猪肾脏中表皮生长因子mRNA活性的研究
作者：严云勤 张黎霞 谭景和
单位：严云勤 张黎霞 谭景和 东北农业大学动物组织学与胚胎学教研室，哈尔滨 150030
关键词：表皮生长因子；RT-PCR；肾皮质
解剖学报990223
【摘要】 目的 研究表皮生长因子(EGF)基因在猪肾脏中的表达部位。 方法 采用RT-PCR技术分别检测猪肾皮质和髓质中的EGF mRNA活性。 结果 公猪和母猪肾皮质中的EGF mRNA活性均很高，而髓质中则无EGF mRNA活性。 结论 EGF仅在猪肾脏皮质中表达，无性别差异。
A STUDY ON EXPRESSION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR GENE IN THE PIG KIDNEY
, 百拇医药
Yan Yunqin△, Zhang Lixia, Tan Jinghe
(Northeast Agricultural University, Harbin)
【Abstract】 Objective To study the localizaion of EGF gene expression in porcine kidney. Methods The level of EGF mRNA in the cortex and medulla of porcine kidney was measured by RT-PCR technique. Results In both male and female pigs, a high level of EGF mRNA was detected in the cortex but no EGF mRNA activity was found in the medulla. Conclusions The cortex is the only part where EGF was expressed and there was no significant sex-related difference in the expression of EGF in porcine kidney.
, 百拇医药
【Key words】 Epidermal growth factor; RT-PCR; Kidney cortex
表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，分子量大约6kD。它分布广泛，具有刺激各种类型细胞增殖的作用。在体外，EGF可促进皮肤、肺和乳腺等处的上皮细胞增殖和分化[1]。1985年，Rall等[2]发现，小鼠的肾脏中有很高的EGFmRNA活性。1991年，Vaughan等[1]应用Northern杂交技术和免疫组织化学技术对猪几种组织中EGF的基因表达进行了研究。结果发现，猪肾脏中EGF和EGFmRNA的活性都很高，主要分布在远曲小管中。然而，也有些资料显示，肾脏的其他部位也表达EGF[3]。为进一步确定EGF在肾脏中表达的部位，我们采用灵敏度更高的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分别检测了不同性别猪肾脏的皮质和髓质中EGFmRNA的活性。
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材料和方法
1.总RNA提取
取刚屠杀的公猪和母猪的肾脏，分别剪取皮质部和髓质部组织约100mg。采用由GIBCO BRL生产的总RNA分离试剂盒TRIZOL Reagent分离总RNA。分离纯化的RNA沉淀物，空气干燥10min，用经DEPC处理消除RNA酶的三蒸水溶解。溶解后的RNA样品，取一部分经紫外分光光度计检测浓度，其余的-70℃保存待用。
2.引物
猪的EGF PCR引物是按照Singh等[4]报道的序列，由中国科学院微生物研究所合成的。EGF上游引物的序列为：5’-TCTGAACCCGGACGG-ATTG-3’；下游引物的序列为：5’-GACATCGCTCGCGAACGTAG-3’。由此对引物扩增出的DNA片段长度是214 bp。
, http://www.100md.com
此外，由于β-肌动蛋白(β-actin)几乎存在于所有细胞中，为检测所提取的总RNA的完整性，还按照Tokunaga等[5]的资料，合成了一对β-actin的PCR引物。上游引物的序列为：5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3'；下游引物的序列为：5’-TTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3’。另外，由于用这对引物扩增来的DNA片段内含有一个内含子，故还可用来区分所获得的PCR产物是由mRNA反转录的cDNA扩增来的，还是由污染的基因组DNA扩增来的。
