人酪氨酸羟化酶RNA探针制备的研究＊

http://www.100md.com 《解剖学报》 1999年第3期

     作者：李淑婷 杨慧 张进禄 蔡青 徐群渊

    单位：李淑婷 杨慧 张进禄 蔡青 徐群渊(首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100054)

    关键词：人酪氨酸羟化酶基因；质粒pGEMTH2；地高辛精标记RNA探针；斑点杂交

    解剖学报990313

    【摘要】 目的 制备地高辛标记的人酪氨酸羟化酶(hTH₂)cRNA探针。 方法 用分子克隆技术重组质粒pGEMTH₂。用体外转录法制备地高辛标记hTH₂cRNA探针，经限制性内切酶分析，显示重组质粒含有酪氨酸羟化酶基因片段，且插入位点正确。使用斑点杂交证实我们制备的探针是敏感而可靠的。 结果 杂交阳性部位呈紫蓝色，深浅与稀释度成正比。 结论 Dig标记的hTH₂cRNA探针有较好的敏感性和可靠性，可用于基因治疗帕金森病动物模型基因表达的研究。

    PREPARATION OF A RNA PROBE FOR HUMAN

    TYROSINE HYDROXYLASE

    Li Shuting, Yang Hui^Δ, Zhang Jinlu, Cai Qing, Xun Qunyuan

    (Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing)

    【Abstract】 Objective To prepare a digoxingen-labelled cRNA probe for human tyrosine hydroxylase(hTH₂).Methods Using molecular cloning techniques the recombinant plasmid pGEMTH₂ was constructed.According to analysis of restriction endonucleases,the pGEMTH₂ contained the DNA fragment of hTH₂ gene and inserting sit preparation was correct for cRNA-probe.From recombinant plasmid pGEMTH₂ prepared cRNA probe was identified by dot blot hybridization.Results The dot blot hybridization showed that the positive reaction sites were purple-blue.Conclusion This probe prepared in present study was sensitive and reliable.This probe might provide a tool for identifying the effect of gene therapy in animal model of Parkinson disease.

    【Key words】 Human tyrosine hydroxylase; pGEMTH₂; Dig-labeled RNA probes; Dot blot hybridization

    在基因治疗帕金森病(Parkinsion disease,PD)的实验研究中，人们应用再生成左旋多巴(L-dopa)和多巴胺(dopamine,DA)这一生化反应中起关键作用的限速酶——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因，做为目的基因所进行的一系列的研究取得了一些进展^[1，2]。但是，这些研究多局限于大鼠模型，灵长类动物模型基因治疗的研究工作还刚刚开始。针对目前正在进行的基因治疗PD灵长类模型实验研究中，应用原位杂交方法检测TH基因的体内表达水平的需要，合成可靠和实用性强的人THRNA探针应有重要实用意义。

    材料和方法

    1. 质粒pGEMTH₂的重组

    方法主要参照《分子克隆实验指南》^[3]

    将质粒pGEM-3zf(华美公司)和质粒phTH₂(美国Somatix Therapy Corporation)分别用限制性内切酶EcoRI在37℃下消化1h，得到线性化的质粒pGEM-3zf和不同的DNA片段；对酶切后的DNA片段行1%琼脂糖凝胶(上海生化试剂公司进口分装)电泳并取下来自质粒pGEM-3zf的3.199kb片段和来自质粒phTH₂的1.832kb片段；用GENE-CLEAN药盒(BIO 101)对其进行纯化，即先将切割下来的带有DNA片段的琼脂糖凝胶在50℃溶解于NaI中，以GLASSMILK吸附溶液中DNA，用缓冲液冲洗3次去除杂质后，再将DNA在50℃溶解于水中得到纯化的3.199kb和1.832kb的DNA片段。然后将3.199kb片段在50℃条件下进行去磷酸化反应(1h)，经常规抽提后溶解于水中，得到去除磷酸化的3.199kb DNA片段；将上述纯化的1.832kb DNA片段和去磷酸化后的3.199kb的DNA片段按等摩尔浓度混合。加入T4连接酶(PROMEGA) 3个单位在16℃条件下行连接反应16h；以CaCl₂法将大肠杆菌XL-1 Blue制备成感受态细胞，加入经连接反应后的混合物冰浴45min，再通过热休克法使DNA进入感受态细胞；将这些细胞悬浮培养在LB(PROMEGA)培养液中，37℃，1h，然后铺在含氨苄青霉素(AMP，5g/L)的LB琼脂培养基上，37℃，16h，共得到63个菌落。

    在培养基上随机取12个菌落，分别置入含有5 ml LB和AMP的12支长试管(20 ml)中进行悬浮培养(37℃，16h)；用煮沸法小量从细菌中提取质粒；将培养物离心收获细菌，重悬于STET中，加入溶菌酶(10g/L)，混匀后于100℃水浴中加热40s以裂解细菌；离心收集富含DNA质粒的上清液并用常规方法进行沉淀，将12个试管中提取的质粒DNA用限制性内切酶EcoRI消化(37℃，1h)在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以确定拟构建的质粒是否符合设计要求。

