糖皮质激素对致痫大鼠的行为、脑电图和代谢型谷氨酸受体1α的影响*
作者：李正莉 朱长庚 魏瑛 马春玲
单位：同济医科大学解剖学教研室，武汉 430030
关键词：癫痫；马桑内酯；戊四氮；地塞米松；代谢型谷氨酸受体1α
解剖学报990205 【摘要】 目的 探讨糖皮质激素的抗痫效应。 方法 应用脑电图仪和免疫细胞化学方法，分别研究地塞米松对马桑内酯或戊四氮致痫大鼠的脑电图(EEG)和代谢型谷氨酸受体1α(mGluR1α)免疫反应性的影响，并观察大鼠行为的改变。 结果 大鼠注射马桑内酯或戊四氮前30min经静脉注入地塞米松，能防止严重的癫痫发作症状和脑电图中高电位的痫波发放，并能减少mGluR1α在海马区的表达。 结论 地塞米松具有抑制马桑内酯或戊四氮诱发癫痫的作用，海马内的mGluR1α可能在癫痫活动中起一定作用，地塞米松的抗痫效应可能与降低mGluR1α的表达有关。
THE INFLUENCE OF DEXAMETHASONE ON BEHAVIORS、EEG
, http://www.100md.com
AND METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR 1α
EXPRESSION IN THE SEIZURE RATS
Li Zhengli, Zhu ChanggengΔ, Wei Ying, Ma Chunling
(Department of Anatomy of Tongji Medical University,Wuhan)
【Abstract】 Objective To explore the anti-epilepsy effect of glucocorticoid. Method The influence of dexamethasone on EEG and the express of metabotropic glutamate receptor 1α were investigated in seizure rats induced by criaria lactone(CL) or pentylenetetrazole(PTZ) by means of the electroencephalogram instrument and method of immunocytochemistry.The changes of behaviors of the rats were also observed. Results The Dexamethasone administered i.v.in rats at 30min before the administration of CL or PTZ was able to prevent the appearance of high-voltage epileptiform discharges on EEG as well as serious behaviors of seizure,and to reduce the mGluR1α expression in the hippocampus. Conclusion Our results indicate that dexamethasone could produce an inhibition on the epileptiform activity induced by CL or PTZ.mGluR1α in the hippocampus might act on the epileptiform activity.Furthermore,the anti-epilepsy effects of dexamethasone might relate to reducing expression mGluR1α in the hippocampus.
, 百拇医药
【Key words】 Seizure;Criaria lactone; Pentylenetetrazole; Dexamethasone; Metabotropic glutamate receptor 1α
癫痫是神经系统的常见病，其病因复杂，发病机理至今未完全明了，给临床治疗带来了很大的困难。因此，深入研究癫痫的发病机制和探寻有效的治疗途径是神经科学工作者面临的重大课题。鉴于临床研究发现癫痫病人血清和脑脊液中有皮质醇水平降低[1]；我们前期的工作发现癫痫大鼠海马和大脑皮质内糖皮质激素受体明显减少[2]，电生理研究表明糖皮质激素(GC)具有抑制神经元兴奋性的作用[3，4]；提示糖皮质激素可能具有抗痫效应。为了进一步探讨这个问题，本研究拟观察糖皮质激素对癫痫模型大鼠的行为和脑电图(EEG)的影响。由于脑内谷氨酸与癫痫发病机制的关系密切，本研究还同时观察海马内代谢型谷氨酸受体1α(mGluR1α)的变化。旨在为糖皮质激素推广应用于癫痫治疗提供科学的、系统的实验资料。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 动物分组和动物模型准备
实验用SD雄性成年大鼠36只，体重160～220g，随机分为5组，即马桑内酯致痫组(CL组，8只)；糖皮质激素抗痫1组(GC+CL组，8只)；戊四氮致痫组(PTZ组，6只)；糖皮质激素抗痫2组(GC+PTZ组，6只；正常对照组(N组，8只)。
CL组大鼠在麻醉下固定于脑立体定位仪，于一侧侧脑室注入CL(50mg/kg体重)，注入后5min左右可诱发癫痫。PTZ组大鼠经腹腔注入PTZ(60mg/kg体重)，2min左右可诱发癫痫。GC+CL组和GC+PTZ组先经鼠尾静脉注入地塞米松(4mg/kg体重)，30min后再注入致痫剂CL或PTZ。正常对照组经侧脑室(4只)或腹腔(4只)注入与致痫剂等容量的生理盐水。
2. 行为观察
, 百拇医药
参考Diehl[5]的评估标准，将动物癫痫发作的行为表现分为6级。0级：无反应；Ⅰ级：须动，咀嚼；Ⅱ级：头面部抽搐；Ⅲ级：前肢或后肢抽搐；Ⅳ级：四肢节律性抽搐；Ⅴ级：四肢强直性抽搐，并伴甩尾或翻滚。观察各组大鼠的行为2h，记录痫性发作的潜伏期(即注入致痫剂到首次抽搐之间经历的时间)及发作程度。Ⅲ级及Ⅲ级以下表现为轻型发作，Ⅳ～Ⅴ级表现为重型发作。