3.RT-PCR
3.1 反转录：将总RNA样品稀释至1g/L，取5μl，(即5μg)进行反转录。反应物总体积为20μl，其中含有3mmol/L MgCl2；60mmol/L KCl；50mmol/L Tris-HCl，pH8.3；1mmol/L dNTP；EGF下游引物50ng；RNase抑制剂40U；禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶20U。以上药品除引物外，均为美国Promega公司产品。反应条件是：42℃；孵育1.5h。反应结束后，先在95℃下作用5min，使酶灭活；再置于冰上冷却5min。
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3.2 PCR扩增：把上述反转录合成的cDNA置PCR仪(美国基因公司生产，型号：PTC-150)内，进行扩增。反应物总体积100μl，其中含20μl cDNA、10mmol/L Tris-HCl, pH8.3、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、1mmol/L dNTP、EGF上游引物50ng、5μl甘油、5μl二甲亚砜(美国Signma公司)、Tag酶5U(美国Promega公司)。PCR扩增条件如下：94℃变性40s；55℃退火40s；72℃延伸1min；反复循环35次。最后经72℃延伸5min完成反应。
4.PCR产物的检测及进一步确认
PCR扩增产物在含0.5mg/L溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶中进行电脉，紫外线观察并摄片。
在本实验经PCR扩增获得的猪EGF DNA片段(214bp)中，有一个限制性酶RsaⅠ的酶切位点。用RsaⅠ酶切后，该片段预定产生119 bp和95 bp两个DNA片段，以此便验证PCR产物的真实性。
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结果和讨论
公母猪新鲜肾脏9枚。提取总RNA后，经紫外分光光度计检测证明其含量达3～4μg/mg组织；A260/280约为2.0，符合RT-PCR要求。
把猪肾脏皮质和髓质的RT-PCR反应产物同时进行电泳，结果只有在肾皮质检测到非常强的EGF mNRA活性，而髓质则没有检测到EGF的表达(图1)。而且，在肾皮质RT-PCR产物的电泳图谱中，只出现1条非常清晰的214bp的谱带，即预定的EGF谱带。说明本实验中的RT-PCR反应专一性很强。
把扩增的214 bp的EGF产物用RsaⅠ限制性内切酶酶切后，产出了所预期的119 bp和95 bp两条带(图2)，这进一步证实，所扩增出来的DNA片段是EGF的DNA片段。
作为对照，还取部分总RNA进行了β-actin RT-PCR检测。结果出现了所预期的243bp带。这进一步证明，本实验结果并不是因基因组DNA污染所造成的假阳性结果。
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上述实验结果进一步证实了Vaughan等[1]用Northern原位杂交方法检测到猪肾远曲小管有很强的EGF mRNA活性的报道，排除了集合管及其他髓质部分有EGF mRNA活性的可能性。
本实验中，9枚猪肾皮质的EGF谱带均未见明显差异，说明公猪和母猪肾脏中EGF的表达无明显差异。
图1 EGF mRNA在猪肾脏中的表达。A.肾皮质部 B.DNA分子量标准，PBR322 DNA/HinfI酶切 C.肾髓质部Fig.1 Expression of EGF mRNA in pig kidney.A：Renal cortex;B：DNA marker,PBR322 DNA/Hinf I digested;C：Renal medulla.
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图2 EGF RT-PCR产物Rsa I酶切图谱。A.DNA分子量标准，PBR322 Bst NI酶切；B.酶切产物，95bp和119bp；C.未经酶切的RT-PCR产物，214bp
Fig.2 Digestion of EGF RT-PCR product with the restriction enzyme Rsa I.A：DNA marker,PBR 322 Bst NI digested; B：The digested RT-PCR product, showing 2 bands of 95bp and 119 bp; C：The RT-PCR product before digestion with only one band of 214 bp.
