究所黄天华教授惠赠；部分动物购自北京国家计划生育委员会科学技术研究所。以颈椎脱臼法处死动物后，打开腹腔，取出输精管和附睾尾部精子，合并后悬浮于mTS(pH7.6)中，在5%CO2和95%空气条件下，以上游法(精液：mTS为2：10，孵育30min)筛选活动精子。收集上层精子悬液，并将精子数调至5～6×106细胞/ml。
采用4月龄雌性CHA，卵子超排采用改良的仓鼠超排卵法，即在动情期第1d上午9时腹腔注射30 IU PMSG，56～60h后注射30 IU hCG。于注射hCG23～24h后在预期排卵前12h，施人工授精。然后从输卵管壶腹部收集输卵管液(ampullary fluids,AF)、卵子及其COM，总计精子583(其中在AF中383，位于COM中150和ZP上50)。金黄仓鼠(GH)卵超排按本实验室报道方法[6]。
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3.精子获能及评价
精子与超排卵子在含/无COM或金黄仓鼠卵丘细胞及胞外基质(GHCOM)存在情况下，置37℃ 5%CO2和95%空气培养1～30h。在不同时距(0、1、3、5、7和30 h)用压片法[6]置相差显微镜(Olympus BH2)观察精子活率、超激活运动(HAM)和AR%。以AR%为指标评价群体精子获能状况。
图1 COM、ECM和CC对中国仓鼠精子顶体反应的影响
COM.卵丘细胞及其细胞外基质.ECM.细胞外基质 CC.卵丘细胞
Fig.1 Effect of COM,CC and ECM on the AR in CHA spermatozoa.
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COM：cumulus oophorus and matrix
ECM:extracellular matrix
CC:cumullus cells
4.精子顶体状态的评价方法
在相差显微镜下，CHA精子顶体帽可分为两种类型：(1)顶体帽完整而紧密，外形光滑，顶体吻端有明显的钩；(2)AR精子，顶体帽缺如。体内、外AF、COM和ZP上精子顶体状态的评价：收集壶腹AF和卵子及其COM，在相差显微镜下观察上述诸部位的精子顶体帽状况。具体操作见文献报道方法[6]。
5.COM中P4的测定
收集40只CHA超排卵后的COM约0.5ml，经37℃1h孵育后离心(14 000×g,15min)，除去CM后得到ECM0.3ml，取0.2ml测定P4；另0.1ml测GAG。同时取0.3ml混合血浆，然后根据WHO人类生殖规划处提供的RIA配对试剂，按WHO RIA测定手册(1985，第9版)操作，采用内标准法测量，回收率达90%。高、中、低浓度质量控制的批内变异系数分别为12.3%、8.8%和6.6%。批间变异系数分别为6.6%、8.0%和9.1%，均符合测定技术要求。
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6.GAG的测定
按刘秉慈报道的阿利新蓝法测定GAG总量，将阿利新蓝8 GX按1.4g/L(w/v)溶解于0.5mol/L乙酸钠溶液中，临用前配制。然后于试管中加入0.1 mlCOM或GAG，空白对照管中加0.1ml去离子水。准确加入1.5ml阿利新蓝，在vortex上充分混匀。10min后，在721光电比色计上用1.0ml比色杯(波长480nm)进行比色测定。然后经常规醋酸纤维膜电泳法分离GAG中的相对含量[7]。
7.CC与ECM的分离
为了探讨诱发AR因子是在卵CC中还是ECM中，将COM置于0.2μm(φ)微孔滤膜(国家海洋局第二海洋研究所，杭州)制成的袋里，悬挂于含CHA精子悬液的试管中(图1)，于37℃, 5%CO2, 95%空气中培养7h或COM经37℃孵育后离心(14 000g,15min)，将CC与ECM分离。CC经mTS离心洗涤3次，然后将CC和ECM分别置于微孔滤膜袋中，按上法培养7h。最后分别评价COM、CC和ECM对精子AR的作用。
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8.体外诱发精子AR
当精子在无COM存在下，加入各种因子，如GAG、透明质酸(HA)、肝素(HE)和孕酮(P4)等诱发精子AR，获能培养5h，以评价精子对上述因子的反应能力。
9.精子穿卵试验(sperm penetration assay,SPA)
为了鉴定COM诱发的AR精子的受精能力，采用精子穿透去透明带仓鼠卵试验来评价CHA精子的受精能力。SPA方法按本实验室报道方法[8]。
所有结果采用均值±标准差(
±s)表示，组间差异的显著性测定，采用t检验，以P<0.05为显著性差异。
结 果
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1.体内与体外诱发精子AR(部位)的比较
体内精子AR率随精子通过AF(58.2%)和COM时逐渐增加(93.0%)；当精子抵达ZP时(94.0%)已完成AR。在体外试验中，精子在COM和ZP及单独ZP中，AR率为76.5±7.0%和16.4±4.2%，显著低于体内AR率(P<0.01)，但又明显高于空白对照组(3.5±1.5%，P<0.01)。
2.COM、COM-free和GHCOM对CHA精子获能的作用
CHA精子在COM中AR率随培养时间的延长而增加，呈时间依赖关系。CHA精子获能培养3h时，AR可达到34.5±5.3%，表明该部分精子已经获能。而COM-free对AR无作用。GHCOM对CHA精子AR也有激发作用，虽明显低于其自身COM的作用(P<0.01)，但仍显著高于COM-free组(P<0.01)。在5h CHA精子AR率约为50%(图2)。
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3.ECM中的主要成分
图2 COM和GHCOM对CHA精子获能的影响：COM.中国仓鼠卵丘细胞及胞外基质 GHCOM.金黄仓鼠卵丘细胞及胞外基质 motility.精子活率 COM-free.不含中国仓鼠卵丘细胞及胞外基质 a与相对应b比较，P<0.01
Fig.2 Effect of COM and GHCOM on capacitation in CHA spermatozoa. COM represents the COM of CHA;GHCOM means the COM of golden hamster.a:P<0.01 as compared to the relevant b.