3. 脑电图(EEG)描记及观察
采用日本San-EI 8导脑电图机记录部分动物EEG。在CL组和GC+CL组大鼠的一侧大脑皮质和海马放置不锈钢电极(直径0.5mm)，记录两组动物的大脑皮质和海马的EEG。在PTZ组和GC+PTZ组大鼠的一侧大脑皮质放置不锈钢电极，记录两组动物大脑皮质的EEG。当脑电图中出现尖波、棘波、尖(棘)慢综合波、多棘慢波时判定为痫样放电活动。
4. mGluR1α免疫细胞化学实验
, http://www.100md.com
选择CL组、GC+CL组和正常对照组大鼠的海马进行mGluR1α的免疫细胞化学实验。CL组和GC+CL组动物在注入CL后、正常对照组在侧脑室注入生理盐水后80～90min灌注。以ABC法行mGluR1α的免疫细胞化学染色，切片依次入兔抗mGluR1α血清(1∶2 000，由日本京都大学重本隆一和水野升教授惠赠)孵育48h，生物素化羊抗兔IgG(1∶300，Vector公司)孵育1h,SABC(1∶300，Vector公司)孵育1h，用GDN(葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺)法[6]显色10～15min。以上各步骤之间用0.01mol/L的PBS充分洗涤。
免疫染色对照实验：用正常牛血清白蛋白代替第1级抗体孵育切片。结果为阴性。
结 果
1. 行为表现
CL组：8只大鼠(100%)在注入CL后5min左右出现痫性发作，并逐渐加重，均发展到重型发作，持续2h以上。GC+CL组：8只大鼠(100%)在给予地塞米松后至致痫前表现明显的镇静效应，安静伏卧。给予CL后，8只大鼠(100%)痫性发作潜伏期延长，在15min左右出现痫性发作，表现为Ⅲ级及Ⅲ级以下的轻型发作，持续1h左右。PTZ组：6只大鼠(100%)在注入PTZ后1～2min出现突发性痫性发作，呈强直性躯干和四肢抽搐，这种重型发作症状持续5～10min，然后表现为四肢阵发性抽搐，持续约1h。GC+PTZ组：6只大鼠在注射地塞米松后安静伏卧，呼吸平稳。注射PTZ后，其中的4只(66%)约在10min左右出现轻型痫样发作，节律性上肢或下肢轻微抽搐，持续约20min，然后恢复正常。另2只呈抑制状态，无痫性发作。正常对照组：大鼠注入生理盐水后均无痫性发作。
, http://www.100md.com
2. 脑电图记录
CL组：在注入CL前各导联为以α和β波为主要节律的基础波，注入CL后2～3min出现中辐尖波；5～10min出现高辐尖波、棘波、棘慢波；10min至1h有阵发性短程和长程高辐多棘、多尖及多棘(尖)慢综合波(图1A)。GC+CL组：注入地塞米松前为基础波；注入地塞米松后EEG中无痫波出现，仍以低电位的α、β波为主要节律；注入CL后，10min左右出现散在中电位尖波；20至40min有阵发性短程中电位尖波出现，1h左右EEG基本恢复正常(图1B)。PTZ组：注入PTZ前大脑皮层EEG为基础波；注入PTZ后1至2min出现中电位尖波、棘波、棘慢波；逐渐转为高电位尖波、棘波、棘慢波，频繁发放，直至1h(图2A)。GC+PTZ组：注入地塞米松前后为以α和β波为主的基础波；注入PTZ后，5至20min有散在中电位尖波；30min左右EEG基本恢复正常(图2B)。无痫性发作大鼠的EEG基本正常。正常对照组：注入生理盐水前后均为正常基础波。
, 百拇医药
图1A 致痫剂马桑内酯诱导的脑电图效应。示注药前、后海马和额叶皮质的EEG记录
图1B 马桑内酯注入前30min给予地塞米松可以防止马桑内酯诱导的高电位痫波发放
Fig 1A EEG effects induced by epileptisant,coriaria lactone.EEG tracing from hippocampus(Hipp) and cortex(Cort) of pro-and postdrug periods.
Fig.1B Dexamethasone administered at 30 min before coriaria lactone is able to prevent coriaria lactone-induced the discharge of high-voltage epileptiform waves.
, 百拇医药
3. 海马部位mGluR1α免疫细胞化学观察
正常对照组：mGluR1α免疫反应性主要显示在海马的CA1、CA2(图3～5)、CA3(图6)区多形层神经纤维，部分多形层细胞(图4)和少数锥体层细胞(图5)，CA3区辐射层神经纤维(图6)，及齿状回多形层神经纤维(图7)。CL致痫组：与对照组相比，上述区域mGluR1α的免疫反应性明显增强，阳性纤维增多、增长，免疫染色加深。图8、9分别显示CL致痫组海马CA2区多形层、齿状回多形层mGluR1α免疫反应性。GC+CL组：糖皮质激素抗马桑内酯致痫组的mGluR1α免疫反应性比单纯马桑内酯致痫组明显降低，显示为免疫染色减弱，阳性纤维减少，而与正常对照组的免疫反应强度相似。图10、11分别显示本组大鼠海马CA2区多形层和齿状回多形层的mGluR1α免疫反应性。
图2A 致痫剂戊四氮诱导的脑电图效应。示注药前、后额叶皮质的EEG记录
, 百拇医药
图2B 戊四氮注入前30min给予地塞米松可以防止戊四氮诱导的高电位痫波发放
Fig.2A EEG effects induced by epileptisant,pentylenetetrazole.EEG tracing from cortex(Cort) of pro- and postdrug periods.
Fig.2B Dexamethasone administered at 30 min before pentylenetetrazole is able to provent pentylenetetrazole-induced the discharge of high- voltage epileptiform waves.