参考文献
[1]Vaughan TJ, Pascall JC, James S, et al. Expression of epidermal growth factor and its mRNA in pig kidney, pancreas and other tissues. Biochem J, 1991, 279(1):315
, http://www.100md.com
[2]Rall LB, Scott J, Bell GI, et al. Mouse prepro-epidermal factor synthesis by the kidney and other tissues. Nature, 1985, 313(5999):228
[3]魏林，王海燕，章有康，等.表皮生长因子及其受体在人类肾脏病中的表达的研究.中华肾脏病杂志，1997，13(3)：173
[4]Singh B, Rutledge JM, Armstrong DT. Epidermal growth factor and its receptor gene expression and peptide localization in porcine ovarian follicles. Mol Reprod Dev, 1995, 40(3):391
[5]Tokunaga K, Taniguchi H, Yoda K, et al: Nucleotide sequence of a full length cDNA for cytoskeletal β-actin mRNA. Nucleic Acids Res, 1986, 14(6):2829, http://www.100md.com
单位：严云勤 张黎霞 谭景和 东北农业大学动物组织学与胚胎学教研室，哈尔滨 150030
关键词：表皮生长因子；RT-PCR；肾皮质
解剖学报990223
【摘要】 目的 研究表皮生长因子(EGF)基因在猪肾脏中的表达部位。 方法 采用RT-PCR技术分别检测猪肾皮质和髓质中的EGF mRNA活性。 结果 公猪和母猪肾皮质中的EGF mRNA活性均很高，而髓质中则无EGF mRNA活性。 结论 EGF仅在猪肾脏皮质中表达，无性别差异。
A STUDY ON EXPRESSION OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR GENE IN THE PIG KIDNEY
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Yan Yunqin△, Zhang Lixia, Tan Jinghe
(Northeast Agricultural University, Harbin)
【Abstract】 Objective To study the localizaion of EGF gene expression in porcine kidney. Methods The level of EGF mRNA in the cortex and medulla of porcine kidney was measured by RT-PCR technique. Results In both male and female pigs, a high level of EGF mRNA was detected in the cortex but no EGF mRNA activity was found in the medulla. Conclusions The cortex is the only part where EGF was expressed and there was no significant sex-related difference in the expression of EGF in porcine kidney.
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【Key words】 Epidermal growth factor; RT-PCR; Kidney cortex
表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，分子量大约6kD。它分布广泛，具有刺激各种类型细胞增殖的作用。在体外，EGF可促进皮肤、肺和乳腺等处的上皮细胞增殖和分化[1]。1985年，Rall等[2]发现，小鼠的肾脏中有很高的EGFmRNA活性。1991年，Vaughan等[1]应用Northern杂交技术和免疫组织化学技术对猪几种组织中EGF的基因表达进行了研究。结果发现，猪肾脏中EGF和EGFmRNA的活性都很高，主要分布在远曲小管中。然而，也有些资料显示，肾脏的其他部位也表达EGF[3]。为进一步确定EGF在肾脏中表达的部位，我们采用灵敏度更高的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分别检测了不同性别猪肾脏的皮质和髓质中EGFmRNA的活性。
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材料和方法
1.总RNA提取
取刚屠杀的公猪和母猪的肾脏，分别剪取皮质部和髓质部组织约100mg。采用由GIBCO BRL生产的总RNA分离试剂盒TRIZOL Reagent分离总RNA。分离纯化的RNA沉淀物，空气干燥10min，用经DEPC处理消除RNA酶的三蒸水溶解。溶解后的RNA样品，取一部分经紫外分光光度计检测浓度，其余的-70℃保存待用。
2.引物
猪的EGF PCR引物是按照Singh等[4]报道的序列，由中国科学院微生物研究所合成的。EGF上游引物的序列为：5’-TCTGAACCCGGACGG-ATTG-3’；下游引物的序列为：5’-GACATCGCTCGCGAACGTAG-3’。由此对引物扩增出的DNA片段长度是214 bp。
, http://www.100md.com
此外，由于β-肌动蛋白(β-actin)几乎存在于所有细胞中，为检测所提取的总RNA的完整性，还按照Tokunaga等[5]的资料，合成了一对β-actin的PCR引物。上游引物的序列为：5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3'；下游引物的序列为：5’-TTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3’。另外，由于用这对引物扩增来的DNA片段内含有一个内含子，故还可用来区分所获得的PCR产物是由mRNA反转录的cDNA扩增来的，还是由污染的基因组DNA扩增来的。