, 百拇医药 图3 糖胺多糖(GAG)诱发CHA获能精子顶体反应。a:与相应对照组各点比较P<0.001
Fig.3 GAG induced the AR of capacitated spermatozoa in CHA. a:P<0.001 when compared to the control.
图4 孕酮激发获能CHA精子AR及其穿卵能力(SPA)
motility. 精子活率，SPA.精子穿卵试验 AR.顶体反应
Fig.4 Progesterone initiates capacitated spermatozoa AR and SPA in CHA. SPA：Sperm penetration assay;AR：Acrosome reaction
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为了阐明COM中诱发因子是在哪一组分，在透析试验中，单独CC几乎不能激发CHA精子发生AR，而ECM是诱发CHA精子AR的主要组分(表1)。那么，在ECM中存在何种成分?经RIA测定ECM中含有P4，其浓度为1.3mg/L ECM，而血浆为12.5μg/L。两者浓度之差为100多倍。此外，ECM中经醋酸纤维素薄膜电泳与参比样品GAG同时点样操作，证明ECM中富含GAG，其总量约为5mg/L，其中主要为HA，其次为HE以及其他一些未知样品。但本方法只能对HA和HE定性而不能定量。
4.GAG和P4对CHA获能精子AR的作用
GAG和P4均可引起CHA获能精子发生AR。AR率随GAG和P4剂量而增加，并存在着明显的量效关系(图3，4)。但两者对AR无协同作用(结果未列出)。P4不仅可促进AR，而且还可明显地提高CHA精子穿透去透明带仓鼠卵的能力(SPA，图4)。其最大促进作用的浓度为25μg/L。
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5.各种因子对获能CHA精子AR的作用(表2)
输卵管液(AF)和孵泡液(FF)具有明显地诱发CHA获能精子发生AR。HA、HE、dbcAMP和forskolin也有此作用，但明显弱于前两者。HA和HE两者无协同或加强作用(结果未列出)。
表1 COM、ECM、ZP和CC对CHA
精子顶体反应的影响
Table 1 Effects of COM,ECM,ZP and
CC on the acrosome reaction in Chinese hamster spermatozoa 来 源
sources
, 百拇医药 活 率
motility(%)
顶体反应
AR(%)
卵丘细胞及胞外基质
75.6±5.3
65.7±4.2a
COM
细胞外基质
73.8±4.9
60.9±3.8a
ECM
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透明带
78.5±4.6
16.4±4.2b
ZP alone
卵丘细胞
72.4±5.7
6.0±1.5c
CC
对 照
73.5±3.8
3.5±1.5d
control
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n=3。a与b，c和d比较，P<0.001；b与c和d比较，P<0.01；c与d比较，P<0.05
n=3。a:P<0.001, as compared to b,c and d;
b:P<0.01,as compared to c and d;c:P<0.05,as compared to d.表2 影响CHA精子顶体反应的其他因子
Table 2 Factor(s) affecting Chinese hamster
sperm acrosome reaction in vitro 处 理
treatments
活 率
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motility(%)
顶体反应
AR(%)
滤泡液(follicular fluids)
76.0±4.8
44.2±2.5a
(1∶10，v/v)
输卵管壶腹部液(ampullary fluids)
75.4±5.0
48.5±5.7a
(1∶10，v/v)
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肝素(heparin)
73.3±2.5
23.0±2.6b
(5mg/L)
透明质酸(hyaluronic acid)
74.0±3.5
25.0±2.0b
(10mg/L)
二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)
73.0
25.0±1.8b
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(10μmol/L)
福斯考林(forskolin)
75.0
23.7±2.7b
(5mg/L)
对照(control)
78.2±2.4
4.1±1.7c
a与b比较，P<0.001.b与c比较，P<0.001
a:P<0.001，as compared to b;b:P<0.001,as compared to c.讨 论