, 百拇医药
图3 示正常大鼠海马回CA2区多形层mGluR1α阳性纤维 ×20
Fig.3 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the hippocampus CA2 area in the normal rat. ×20
图4 示正常大鼠海马回多形细胞层mGluR1α阳性神经元(↑) ×10
Fig.4 The mGluR1α positive neurons(↑) in the polymorphous cell layer of the hippocampal gyrus in the normal rat. ×10
图5 示正常大鼠海马回锥体细胞层mGluR1α阳性神经元(↑) ×10
, http://www.100md.com
Fig.5 The mGluR1α positive neurons (↑) in the pyramidal cell layer of the hippocampal gyrus in the normal rat. ×10
图6 示海马回CA3区辐射层(
)和多形层(↑)mGluR1α阳性纤维 ×10
Fig.6 The mGluR1α positive fibers in the radiate layer() and the polymorphous cell layer(↑) of the hippocampus CA3 area in the normal rat. ×20
, 百拇医药
图7 示正常大鼠海马齿状回多形细胞层mGluR1α的阳性纤维 ×10
Fig.7 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the dentate gyrus of the hippocampus in the normal rat. ×10
图8 示癫痫大鼠海马回CA2区多形层mGluR1α阳性纤维，与正常大鼠相比，癫痫大鼠海马回、齿状回mGluR1α免疫反应性明显增强 ×20
Fig.8 Obviously increased mGluR1α immunoreactivity in the hippocampal gyrus and dentate gyrus of the seizure rat comparing with the normal rat.Fig 8.showed the mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the hippocampus CA2 area in seizure rat. ×20
, 百拇医药
图9 示癫痫大鼠海马齿状回多形细胞层mGluR1α阳性纤维 ×10
Fig.9 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the dentate gyrus of the hippocampus in the seizure rat. ×10
图10 示糖皮质激素抗痫大鼠海马CA2区多形层mGluR1α阳性纤维，与癫痫大鼠相比，糖皮质激素抗痫大鼠海马回、齿状回mGluR1α免疫反应性明显减弱 ×20
Fig.10 Obviously weaked mGluR1α immunoreactivity in the hippocampal gyrus and dentate gyrus of the anti-epilepsy rat by glucocorticoid comparing with the seizure rat.Fig.10 showed the mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the hippocampus CA2 area in the anti-epilepsy rat by glucocorticoid. ×20
, 百拇医药
图11 示糖皮质激素抗痫大鼠海马齿状回多形细胞层mGluR1α阳性纤维 ×10
Fig.11 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the dentate gyrus in the anti-epilepsy rat by glucocorticoid. ×20
讨 论
糖皮质激素为小分子的脂溶性甾体激素，易于透过血脑屏障入脑。海马区具有自发放电，激动阈值低的特点，与癫病的发病有密切的关系。而海马神经元含有大量的糖皮质激素受体，因此对血液循环中及脑脊液中糖皮质激素的变化非常敏感。已有研究表明，糖皮质激素对海马有明显的抑制作用[3]，它可增加海马神经元去极化末的后超级化幅度，提高兴奋阈，使神经元放电减慢或延搁，从而降低神经元的兴奋性。糖皮质激素的这种膜效应是近年所发现的一种非基因效应，表现快速，其作用机制可能与糖皮质激素直接或间接激活GABAA受体，使Cl-通道开放，细胞膜产生超级化有关[7]。有临床研究观察到癫痫病人的血清和脑脊液中皮质醇水平低于正常人[1]。我们的协作课题组研究发现，急性CL致痫大鼠的血清和脑组织中皮质醇水平也明显降低(待发表)。这说明糖皮质激素的降低可能首先因癫痫的发作所致。而在癫痫的发病过程中，皮质醇的降低又减弱了对海马兴奋性的抑制，进而促进了癫痫的发展。因而，给予糖皮质激素进行抗痫，具有临床和实验资料的支持。本实验通过对比观察致痫组和抗痫组动物的行为和脑电图记录，证实糖皮质激素不仅能延长致痫剂CL和PTZ诱导的痫性发作和痫波发放的潜伏期，而且能抑制和减轻痫性发作程度和持续时间，具有明显的抗痫效应。由于本实验验证了糖皮质激素拮抗两种不同的致痫剂所诱发的癫痫活动的效应，从而表明糖皮质激素的抗痫作用是比较确实的，而不是针对某种药物的特殊作用。过去在临床上，也曾有将糖皮质激素用于治疗某些难治性癫痫[8，9]和幼儿惊阙的报道。但是直至目前，糖皮质激素的抗痫效应并未受到临床上的广泛重视。分析原因，可能是因为其实验研究开展不够深入，很多问题尚未搞清，缺乏充足的实验资料支持，而本实验结果提供了这方面的动物研究资料，具有一定的基础和临床意义。
, 百拇医药