3.RT-PCR
3.1 反转录：将总RNA样品稀释至1g/L，取5μl，(即5μg)进行反转录。反应物总体积为20μl，其中含有3mmol/L MgCl2；60mmol/L KCl；50mmol/L Tris-HCl，pH8.3；1mmol/L dNTP；EGF下游引物50ng；RNase抑制剂40U；禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶20U。以上药品除引物外，均为美国Promega公司产品。反应条件是：42℃；孵育1.5h。反应结束后，先在95℃下作用5min，使酶灭活；再置于冰上冷却5min。
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3.2 PCR扩增：把上述反转录合成的cDNA置PCR仪(美国基因公司生产，型号：PTC-150)内，进行扩增。反应物总体积100μl，其中含20μl cDNA、10mmol/L Tris-HCl, pH8.3、50mmol/L KCl、2.5mmol/L MgCl2、1mmol/L dNTP、EGF上游引物50ng、5μl甘油、5μl二甲亚砜(美国Signma公司)、Tag酶5U(美国Promega公司)。PCR扩增条件如下：94℃变性40s；55℃退火40s；72℃延伸1min；反复循环35次。最后经72℃延伸5min完成反应。
4.PCR产物的检测及进一步确认
PCR扩增产物在含0.5mg/L溴化乙锭的1.8%琼脂糖凝胶中进行电脉，紫外线观察并摄片。
在本实验经PCR扩增获得的猪EGF DNA片段(214bp)中，有一个限制性酶RsaⅠ的酶切位点。用RsaⅠ酶切后，该片段预定产生119 bp和95 bp两个DNA片段，以此便验证PCR产物的真实性。
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结果和讨论
公母猪新鲜肾脏9枚。提取总RNA后，经紫外分光光度计检测证明其含量达3～4μg/mg组织；A260/280约为2.0，符合RT-PCR要求。
把猪肾脏皮质和髓质的RT-PCR反应产物同时进行电泳，结果只有在肾皮质检测到非常强的EGF mNRA活性，而髓质则没有检测到EGF的表达(图1)。而且，在肾皮质RT-PCR产物的电泳图谱中，只出现1条非常清晰的214bp的谱带，即预定的EGF谱带。说明本实验中的RT-PCR反应专一性很强。
把扩增的214 bp的EGF产物用RsaⅠ限制性内切酶酶切后，产出了所预期的119 bp和95 bp两条带(图2)，这进一步证实，所扩增出来的DNA片段是EGF的DNA片段。
作为对照，还取部分总RNA进行了β-actin RT-PCR检测。结果出现了所预期的243bp带。这进一步证明，本实验结果并不是因基因组DNA污染所造成的假阳性结果。
, 百拇医药
上述实验结果进一步证实了Vaughan等[1]用Northern原位杂交方法检测到猪肾远曲小管有很强的EGF mRNA活性的报道，排除了集合管及其他髓质部分有EGF mRNA活性的可能性。
本实验中，9枚猪肾皮质的EGF谱带均未见明显差异，说明公猪和母猪肾脏中EGF的表达无明显差异。
图1 EGF mRNA在猪肾脏中的表达。A.肾皮质部 B.DNA分子量标准，PBR322 DNA/HinfI酶切 C.肾髓质部Fig.1 Expression of EGF mRNA in pig kidney.A：Renal cortex;B：DNA marker,PBR322 DNA/Hinf I digested;C：Renal medulla.
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图2 EGF RT-PCR产物Rsa I酶切图谱。A.DNA分子量标准，PBR322 Bst NI酶切；B.酶切产物，95bp和119bp；C.未经酶切的RT-PCR产物，214bp
Fig.2 Digestion of EGF RT-PCR product with the restriction enzyme Rsa I.A：DNA marker,PBR 322 Bst NI digested; B：The digested RT-PCR product, showing 2 bands of 95bp and 119 bp; C：The RT-PCR product before digestion with only one band of 214 bp.
参考文献
[1]Vaughan TJ, Pascall JC, James S, et al. Expression of epidermal growth factor and its mRNA in pig kidney, pancreas and other tissues. Biochem J, 1991, 279(1):315
, http://www.100md.com
[2]Rall LB, Scott J, Bell GI, et al. Mouse prepro-epidermal factor synthesis by the kidney and other tissues. Nature, 1985, 313(5999):228
[3]魏林，王海燕，章有康，等.表皮生长因子及其受体在人类肾脏病中的表达的研究.中华肾脏病杂志，1997，13(3)：173
[4]Singh B, Rutledge JM, Armstrong DT. Epidermal growth factor and its receptor gene expression and peptide localization in porcine ovarian follicles. Mol Reprod Dev, 1995, 40(3):391
[5]Tokunaga K, Taniguchi H, Yoda K, et al: Nucleotide sequence of a full length cDNA for cytoskeletal β-actin mRNA. Nucleic Acids Res, 1986, 14(6):2829, http://www.100md.com