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在自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行的。然而，精子究竟在何处获能，至今尚未完全阐明。一般认为精子获能始于宫颈，通过宫腔和输卵管的转运，逐渐获得了受精能力，最后完成于输卵管壶腹部。当获能精子进入或穿过COM并与ZP结合时，精子被激活，呈现一种特殊的运动即超激活运动(hyperactivated motility)，其头部发生AR或称胞吐作用(exocytosis)。获能是精子AR的前提，AR标志着获能的完成。因此，可通过超激活运动和AR来评价群体精子获能状况。本实验从AF中收集精子383，其中223精子已发生AR(58.2%)；同样，AF在体外也可引起CHA精子AR(48.5±5.7%，表2)。这与一些学者报道AF是豚鼠、兔、绵羊和仓鼠体内精子AR部位之一的结果相符[6，9]。AF存在着何种获能诱发因子，目前还不完全清楚。也可能存在着肝素样物质GAG，它能引起牛精子获能[9]。
CHA精子无论在体内或体外，均可在COM和ZP复合物中发生AR，而且体内AR率明显高于体外(P<0.01)。本研究虽然未观察体内人工授精后不同时间收集的COM中的精子AR状况， 但在体外COM获能培养系统中，3 h CHA精子AR率可达到34.5±5.3%，而且随培养时间的延长，AR率呈明显增加趋势(图2)，表明CHA精子获能与时间呈依赖关系。可见COM是CHA精子获能和AR的主要部位。GHCOM对CHA精子AR也具有一定的刺激作用，其作用发生于预培养5h；与CHACOM比较，获能时间明显滞后。由此推测，CHA精子获能时间至少3～5h。为何GHCOM对CHA精子获能也有作用?近几年来发现，COM可捕获和分泌P4[10]本实验结果也证明COM中存在较高的P4。近几年证明，P4对人及其他哺乳动物获能精子也具有促进AR作用，且无种属差异性。据Blackmore等[11]报道，P4可刺激胞外Ca2+内流，使胞内Ca2+浓度上升，从而激发精子AR。这种作用是通过位于精子表面GABAA样受体或GABAA/Cl-受体和Ca2+通道发挥作用[12，13]。这些结果表明，凡是获能的精子均可对P4的刺激引起AR。据此，P4可作为一种探针来鉴别精子是否获能。
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如前所述，获能的终点是发生AR，AR依赖于获能。AR又是受精的前提，只有发生AR的精子才能穿过ZP并与卵膜融合[1]。由此可见，AR是受精的关键步骤之一。WHO1992年已将精子AR能力作为评价精子受精功能的重要指标之一。然而，精子虽然获能，如无天然或人工激动剂存在，精子仍不能发生真正的AR。自发性AR虽可发生，但这种精子并无受精能力[1]。CHA精子在COM中可发生AR，7h AR率可达到76.5±7.0%，据此可推测，COM中必然存在着AR天然诱发因子。目前，一般认为ZP(主要是ZP3)和P4是体内AR的天然诱发因子[1，14]，而且发生AR的精子具有受精能力。但令人费解的是，单独的CHA卵ZP触发AR率明显低于COM组(表1)，也不能提高受精率[5]。这一结果与多数哺乳动物卵ZP是获能精子AR的诱发者相悖。这是否与我们未使用可溶性ZP糖蛋白有关，还是CHA是一种特殊种类，尚需积累更多的资料，才能下结论。
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COM可引起CHA精子获能，促进AR，从而提高受精能力，该因子存在于CC还是ECM中?本研究结果表明，这种激发因子是在ECM中而非CC本身(表1)。ECM广泛存在于机体各部位的组织中，以维持细胞的生存、分化和运动。但它们的成分不尽相同。近几年来，卵丘细胞及其细胞外基质在受精生物学中的作用日益引起人们的重视。据报道，COM除了捕获及分泌P4[10]和前列腺素外，其主要成分为GAG，包括HA、HE、几丁质、角蛋白和软骨素等。另外，其中HE可参与牛精子获能[9]，促进多种动物精子AR[13]。本研究结果证明，COM中存在P4、HA和HE，它们均可明显地促进CHA精子获能和获能精子发生AR(表2)。而且P4还可明显地提高CHA精子的受精能力(图4)。近年来，一些研究业已证明精子表面存在着上述相应配体的受体[1，4，11，13]。COM携带诱发AR的多种配体，通过配体-特异性受体-G蛋白介导-效应酶-胞内第二信使-效应器的信息传递方式，触发精子发生AR。这似与P4可促进人精子AR，从而提高受精率相一致。
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赵秀菊副研究员协助孕酮放免测定，特此致谢。
收稿1997-06 修回1997-09
参考文献
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, 百拇医药
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INITIATION OF THE ACROSOME REACTION IN CHINESE
HAMSTER SPERM BY CUMULUS OOPHORUS AND MATRIX
HAMSTER SPERM BY CUMULUS OOPHORUS AND MATRIX
, 百拇医药
Yuan Yuying, Zhang Zhenhan, Shi Qixian
(Department of Reproductive Physiology, Institute of Materia Medica,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou)