癫痫与谷氨酸和γ-氨基丁酸的关系是过去研究较多的内容，普遍认为癫痫的发病机制与脑内这两种氨基酸的含量和受体的消长密切相关[10]。谷氨酸受体分为离子型和代谢型(mGluR)两大类。mGluR有多种亚型[11]，其mGluR1还可进一步分1α、1β和1c。mGluR1和mGluR5为一组同源性受体，两者可使IP3形成，细胞内Ca2+增加[11]。通过此机制，mGluR1参与海马等脑区神经元兴奋性的调控。海马结构的构筑分为6层[12]，从脑室面向海马沟观察，依次分为槽层、多形细胞层、锥体细胞层、辐射层、腔隙层和分子层。齿状回分为3层，即分子层，颗粒细胞层和多形细胞层。海马回中最引人注目的主要细胞是锥体层细胞，锥体细胞从相对的两端发出树突，伸向多形层的称基树突，伸向辐射层的称顶树突。本实验显示多形层有大量mGluR1α阳性纤维，并且在致痫组大鼠明显增强，在糖皮质激素抗痫组大鼠明显减少。因为神经递质的受体位于突触后膜上，同时根据突触的形态学分类，已知绝大部分突触为轴-树型突触，在大脑皮质部位甚至高达98%[13]，因此我们分析，本实验显示的多形层mGluR1α阳性纤维，主要是树突成分，当其受体被兴奋时，可直接或间接引起锥体细胞的兴奋。齿状回是海马的主要传入部，在齿状回多形层内，也观察到很多mGluR1α阳性纤维，这些纤维可能一部分是齿状回多形层细胞的树突，一部分是颗粒层细胞发出的轴突(又称苔藓纤维)，后者穿过齿状回多形层至CA3区辐射层与锥体细胞顶树突形成突触，将兴奋从齿状回传至海马回。本实验中显示的CA3区辐射层内的mGluR1α阳性纤维可能是CA3区锥体细胞的顶树突。关于mGluR与癫痫的关系，过去研究较少，近年由于成功地克隆出mGluR分子的基因探针和制备出特异性抗体，已有这方面报道[14，15]。如发现用mGluR拮抗剂MCPG可抑制L-AP4的致痫活动。用mGluR激动剂ACPD可诱发大鼠痫性放电活动。在本实验中我们也观察到mGluR1α免疫反应在致痫组大鼠海马区明显增强，而在糖皮质激素抗痫组大鼠明显减少。根据海马结构的构筑结合本实验结果分析，海马内的mGluR1α在癫痫状态下较强的表达可以提高锥体层细胞的兴奋性和促进兴奋在齿状回和海马回之间的传递，进而参与癫痫的发病过程。虽然Aronica[15]等报道，mGluR1、mGluR3、mGluR5在Kanic acid诱导的大鼠癫痫状态中无变化。但我们分析，可能与所使用的致痫剂有关。而本实验中mGluR1α的免疫反应性在糖皮质激素抗痫组较单纯致痫组降低，与正常对照组相似，表明糖皮质激素和mGluR1α与癫痫的发病机制具有密切的关系，同时提示糖皮质激素的抗痫机制之一是通过抑制mGluR1的表达而实现的，作用机制可能与糖皮质激素的传统作用模式——基因调节机制有关。
, 百拇医药
综上所述，我们认为，糖皮质激素抗痫作用机制是多方面的，它既可通过非基因效应影响神经元的膜电位而抑制神经元的放电活动，又可通过基因效应调节神经元内递质、受体的基因表达而影响神经元的兴奋性。前者在早期数分钟内发生，后者效应在数小时甚至数天发生[7]。本研究为开发糖皮质激素作为治疗癫痫的新药提供了重要依据。
* 国家自然科学基金重点项目资助课题(No.39330210)
参考文献
[1]Ostrowska Z,Buntner B,Rosciszenska D,et al.Andrenal cortex hormones in male epileptic patients before and during 2-year phenytoin treatment.J Neurol Neurosury Psychiatry,1988,51(3):374
, 百拇医药
[2]李正莉，朱长庚，蔡秋云，等.癫痫大鼠海马和大脑皮质糖皮质激素受体变化的观察.解剖学报，1996，27(4)：359
[3]Joeles M,de-Kloet ER.Control of neuronal excitability by corticosteroid hormones.TINS,1992,15(1):25
[4]McEwen BS.Non-genomic and genomic effects of steroids on neural activity.Trend Pharmacol Sci,1991,12(4):141
[5]Dieh1 GR,Smialowski A,Gotwo T.Development and persistence of kindled seizures after repeated injection of pentylenetetrazol in rats and guinea pigs.Epilepsia,1984,259(4):506
, http://www.100md.com
[6]Shu S,Ju G,Fan L.The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemstry of the nervous system.Neurosci lett,1989,86(1),169
[7]张贤浦，邱学才.神经活性甾体激素的快速中枢效应.生理科学进展，1995，26(2)：163
[8]Holmes GL.Effect of non-sex homones on neuronal excitability,seizures,and electroencephalogram.Epilepsia,1991,32(suppl 6):S 11
[9]许国珍，郝桂珍，邹仁恕.地塞米松冲击治疗重症顽固性狼疮性癫痫.临床荟萃，1995，10(4)：663
, 百拇医药
[10]Glass M,Dragunow M.Neurochemical and morphological changes associated with human epilepsy.Brain Res Reviews,1995,21(1):29
[11]高天明，陈培熹.中枢兴奋性氨基酸受体分子特性的研究.生理科学进展，1994，25(3)：259
[12]王平宇主编.大白鼠中枢神经系统解剖学.北京：人民卫生出版社，1986：152～154
[13]朱长庚主编.化学神经解剖学.上海：上海科学技术出版社，1992：66～67
[14]Rutecki PA,Yang Y.Metabotropic glutamate receptor activation modulates epileptiform activity in the hippocampus.Neuroscience,1997,81(4):927