    经确定为pGEMTH₂质粒后，用碱裂解法大量制备这些质粒，即将100ml菌液离心沉淀，收集出细菌重悬于溶液I(50mmol/L葡萄糖，250mmol/L Tris pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0，溶菌酶10g/L)中，加入溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1% SDS)和溶液Ⅲ(3mol/L醋酸钾)裂解细菌；离心收集富含质粒DNA的上清，酚/氯仿抽提，去除蛋白杂质，常规方法沉淀DNA，这样，100ml菌液可得到300μg pGEMTH₂质粒。

    2. RNA探针的制备

    将上述所制备的pGEMTH₂质粒用限制性内切酶XhoI在37℃温度下进行消化，用GENECLEAN药盒纯化，收集TH基因片段；对此片段在绝对无RNA酶的条件下用地高辛RNA标记药盒进行转录标记反应(总体积20μl,37℃,2h)，反应体系中含10mmol/L DTT,RNA酶抑制剂20U，ATP，CTP，GTP各1mmol/L, UTP 0.65mmol/L及有地高辛标记的UTP 0.35mmol/L,1.0μg的人TH线性DNA模板和30U的RNA聚合酶37℃ 2h。用限制性内切酶SmaI 25℃消化30min，然后用pH8.0的EDTA 20mmol/L终止反应，加1/10体积的4mol/L LiCl和3倍体积的无水乙醇，在-70℃下，30min沉淀探针，用75%冷乙醇洗涤2次，最后溶解于DEPC处理过的水中，加入RNA酶抑制剂(10IU/L)分装于小试管中，在-80℃下储存。

    3. 地高辛标记探针的杂交与检测

    参照文献[3]进行斑点杂交。

    先将含有探针序列的质粒pGEMTH₂和phTH₂加热变性，用DEPC处理过的水进行稀释(稀释浓度为1g/L，0.1g/L和0.01g/L)，然后将稀释的DNA按不同浓度梯度点于尼龙膜上，固定DNA，将膜置于80℃，2h。进行预杂交42℃摇动2h，预杂交液中含有0.75mol/L NaCl,0.1%N-十二烷基肌氨酸，0.02%SDS和1%BSA。在上述体系中加入人TH RNA地高辛标记探针(10μg/ml)进行杂交，在42℃摇动16h，杂交后依次用2×SSC和0.1×SSC洗涤各15min，再用缓冲液洗涤1次。缓冲液中含有0.15mol/L NaCl,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5)。用3%BSA封闭非特异性抗原，加地高辛抗体(1∶5 000)室温下温育2h，洗涤后用NBT-BCIP室温显色10min。

    结果

    1. 构建质粒pGEMTH₂

    技术路线见图1。

    质粒pGEM-3zf在限制性内切酶EcoRI消化后经分离纯化、去磷酸化得到线状3.199kb片段，质粒phTH₂也经相同限制性内切酶处理并经分离纯化得到1.832kb片段。这些片段在1%琼脂糖凝胶上清晰可见，将上述DNA片段进行亚克隆后随机取12个克隆小量提取质粒。它们经限制性内切酶EcoRI消化并行电泳分析后，证明重组质粒除5号外全部带有插入的TH基因(图2)经限制性内切酶PstI分别对其中4个质粒进行插入方向鉴定，用XbaI进行重复鉴定结果均证明含正、反插入方向各占50%(图3)。

    2. RNA探针制备

    质粒pGEMTH₂经限制性内切酶XhoI消化，用GENECLEAN药盒纯化后得到线状TH模板DNA(图4)。上述线性模板DNA片段用地高辛RNA标记药盒进行RNA探针的逆转录，标记合成反应，得到反应产物即探针，探针总长度经计算为1.404kb。合成反应后经用限制性内切酶SamI消化分别得到0.230kb、0.691kb、0.314kb和0.175kb混合探针。

    图1 pGEMTH₂构建途径

    Fig.1 The way of subcloning pGEMTH₂ plasmid

    图2 重组后pGEMTH₂ 12个克隆，经EcoRI消化后的电泳结果。A.λ DNA/EcoRI,Hind Ⅲ DNA marker; B.2～13为1～12号pGEMTH₂/EcoRI样品DNA；1%琼脂糖凝胶，电压50V，1h

    Fig.2 The electrophoresis of pGEMTH₂ from 12 Subclones digested by EcoRI.A，λDNA/EcoRI,HindⅢ DNA marker; B，2-13 indicate different samples of pGEMTH₂/EcoRI from No.1 to No.12 1% agarose gel,Voltage 50V,1hour