To investigate effects of cumulus oophorus and matrix(COM) on capacitation, which can be estimated by the ability to undergo the acrosome reaction (AR) in response to agonists in Chinese hamster(CHA)sperm, the spermatozoa were incubated in the modified Tyrode solution(mTS) at 37℃ for1-7h in 95% air and 5% CO2 with COM,extracellular matrix (ECM),cumulus cells (CC) and COM-free.A significant stimulation of the AR in the presence of COM and ECM occurred but did not in CC and COM-free.The effect was in a time-dependent manner.Also,COM of golden hamster(GH) with ova markedly induced the AR in CHA spermatozoa.To examine what factor(s) in the COM induces the AR in CHA spermatozoa,glucosaminoglycans(GAG) and progesterone(P4) was separately determined by an alcian blue 8 GX method and radioassay.Hyaluronic acid (HA),heparin(HE) and P4 were found in the presence of ECM with ova in CHA.Treatment of preincubated CHA spermatozoa with GAG(1-10mg/L) resulted in an increase in the AR.This effect was in a concentration-dependent manner.Both HA(10mg/L and HE(5mg/L)caused a significant increase in the AR of capacitated spermatozoa in CHA.However,there was no potential effect on the AR when HA was added to the spermatozoa suspension containing HE or in the inverse order.Exposure of preincubated spermatozoa for 7h to P4(5-50μg/L) caused the AR with maximal responses at concentration of 25 mg/L,but uncapacitated spermatozoa preincubation for 1h did not stimulate the AR in response to the agonist.Therefore,P4 may be as a probe to identify whether sperms capacitated .The respones elicited by P4 was evaluated further by testing the effect of P4 on the ability of spermatozoa to penetrate zona-free hamster oocytes.Treatment of preincubated CHA spermatozoa with P4 (5-50μg/L) for 15min resulted in an increase in the proportion of ferti-lized oocytes.Maximal stimulatory effect was observed at 25μg/L P4.These results indicate that P4 and HA or HE in COM initiate the AR and P4 enhances the fertilizing ability of capacitated spermatozoa in CHA,and suggest that these factors in COM are involved in the modulation of spermatozoa AR and fertilization in CHA.
KEY WORDS Cumulus oophorus and matrix;Progesterone;Glycosaminoglycan;Acrosome reaction;Chinese hamster sperm
* 国家自然科学基金资助课题(No.39170411),浙江省自然科学基金资助课题(No.394056), http://www.100md.com(袁玉英 张振汉** 石其贤)
单位：浙江省医学科学院药物研究所生殖生理学研究室，杭州 310013；**宁夏农学院生物学系，银川