[15]Aronica EM,Gorter JA,Paupard MC,et al.Status epilepticus-induced alteration in metabotropic glutamate receptors expression in young and adult rats.J Neurosci,1997,12(21):8588, http://www.100md.com
单位：同济医科大学解剖学教研室，武汉 430030
关键词：癫痫；马桑内酯；戊四氮；地塞米松；代谢型谷氨酸受体1α
解剖学报990205 【摘要】 目的 探讨糖皮质激素的抗痫效应。 方法 应用脑电图仪和免疫细胞化学方法，分别研究地塞米松对马桑内酯或戊四氮致痫大鼠的脑电图(EEG)和代谢型谷氨酸受体1α(mGluR1α)免疫反应性的影响，并观察大鼠行为的改变。 结果 大鼠注射马桑内酯或戊四氮前30min经静脉注入地塞米松，能防止严重的癫痫发作症状和脑电图中高电位的痫波发放，并能减少mGluR1α在海马区的表达。 结论 地塞米松具有抑制马桑内酯或戊四氮诱发癫痫的作用，海马内的mGluR1α可能在癫痫活动中起一定作用，地塞米松的抗痫效应可能与降低mGluR1α的表达有关。
THE INFLUENCE OF DEXAMETHASONE ON BEHAVIORS、EEG
, http://www.100md.com
AND METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR 1α
EXPRESSION IN THE SEIZURE RATS
Li Zhengli, Zhu ChanggengΔ, Wei Ying, Ma Chunling
(Department of Anatomy of Tongji Medical University,Wuhan)
【Abstract】 Objective To explore the anti-epilepsy effect of glucocorticoid. Method The influence of dexamethasone on EEG and the express of metabotropic glutamate receptor 1α were investigated in seizure rats induced by criaria lactone(CL) or pentylenetetrazole(PTZ) by means of the electroencephalogram instrument and method of immunocytochemistry.The changes of behaviors of the rats were also observed. Results The Dexamethasone administered i.v.in rats at 30min before the administration of CL or PTZ was able to prevent the appearance of high-voltage epileptiform discharges on EEG as well as serious behaviors of seizure,and to reduce the mGluR1α expression in the hippocampus. Conclusion Our results indicate that dexamethasone could produce an inhibition on the epileptiform activity induced by CL or PTZ.mGluR1α in the hippocampus might act on the epileptiform activity.Furthermore,the anti-epilepsy effects of dexamethasone might relate to reducing expression mGluR1α in the hippocampus.
, 百拇医药
【Key words】 Seizure;Criaria lactone; Pentylenetetrazole; Dexamethasone; Metabotropic glutamate receptor 1α
癫痫是神经系统的常见病，其病因复杂，发病机理至今未完全明了，给临床治疗带来了很大的困难。因此，深入研究癫痫的发病机制和探寻有效的治疗途径是神经科学工作者面临的重大课题。鉴于临床研究发现癫痫病人血清和脑脊液中有皮质醇水平降低[1]；我们前期的工作发现癫痫大鼠海马和大脑皮质内糖皮质激素受体明显减少[2]，电生理研究表明糖皮质激素(GC)具有抑制神经元兴奋性的作用[3，4]；提示糖皮质激素可能具有抗痫效应。为了进一步探讨这个问题，本研究拟观察糖皮质激素对癫痫模型大鼠的行为和脑电图(EEG)的影响。由于脑内谷氨酸与癫痫发病机制的关系密切，本研究还同时观察海马内代谢型谷氨酸受体1α(mGluR1α)的变化。旨在为糖皮质激素推广应用于癫痫治疗提供科学的、系统的实验资料。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 动物分组和动物模型准备
实验用SD雄性成年大鼠36只，体重160～220g，随机分为5组，即马桑内酯致痫组(CL组，8只)；糖皮质激素抗痫1组(GC+CL组，8只)；戊四氮致痫组(PTZ组，6只)；糖皮质激素抗痫2组(GC+PTZ组，6只；正常对照组(N组，8只)。
CL组大鼠在麻醉下固定于脑立体定位仪，于一侧侧脑室注入CL(50mg/kg体重)，注入后5min左右可诱发癫痫。PTZ组大鼠经腹腔注入PTZ(60mg/kg体重)，2min左右可诱发癫痫。GC+CL组和GC+PTZ组先经鼠尾静脉注入地塞米松(4mg/kg体重)，30min后再注入致痫剂CL或PTZ。正常对照组经侧脑室(4只)或腹腔(4只)注入与致痫剂等容量的生理盐水。
2. 行为观察
, 百拇医药