    图3 pGEMTH₂的9～12号样品在Pst I和XbaI分别消化后的电泳结果。9、10为正向插入，11、12为反向插入 1～4为XbaI消化后的9～12号样品；5.λ DNA/EcoRI,HindⅢ DNA marker;6～9为PstI消化后的9～12号样品；1%琼脂糖凝胶，电压50V，1h

    Fig.3 The gel eletrophoresis of pGEMTH₂ samples No.9,10,11,12 after digestion of XbaI and Pst I.9,10 represent the sample from positive insertion direction and 11,12 from reverse direction.1-4.are from Samples of 9,10,11,12,Xba I;5.λDNA/EcoRI,HindⅢ DNA marker;6-9.are from samples of 9,10,11,12 Pst I; 1% agarose gel,Voltage 50V,1hour

    图4 pGEMTH₂经XhoI消化后得到线性片段的电泳结果。1.pGEMTH₂/XhoI；2.λDNA/EcoRI,HindⅢ DNA marker;3.pGEMTH₂/XhoI; 1%琼脂糖凝胶，电压50V，1h

    Fig.4 The gel electrophoresis of the fragments from pGEMTH₂ digested with XhoI. 1.pGEMTH₂/XhoI； 2.λDNA/EcoRI,HindⅢ DNA marker; 3.pGEMTH₂/XhoI;1% agarose gel,Voltage 50V,1 hour

    图5 用地高辛标记的RNA TH₂探针与不同浓度质粒pGEMTH₂和phTH₂进行斑点杂交的结果。1.pGEMTH₂;2.phTH₂

    Fig.5 Dot Blot hybridization of pGEMTH₂ and phTH₂ in different concertration identified by Dig-Labelled RNA TH₂ probe.1.pGEMTH₂; 2.phTH₂

    3. 斑点杂交

    将质粒pGEMTH₂和phTH₂与已制成的人TH RNA探针在尼龙膜上进行杂交。结果是蓝紫色；颜色的深浅与稀释深度成正比(图5)。该实验共用20h。用0.01g/L靶DNA即可得到清晰的反应结果。

    讨论

    本实验重组质粒pGEMTH₂的目的是利用质粒pGEM-3zf上的T7和Sp6启动子合成人的TH RNA-Dig标记探针。用这种探针做原位杂交可检测植入模型动物脑内的转基因载体细胞存活和表达TH的能力^[4]，以对我们所用的基因治疗PD方法进行评价。本试验采用我们制备的Dig标记TH RNA探针与带TH基因的质粒phTH₂和pGEMTH₂进行斑点杂交，结果显示杂交的阳性信号强、敏感性好；与放射性核素标记之探针相比，应具有无放射性污染、稳定性好、显色快和易于观察的特点，与国外有关报道相一致^[5]。根据我们的经验，用于原位杂交的Dig标记的单链探针的长度十分重要，以150～300碱基为宜，这与用PCR制备Dig标记的单链探针进行原位杂交的研究相一致^[6]。探针长度过短会造成Dig的携带量不足，致使检测敏感性降低；过长则不易穿过细胞膜及其他结构而不能与目的核酸杂交。为此，我们采取先合成长探针(1.404kb)后再用限制性内切酶切短的方法，使探针长度符合杂交需要。由于在一般情况下是在亚克隆时确定目的基因片段长度，这样，在探针合成过程中，由于片段长度的缩短，就可能出现Dig掺入过少而降低探针的敏感性，因此，我们的方法可避免这方面的问题。我们认为，我们所制备的Dig标记的人THRNA探针在基因治疗PD研究中是有实用价值的。

    * 国家自然科学基金资助课题(No.39370234)，北京市自然科学基金资助课题(No.7931001)，北京市科委资助课题(No.85470100)

    △ Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China

    参考文献

    [1]徐群渊，田竟生，张进禄，等.基因治疗帕金森病大鼠模型的实验研究.神经解剖学杂志，1996，12(2)：1

    [2]Jiao S,Williams P,Satda N,et al.Co-transplantation of plasmid-transfected myoblasts and myotubes into rat brains enables high levels of gene expression long term.Cell Transplant,1993,2(1):185

    [3]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning 2nd.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:121-185

    [4]Zhu YS,Jones SB,Burke RE,et al.Quantitation of the levels of tyrosine hydroxylase and preproenkephalin mRNA in nigrostriatal sites after 6-OHDA lesions.Life Sci,1993,52(9):1577

    [5]Humpel C,Lindqvist E,Olson L.Detection of nerve grouth factor mRNA in rodent salivary glands with digoxigenin-and ³²P-labeled oligonucleotides:effects of castration and symathectomy.J Histochem Cytochem,1993,41(5):703

    [6]张桦，薛全福，王立荣.用PCR制备地高辛精标记的单链探针进行原位杂交.基础医学与临床，1996，16(3)：75

    收稿1998-04 修回1998-12

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