关键词：卵丘细胞及胞外基质；孕酮；糖胺多糖；顶体反应；中国仓鼠精子
解剖学报/980416 摘 要 为了探讨中国仓鼠(CHA)卵丘细胞及其胞外基质(COM)和细胞外基质(ECM)对精子获能、顶体反应(AR)和受精能力的作用，以及COM中何种因子影响上述受精环节，分别采用阿利新蓝8 GX法和放射免疫法(RIA)测定COM中糖胺多糖(GAG)总量和孕酮(P4)含量，并以精子穿卵试验(SPA)评价精子的受精能力。结果表明：CHA精子在COM中AR率随获能培养时间的延长而增加，呈时间依赖关系。ECM是诱发CHA精子AR的主要部位。它含P4、透明质酸(HA)和肝素(HE)等。它们均可引起CHA体外获能精子发生AR，AR率随P4和GAG剂量而增加，并存在着明显的量效关系。P4不能引起未获能精子发生AR，据此，它可以作为一种评价精子是否获能的探针。此外，P4还可明显地提高CHA精子穿卵能力。由此可得出结论，ECM中P4和GAG是引起CHA精子获能、AR和受精的因子。
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绝大多数哺乳动物新排出的卵子，其外层由多层卵丘细胞(cumulus oophorus cells,COC或cumulus cells,CC)及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成。我们将它通称为卵丘细胞及其胞外基质(cumulus oophorus and matrix,COM)。ECM是在卵母细胞减数分裂重新启动期间，为排卵前迅速膨胀的COC所分泌[1]，在电镜下，完全膨胀的ECM象一张纤维构成的网络，它可伸入透明带(ZP)外层的微孔中[1]。近几年来，COM在哺乳动物受精中的作用日益引起人们的重视[2～4]。据这些作者报道，COM的存在对体外受精具有促进作用。含COM的卵子受精率明显增高而且稳定(85%～100%)；而无COM的卵子受精率明显下降并且波动较大(10%～80%)[1]。因此，COM的存在对于提高和稳定受精率具有十分重要的意义。COM提高受精率是通过精子获能还是顶体反应(AR)，或是直接作用于受精阶段，尚不了解。然而，某些种类(如羊等)的卵子，在体内、外没有完整的COM时仍能受精。因此，一些学者认为，受精过程并不需要COM。
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近几年来，Yanagimachi等[1]和Shi等[5]发现中国仓鼠(CHA)体外受精完全依赖于其自身COM之存在。在缺乏COM时，几乎不能受精。因此，CHA是研究COM与受精关系较为理想的动物模型。但他们并未分析COM中存在着何种物质或因子支持精子受精?因此，本研究的目的是：(1)探讨CHA的COM分别对精子获能、AR和受精能力的作用；(2)分析COM中何种物质或因子影响精子获能、AR和受精能力?这一研究可望发展一种简易的评价精子获能和AR的分子探针。
材料和方法
1.培养基
所有无机盐试剂(分析纯)均购自上海化学试剂一厂。孕酮(P4)、糖胺多糖(GAG)、透明质酸、BSA、丙酮酸钠、乳酸钠、forskolin、dbcAMP、肝素、牛磺酸、阿利新蓝8 GX和肾上腺素等购自Sigma化学试剂公司。CHA配子培养基采用改良的Tyrode液(mTS)，含15 g/L BSA，0.5m mol/L牛磺酸和0.5m mol/L肾上腺素等。该培养基可使CHA精子体外获能但不能引起精子AR[5]。孕马血清(PMSG)为长春生物制品研究所产品，人绒毛膜促性腺激素(hCG)为浙江宁波激素制品厂生产。
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2.精子和卵子
采用6月龄雄性中国仓鼠(Cricetulus griseus,CHA)。部分动物为四川省计划生育科学技术研究所黄天华教授惠赠；部分动物购自北京国家计划生育委员会科学技术研究所。以颈椎脱臼法处死动物后，打开腹腔，取出输精管和附睾尾部精子，合并后悬浮于mTS(pH7.6)中，在5%CO2和95%空气条件下，以上游法(精液：mTS为2：10，孵育30min)筛选活动精子。收集上层精子悬液，并将精子数调至5～6×106细胞/ml。
采用4月龄雌性CHA，卵子超排采用改良的仓鼠超排卵法，即在动情期第1d上午9时腹腔注射30 IU PMSG，56～60h后注射30 IU hCG。于注射hCG23～24h后在预期排卵前12h，施人工授精。然后从输卵管壶腹部收集输卵管液(ampullary fluids,AF)、卵子及其COM，总计精子583(其中在AF中383，位于COM中150和ZP上50)。金黄仓鼠(GH)卵超排按本实验室报道方法[6]。
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3.精子获能及评价
精子与超排卵子在含/无COM或金黄仓鼠卵丘细胞及胞外基质(GHCOM)存在情况下，置37℃ 5%CO2和95%空气培养1～30h。在不同时距(0、1、3、5、7和30 h)用压片法[6]置相差显微镜(Olympus BH2)观察精子活率、超激活运动(HAM)和AR%。以AR%为指标评价群体精子获能状况。
图1 COM、ECM和CC对中国仓鼠精子顶体反应的影响
COM.卵丘细胞及其细胞外基质.ECM.细胞外基质 CC.卵丘细胞
Fig.1 Effect of COM,CC and ECM on the AR in CHA spermatozoa.