参考Diehl[5]的评估标准，将动物癫痫发作的行为表现分为6级。0级：无反应；Ⅰ级：须动，咀嚼；Ⅱ级：头面部抽搐；Ⅲ级：前肢或后肢抽搐；Ⅳ级：四肢节律性抽搐；Ⅴ级：四肢强直性抽搐，并伴甩尾或翻滚。观察各组大鼠的行为2h，记录痫性发作的潜伏期(即注入致痫剂到首次抽搐之间经历的时间)及发作程度。Ⅲ级及Ⅲ级以下表现为轻型发作，Ⅳ～Ⅴ级表现为重型发作。
3. 脑电图(EEG)描记及观察
采用日本San-EI 8导脑电图机记录部分动物EEG。在CL组和GC+CL组大鼠的一侧大脑皮质和海马放置不锈钢电极(直径0.5mm)，记录两组动物的大脑皮质和海马的EEG。在PTZ组和GC+PTZ组大鼠的一侧大脑皮质放置不锈钢电极，记录两组动物大脑皮质的EEG。当脑电图中出现尖波、棘波、尖(棘)慢综合波、多棘慢波时判定为痫样放电活动。
4. mGluR1α免疫细胞化学实验
, http://www.100md.com
选择CL组、GC+CL组和正常对照组大鼠的海马进行mGluR1α的免疫细胞化学实验。CL组和GC+CL组动物在注入CL后、正常对照组在侧脑室注入生理盐水后80～90min灌注。以ABC法行mGluR1α的免疫细胞化学染色，切片依次入兔抗mGluR1α血清(1∶2 000，由日本京都大学重本隆一和水野升教授惠赠)孵育48h，生物素化羊抗兔IgG(1∶300，Vector公司)孵育1h,SABC(1∶300，Vector公司)孵育1h，用GDN(葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺)法[6]显色10～15min。以上各步骤之间用0.01mol/L的PBS充分洗涤。
免疫染色对照实验：用正常牛血清白蛋白代替第1级抗体孵育切片。结果为阴性。
结 果
1. 行为表现
CL组：8只大鼠(100%)在注入CL后5min左右出现痫性发作，并逐渐加重，均发展到重型发作，持续2h以上。GC+CL组：8只大鼠(100%)在给予地塞米松后至致痫前表现明显的镇静效应，安静伏卧。给予CL后，8只大鼠(100%)痫性发作潜伏期延长，在15min左右出现痫性发作，表现为Ⅲ级及Ⅲ级以下的轻型发作，持续1h左右。PTZ组：6只大鼠(100%)在注入PTZ后1～2min出现突发性痫性发作，呈强直性躯干和四肢抽搐，这种重型发作症状持续5～10min，然后表现为四肢阵发性抽搐，持续约1h。GC+PTZ组：6只大鼠在注射地塞米松后安静伏卧，呼吸平稳。注射PTZ后，其中的4只(66%)约在10min左右出现轻型痫样发作，节律性上肢或下肢轻微抽搐，持续约20min，然后恢复正常。另2只呈抑制状态，无痫性发作。正常对照组：大鼠注入生理盐水后均无痫性发作。
, http://www.100md.com
2. 脑电图记录
CL组：在注入CL前各导联为以α和β波为主要节律的基础波，注入CL后2～3min出现中辐尖波；5～10min出现高辐尖波、棘波、棘慢波；10min至1h有阵发性短程和长程高辐多棘、多尖及多棘(尖)慢综合波(图1A)。GC+CL组：注入地塞米松前为基础波；注入地塞米松后EEG中无痫波出现，仍以低电位的α、β波为主要节律；注入CL后，10min左右出现散在中电位尖波；20至40min有阵发性短程中电位尖波出现，1h左右EEG基本恢复正常(图1B)。PTZ组：注入PTZ前大脑皮层EEG为基础波；注入PTZ后1至2min出现中电位尖波、棘波、棘慢波；逐渐转为高电位尖波、棘波、棘慢波，频繁发放，直至1h(图2A)。GC+PTZ组：注入地塞米松前后为以α和β波为主的基础波；注入PTZ后，5至20min有散在中电位尖波；30min左右EEG基本恢复正常(图2B)。无痫性发作大鼠的EEG基本正常。正常对照组：注入生理盐水前后均为正常基础波。
, 百拇医药
图1A 致痫剂马桑内酯诱导的脑电图效应。示注药前、后海马和额叶皮质的EEG记录
图1B 马桑内酯注入前30min给予地塞米松可以防止马桑内酯诱导的高电位痫波发放
Fig 1A EEG effects induced by epileptisant,coriaria lactone.EEG tracing from hippocampus(Hipp) and cortex(Cort) of pro-and postdrug periods.
Fig.1B Dexamethasone administered at 30 min before coriaria lactone is able to prevent coriaria lactone-induced the discharge of high-voltage epileptiform waves.
, 百拇医药
3. 海马部位mGluR1α免疫细胞化学观察
正常对照组：mGluR1α免疫反应性主要显示在海马的CA1、CA2(图3～5)、CA3(图6)区多形层神经纤维，部分多形层细胞(图4)和少数锥体层细胞(图5)，CA3区辐射层神经纤维(图6)，及齿状回多形层神经纤维(图7)。CL致痫组：与对照组相比，上述区域mGluR1α的免疫反应性明显增强，阳性纤维增多、增长，免疫染色加深。图8、9分别显示CL致痫组海马CA2区多形层、齿状回多形层mGluR1α免疫反应性。GC+CL组：糖皮质激素抗马桑内酯致痫组的mGluR1α免疫反应性比单纯马桑内酯致痫组明显降低，显示为免疫染色减弱，阳性纤维减少，而与正常对照组的免疫反应强度相似。图10、11分别显示本组大鼠海马CA2区多形层和齿状回多形层的mGluR1α免疫反应性。
图2A 致痫剂戊四氮诱导的脑电图效应。示注药前、后额叶皮质的EEG记录
, 百拇医药
图2B 戊四氮注入前30min给予地塞米松可以防止戊四氮诱导的高电位痫波发放
Fig.2A EEG effects induced by epileptisant,pentylenetetrazole.EEG tracing from cortex(Cort) of pro- and postdrug periods.
Fig.2B Dexamethasone administered at 30 min before pentylenetetrazole is able to provent pentylenetetrazole-induced the discharge of high- voltage epileptiform waves.