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COM：cumulus oophorus and matrix
ECM:extracellular matrix
CC:cumullus cells
4.精子顶体状态的评价方法
在相差显微镜下，CHA精子顶体帽可分为两种类型：(1)顶体帽完整而紧密，外形光滑，顶体吻端有明显的钩；(2)AR精子，顶体帽缺如。体内、外AF、COM和ZP上精子顶体状态的评价：收集壶腹AF和卵子及其COM，在相差显微镜下观察上述诸部位的精子顶体帽状况。具体操作见文献报道方法[6]。
5.COM中P4的测定
收集40只CHA超排卵后的COM约0.5ml，经37℃1h孵育后离心(14 000×g,15min)，除去CM后得到ECM0.3ml，取0.2ml测定P4；另0.1ml测GAG。同时取0.3ml混合血浆，然后根据WHO人类生殖规划处提供的RIA配对试剂，按WHO RIA测定手册(1985，第9版)操作，采用内标准法测量，回收率达90%。高、中、低浓度质量控制的批内变异系数分别为12.3%、8.8%和6.6%。批间变异系数分别为6.6%、8.0%和9.1%，均符合测定技术要求。
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6.GAG的测定
按刘秉慈报道的阿利新蓝法测定GAG总量，将阿利新蓝8 GX按1.4g/L(w/v)溶解于0.5mol/L乙酸钠溶液中，临用前配制。然后于试管中加入0.1 mlCOM或GAG，空白对照管中加0.1ml去离子水。准确加入1.5ml阿利新蓝，在vortex上充分混匀。10min后，在721光电比色计上用1.0ml比色杯(波长480nm)进行比色测定。然后经常规醋酸纤维膜电泳法分离GAG中的相对含量[7]。
7.CC与ECM的分离
为了探讨诱发AR因子是在卵CC中还是ECM中，将COM置于0.2μm(φ)微孔滤膜(国家海洋局第二海洋研究所，杭州)制成的袋里，悬挂于含CHA精子悬液的试管中(图1)，于37℃, 5%CO2, 95%空气中培养7h或COM经37℃孵育后离心(14 000g,15min)，将CC与ECM分离。CC经mTS离心洗涤3次，然后将CC和ECM分别置于微孔滤膜袋中，按上法培养7h。最后分别评价COM、CC和ECM对精子AR的作用。
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8.体外诱发精子AR
当精子在无COM存在下，加入各种因子，如GAG、透明质酸(HA)、肝素(HE)和孕酮(P4)等诱发精子AR，获能培养5h，以评价精子对上述因子的反应能力。
9.精子穿卵试验(sperm penetration assay,SPA)
为了鉴定COM诱发的AR精子的受精能力，采用精子穿透去透明带仓鼠卵试验来评价CHA精子的受精能力。SPA方法按本实验室报道方法[8]。
所有结果采用均值±标准差(
±s)表示，组间差异的显著性测定，采用t检验，以P<0.05为显著性差异。结 果
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1.体内与体外诱发精子AR(部位)的比较
体内精子AR率随精子通过AF(58.2%)和COM时逐渐增加(93.0%)；当精子抵达ZP时(94.0%)已完成AR。在体外试验中，精子在COM和ZP及单独ZP中，AR率为76.5±7.0%和16.4±4.2%，显著低于体内AR率(P<0.01)，但又明显高于空白对照组(3.5±1.5%，P<0.01)。
2.COM、COM-free和GHCOM对CHA精子获能的作用
CHA精子在COM中AR率随培养时间的延长而增加，呈时间依赖关系。CHA精子获能培养3h时，AR可达到34.5±5.3%，表明该部分精子已经获能。而COM-free对AR无作用。GHCOM对CHA精子AR也有激发作用，虽明显低于其自身COM的作用(P<0.01)，但仍显著高于COM-free组(P<0.01)。在5h CHA精子AR率约为50%(图2)。
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3.ECM中的主要成分
图2 COM和GHCOM对CHA精子获能的影响：COM.中国仓鼠卵丘细胞及胞外基质 GHCOM.金黄仓鼠卵丘细胞及胞外基质 motility.精子活率 COM-free.不含中国仓鼠卵丘细胞及胞外基质 a与相对应b比较，P<0.01
Fig.2 Effect of COM and GHCOM on capacitation in CHA spermatozoa. COM represents the COM of CHA;GHCOM means the COM of golden hamster.a:P<0.01 as compared to the relevant b.
, 百拇医药 图3 糖胺多糖(GAG)诱发CHA获能精子顶体反应。a:与相应对照组各点比较P<0.001
Fig.3 GAG induced the AR of capacitated spermatozoa in CHA. a:P<0.001 when compared to the control.
图4 孕酮激发获能CHA精子AR及其穿卵能力(SPA)
motility. 精子活率，SPA.精子穿卵试验 AR.顶体反应
Fig.4 Progesterone initiates capacitated spermatozoa AR and SPA in CHA. SPA：Sperm penetration assay;AR：Acrosome reaction
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为了阐明COM中诱发因子是在哪一组分，在透析试验中，单独CC几乎不能激发CHA精子发生AR，而ECM是诱发CHA精子AR的主要组分(表1)。那么，在ECM中存在何种成分?经RIA测定ECM中含有P4，其浓度为1.3mg/L ECM，而血浆为12.5μg/L。两者浓度之差为100多倍。此外，ECM中经醋酸纤维素薄膜电泳与参比样品GAG同时点样操作，证明ECM中富含GAG，其总量约为5mg/L，其中主要为HA，其次为HE以及其他一些未知样品。但本方法只能对HA和HE定性而不能定量。
4.GAG和P4对CHA获能精子AR的作用
GAG和P4均可引起CHA获能精子发生AR。AR率随GAG和P4剂量而增加，并存在着明显的量效关系(图3，4)。但两者对AR无协同作用(结果未列出)。P4不仅可促进AR，而且还可明显地提高CHA精子穿透去透明带仓鼠卵的能力(SPA，图4)。其最大促进作用的浓度为25μg/L。
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5.各种因子对获能CHA精子AR的作用(表2)
输卵管液(AF)和孵泡液(FF)具有明显地诱发CHA获能精子发生AR。HA、HE、dbcAMP和forskolin也有此作用，但明显弱于前两者。HA和HE两者无协同或加强作用(结果未列出)。
表1 COM、ECM、ZP和CC对CHA
精子顶体反应的影响
Table 1 Effects of COM,ECM,ZP and
CC on the acrosome reaction in Chinese hamster spermatozoa 来 源
sources
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motility(%)
顶体反应
AR(%)
卵丘细胞及胞外基质
75.6±5.3
65.7±4.2a
COM
细胞外基质
73.8±4.9
60.9±3.8a
ECM
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透明带
78.5±4.6
16.4±4.2b
ZP alone
卵丘细胞
72.4±5.7
6.0±1.5c
CC
对 照
73.5±3.8
3.5±1.5d
control
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n=3。a与b，c和d比较，P<0.001；b与c和d比较，P<0.01；c与d比较，P<0.05
n=3。a:P<0.001, as compared to b,c and d;
b:P<0.01,as compared to c and d;c:P<0.05,as compared to d.表2 影响CHA精子顶体反应的其他因子
Table 2 Factor(s) affecting Chinese hamster
sperm acrosome reaction in vitro 处 理
treatments
活 率
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motility(%)
顶体反应
AR(%)
滤泡液(follicular fluids)
76.0±4.8
44.2±2.5a
(1∶10，v/v)
输卵管壶腹部液(ampullary fluids)
75.4±5.0
48.5±5.7a
(1∶10，v/v)
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肝素(heparin)
73.3±2.5
23.0±2.6b
(5mg/L)
透明质酸(hyaluronic acid)
74.0±3.5
25.0±2.0b
(10mg/L)
二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)
73.0
25.0±1.8b
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(10μmol/L)
福斯考林(forskolin)
75.0
23.7±2.7b
(5mg/L)
对照(control)
78.2±2.4
4.1±1.7c
a与b比较，P<0.001.b与c比较，P<0.001
a:P<0.001，as compared to b;b:P<0.001,as compared to c.讨 论
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在自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行的。然而，精子究竟在何处获能，至今尚未完全阐明。一般认为精子获能始于宫颈，通过宫腔和输卵管的转运，逐渐获得了受精能力，最后完成于输卵管壶腹部。当获能精子进入或穿过COM并与ZP结合时，精子被激活，呈现一种特殊的运动即超激活运动(hyperactivated motility)，其头部发生AR或称胞吐作用(exocytosis)。获能是精子AR的前提，AR标志着获能的完成。因此，可通过超激活运动和AR来评价群体精子获能状况。本实验从AF中收集精子383，其中223精子已发生AR(58.2%)；同样，AF在体外也可引起CHA精子AR(48.5±5.7%，表2)。这与一些学者报道AF是豚鼠、兔、绵羊和仓鼠体内精子AR部位之一的结果相符[6，9]。AF存在着何种获能诱发因子，目前还不完全清楚。也可能存在着肝素样物质GAG，它能引起牛精子获能[9]。
CHA精子无论在体内或体外，均可在COM和ZP复合物中发生AR，而且体内AR率明显高于体外(P<0.01)。本研究虽然未观察体内人工授精后不同时间收集的COM中的精子AR状况， 但在体外COM获能培养系统中，3 h CHA精子AR率可达到34.5±5.3%，而且随培养时间的延长，AR率呈明显增加趋势(图2)，表明CHA精子获能与时间呈依赖关系。可见COM是CHA精子获能和AR的主要部位。GHCOM对CHA精子AR也具有一定的刺激作用，其作用发生于预培养5h；与CHACOM比较，获能时间明显滞后。由此推测，CHA精子获能时间至少3～5h。为何GHCOM对CHA精子获能也有作用?近几年来发现，COM可捕获和分泌P4[10]本实验结果也证明COM中存在较高的P4。近几年证明，P4对人及其他哺乳动物获能精子也具有促进AR作用，且无种属差异性。据Blackmore等[11]报道，P4可刺激胞外Ca2+内流，使胞内Ca2+浓度上升，从而激发精子AR。这种作用是通过位于精子表面GABAA样受体或GABAA/Cl-受体和Ca2+通道发挥作用[12，13]。这些结果表明，凡是获能的精子均可对P4的刺激引起AR。据此，P4可作为一种探针来鉴别精子是否获能。
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如前所述，获能的终点是发生AR，AR依赖于获能。AR又是受精的前提，只有发生AR的精子才能穿过ZP并与卵膜融合[1]。由此可见，AR是受精的关键步骤之一。WHO1992年已将精子AR能力作为评价精子受精功能的重要指标之一。然而，精子虽然获能，如无天然或人工激动剂存在，精子仍不能发生真正的AR。自发性AR虽可发生，但这种精子并无受精能力[1]。CHA精子在COM中可发生AR，7h AR率可达到76.5±7.0%，据此可推测，COM中必然存在着AR天然诱发因子。目前，一般认为ZP(主要是ZP3)和P4是体内AR的天然诱发因子[1，14]，而且发生AR的精子具有受精能力。但令人费解的是，单独的CHA卵ZP触发AR率明显低于COM组(表1)，也不能提高受精率[5]。这一结果与多数哺乳动物卵ZP是获能精子AR的诱发者相悖。这是否与我们未使用可溶性ZP糖蛋白有关，还是CHA是一种特殊种类，尚需积累更多的资料，才能下结论。