, 百拇医药
图3 示正常大鼠海马回CA2区多形层mGluR1α阳性纤维 ×20
Fig.3 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the hippocampus CA2 area in the normal rat. ×20
图4 示正常大鼠海马回多形细胞层mGluR1α阳性神经元(↑) ×10
Fig.4 The mGluR1α positive neurons(↑) in the polymorphous cell layer of the hippocampal gyrus in the normal rat. ×10
图5 示正常大鼠海马回锥体细胞层mGluR1α阳性神经元(↑) ×10
, http://www.100md.com
Fig.5 The mGluR1α positive neurons (↑) in the pyramidal cell layer of the hippocampal gyrus in the normal rat. ×10
图6 示海马回CA3区辐射层(
)和多形层(↑)mGluR1α阳性纤维 ×10Fig.6 The mGluR1α positive fibers in the radiate layer(
) and the polymorphous cell layer(↑) of the hippocampus CA3 area in the normal rat. ×20, 百拇医药
图7 示正常大鼠海马齿状回多形细胞层mGluR1α的阳性纤维 ×10
Fig.7 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the dentate gyrus of the hippocampus in the normal rat. ×10
图8 示癫痫大鼠海马回CA2区多形层mGluR1α阳性纤维，与正常大鼠相比，癫痫大鼠海马回、齿状回mGluR1α免疫反应性明显增强 ×20
Fig.8 Obviously increased mGluR1α immunoreactivity in the hippocampal gyrus and dentate gyrus of the seizure rat comparing with the normal rat.Fig 8.showed the mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the hippocampus CA2 area in seizure rat. ×20
, 百拇医药
图9 示癫痫大鼠海马齿状回多形细胞层mGluR1α阳性纤维 ×10
Fig.9 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the dentate gyrus of the hippocampus in the seizure rat. ×10
图10 示糖皮质激素抗痫大鼠海马CA2区多形层mGluR1α阳性纤维，与癫痫大鼠相比，糖皮质激素抗痫大鼠海马回、齿状回mGluR1α免疫反应性明显减弱 ×20
Fig.10 Obviously weaked mGluR1α immunoreactivity in the hippocampal gyrus and dentate gyrus of the anti-epilepsy rat by glucocorticoid comparing with the seizure rat.Fig.10 showed the mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the hippocampus CA2 area in the anti-epilepsy rat by glucocorticoid. ×20
, 百拇医药
图11 示糖皮质激素抗痫大鼠海马齿状回多形细胞层mGluR1α阳性纤维 ×10
Fig.11 The mGluR1α positive fibers in the polymorphous cell layer of the dentate gyrus in the anti-epilepsy rat by glucocorticoid. ×20
讨 论
糖皮质激素为小分子的脂溶性甾体激素，易于透过血脑屏障入脑。海马区具有自发放电，激动阈值低的特点，与癫病的发病有密切的关系。而海马神经元含有大量的糖皮质激素受体，因此对血液循环中及脑脊液中糖皮质激素的变化非常敏感。已有研究表明，糖皮质激素对海马有明显的抑制作用[3]，它可增加海马神经元去极化末的后超级化幅度，提高兴奋阈，使神经元放电减慢或延搁，从而降低神经元的兴奋性。糖皮质激素的这种膜效应是近年所发现的一种非基因效应，表现快速，其作用机制可能与糖皮质激素直接或间接激活GABAA受体，使Cl-通道开放，细胞膜产生超级化有关[7]。有临床研究观察到癫痫病人的血清和脑脊液中皮质醇水平低于正常人[1]。我们的协作课题组研究发现，急性CL致痫大鼠的血清和脑组织中皮质醇水平也明显降低(待发表)。这说明糖皮质激素的降低可能首先因癫痫的发作所致。而在癫痫的发病过程中，皮质醇的降低又减弱了对海马兴奋性的抑制，进而促进了癫痫的发展。因而，给予糖皮质激素进行抗痫，具有临床和实验资料的支持。本实验通过对比观察致痫组和抗痫组动物的行为和脑电图记录，证实糖皮质激素不仅能延长致痫剂CL和PTZ诱导的痫性发作和痫波发放的潜伏期，而且能抑制和减轻痫性发作程度和持续时间，具有明显的抗痫效应。由于本实验验证了糖皮质激素拮抗两种不同的致痫剂所诱发的癫痫活动的效应，从而表明糖皮质激素的抗痫作用是比较确实的，而不是针对某种药物的特殊作用。过去在临床上，也曾有将糖皮质激素用于治疗某些难治性癫痫[8，9]和幼儿惊阙的报道。但是直至目前，糖皮质激素的抗痫效应并未受到临床上的广泛重视。分析原因，可能是因为其实验研究开展不够深入，很多问题尚未搞清，缺乏充足的实验资料支持，而本实验结果提供了这方面的动物研究资料，具有一定的基础和临床意义。
, 百拇医药
癫痫与谷氨酸和γ-氨基丁酸的关系是过去研究较多的内容，普遍认为癫痫的发病机制与脑内这两种氨基酸的含量和受体的消长密切相关[10]。谷氨酸受体分为离子型和代谢型(mGluR)两大类。mGluR有多种亚型[11]，其mGluR1还可进一步分1α、1β和1c。mGluR1和mGluR5为一组同源性受体，两者可使IP3形成，细胞内Ca2+增加[11]。通过此机制，mGluR1参与海马等脑区神经元兴奋性的调控。海马结构的构筑分为6层[12]，从脑室面向海马沟观察，依次分为槽层、多形细胞层、锥体细胞层、辐射层、腔隙层和分子层。齿状回分为3层，即分子层，颗粒细胞层和多形细胞层。海马回中最引人注目的主要细胞是锥体层细胞，锥体细胞从相对的两端发出树突，伸向多形层的称基树突，伸向辐射层的称顶树突。本实验显示多形层有大量mGluR1α阳性纤维，并且在致痫组大鼠明显增强，在糖皮质激素抗痫组大鼠明显减少。因为神经递质的受体位于突触后膜上，同时根据突触的形态学分类，已知绝大部分突触为轴-树型突触，在大脑皮质部位甚至高达98%[13]，因此我们分析，本实验显示的多形层mGluR1α阳性纤维，主要是树突成分，当其受体被兴奋时，可直接或间接引起锥体细胞的兴奋。齿状回是海马的主要传入部，在齿状回多形层内，也观察到很多mGluR1α阳性纤维，这些纤维可能一部分是齿状回多形层细胞的树突，一部分是颗粒层细胞发出的轴突(又称苔藓纤维)，后者穿过齿状回多形层至CA3区辐射层与锥体细胞顶树突形成突触，将兴奋从齿状回传至海马回。本实验中显示的CA3区辐射层内的mGluR1α阳性纤维可能是CA3区锥体细胞的顶树突。关于mGluR与癫痫的关系，过去研究较少，近年由于成功地克隆出mGluR分子的基因探针和制备出特异性抗体，已有这方面报道[14，15]。如发现用mGluR拮抗剂MCPG可抑制L-AP4的致痫活动。用mGluR激动剂ACPD可诱发大鼠痫性放电活动。在本实验中我们也观察到mGluR1α免疫反应在致痫组大鼠海马区明显增强，而在糖皮质激素抗痫组大鼠明显减少。根据海马结构的构筑结合本实验结果分析，海马内的mGluR1α在癫痫状态下较强的表达可以提高锥体层细胞的兴奋性和促进兴奋在齿状回和海马回之间的传递，进而参与癫痫的发病过程。虽然Aronica[15]等报道，mGluR1、mGluR3、mGluR5在Kanic acid诱导的大鼠癫痫状态中无变化。但我们分析，可能与所使用的致痫剂有关。而本实验中mGluR1α的免疫反应性在糖皮质激素抗痫组较单纯致痫组降低，与正常对照组相似，表明糖皮质激素和mGluR1α与癫痫的发病机制具有密切的关系，同时提示糖皮质激素的抗痫机制之一是通过抑制mGluR1的表达而实现的，作用机制可能与糖皮质激素的传统作用模式——基因调节机制有关。
, 百拇医药
综上所述，我们认为，糖皮质激素抗痫作用机制是多方面的，它既可通过非基因效应影响神经元的膜电位而抑制神经元的放电活动，又可通过基因效应调节神经元内递质、受体的基因表达而影响神经元的兴奋性。前者在早期数分钟内发生，后者效应在数小时甚至数天发生[7]。本研究为开发糖皮质激素作为治疗癫痫的新药提供了重要依据。
* 国家自然科学基金重点项目资助课题(No.39330210)
参考文献
[1]Ostrowska Z,Buntner B,Rosciszenska D,et al.Andrenal cortex hormones in male epileptic patients before and during 2-year phenytoin treatment.J Neurol Neurosury Psychiatry,1988,51(3):374
, 百拇医药
[2]李正莉，朱长庚，蔡秋云，等.癫痫大鼠海马和大脑皮质糖皮质激素受体变化的观察.解剖学报，1996，27(4)：359
[3]Joeles M,de-Kloet ER.Control of neuronal excitability by corticosteroid hormones.TINS,1992,15(1):25
[4]McEwen BS.Non-genomic and genomic effects of steroids on neural activity.Trend Pharmacol Sci,1991,12(4):141
[5]Dieh1 GR,Smialowski A,Gotwo T.Development and persistence of kindled seizures after repeated injection of pentylenetetrazol in rats and guinea pigs.Epilepsia,1984,259(4):506
, http://www.100md.com
[6]Shu S,Ju G,Fan L.The glucose oxidase-DAB-nickel method in peroxidase histochemstry of the nervous system.Neurosci lett,1989,86(1),169
[7]张贤浦，邱学才.神经活性甾体激素的快速中枢效应.生理科学进展，1995，26(2)：163
[8]Holmes GL.Effect of non-sex homones on neuronal excitability,seizures,and electroencephalogram.Epilepsia,1991,32(suppl 6):S 11
[9]许国珍，郝桂珍，邹仁恕.地塞米松冲击治疗重症顽固性狼疮性癫痫.临床荟萃，1995，10(4)：663
, 百拇医药
[10]Glass M,Dragunow M.Neurochemical and morphological changes associated with human epilepsy.Brain Res Reviews,1995,21(1):29
[11]高天明，陈培熹.中枢兴奋性氨基酸受体分子特性的研究.生理科学进展，1994，25(3)：259
[12]王平宇主编.大白鼠中枢神经系统解剖学.北京：人民卫生出版社，1986：152～154
[13]朱长庚主编.化学神经解剖学.上海：上海科学技术出版社，1992：66～67
[14]Rutecki PA,Yang Y.Metabotropic glutamate receptor activation modulates epileptiform activity in the hippocampus.Neuroscience,1997,81(4):927
[15]Aronica EM,Gorter JA,Paupard MC,et al.Status epilepticus-induced alteration in metabotropic glutamate receptors expression in young and adult rats.J Neurosci,1997,12(21):8588, http://www.100md.com