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COM可引起CHA精子获能，促进AR，从而提高受精能力，该因子存在于CC还是ECM中?本研究结果表明，这种激发因子是在ECM中而非CC本身(表1)。ECM广泛存在于机体各部位的组织中，以维持细胞的生存、分化和运动。但它们的成分不尽相同。近几年来，卵丘细胞及其细胞外基质在受精生物学中的作用日益引起人们的重视。据报道，COM除了捕获及分泌P4[10]和前列腺素外，其主要成分为GAG，包括HA、HE、几丁质、角蛋白和软骨素等。另外，其中HE可参与牛精子获能[9]，促进多种动物精子AR[13]。本研究结果证明，COM中存在P4、HA和HE，它们均可明显地促进CHA精子获能和获能精子发生AR(表2)。而且P4还可明显地提高CHA精子的受精能力(图4)。近年来，一些研究业已证明精子表面存在着上述相应配体的受体[1，4，11，13]。COM携带诱发AR的多种配体，通过配体-特异性受体-G蛋白介导-效应酶-胞内第二信使-效应器的信息传递方式，触发精子发生AR。这似与P4可促进人精子AR，从而提高受精率相一致。
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赵秀菊副研究员协助孕酮放免测定，特此致谢。
收稿1997-06 修回1997-09
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INITIATION OF THE ACROSOME REACTION IN CHINESE
HAMSTER SPERM BY CUMULUS OOPHORUS AND MATRIX
HAMSTER SPERM BY CUMULUS OOPHORUS AND MATRIX
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Yuan Yuying, Zhang Zhenhan, Shi Qixian
(Department of Reproductive Physiology, Institute of Materia Medica,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou)
To investigate effects of cumulus oophorus and matrix(COM) on capacitation, which can be estimated by the ability to undergo the acrosome reaction (AR) in response to agonists in Chinese hamster(CHA)sperm, the spermatozoa were incubated in the modified Tyrode solution(mTS) at 37℃ for1-7h in 95% air and 5% CO2 with COM,extracellular matrix (ECM),cumulus cells (CC) and COM-free.A significant stimulation of the AR in the presence of COM and ECM occurred but did not in CC and COM-free.The effect was in a time-dependent manner.Also,COM of golden hamster(GH) with ova markedly induced the AR in CHA spermatozoa.To examine what factor(s) in the COM induces the AR in CHA spermatozoa,glucosaminoglycans(GAG) and progesterone(P4) was separately determined by an alcian blue 8 GX method and radioassay.Hyaluronic acid (HA),heparin(HE) and P4 were found in the presence of ECM with ova in CHA.Treatment of preincubated CHA spermatozoa with GAG(1-10mg/L) resulted in an increase in the AR.This effect was in a concentration-dependent manner.Both HA(10mg/L and HE(5mg/L)caused a significant increase in the AR of capacitated spermatozoa in CHA.However,there was no potential effect on the AR when HA was added to the spermatozoa suspension containing HE or in the inverse order.Exposure of preincubated spermatozoa for 7h to P4(5-50μg/L) caused the AR with maximal responses at concentration of 25 mg/L,but uncapacitated spermatozoa preincubation for 1h did not stimulate the AR in response to the agonist.Therefore,P4 may be as a probe to identify whether sperms capacitated .The respones elicited by P4 was evaluated further by testing the effect of P4 on the ability of spermatozoa to penetrate zona-free hamster oocytes.Treatment of preincubated CHA spermatozoa with P4 (5-50μg/L) for 15min resulted in an increase in the proportion of ferti-lized oocytes.Maximal stimulatory effect was observed at 25μg/L P4.These results indicate that P4 and HA or HE in COM initiate the AR and P4 enhances the fertilizing ability of capacitated spermatozoa in CHA,and suggest that these factors in COM are involved in the modulation of spermatozoa AR and fertilization in CHA.
KEY WORDS Cumulus oophorus and matrix;Progesterone;Glycosaminoglycan;Acrosome reaction;Chinese hamster sperm
* 国家自然科学基金资助课题(No.39170411),浙江省自然科学基金资助课题(No.394056), http://www.100md.com(袁玉英 张振汉** 石其贤)