小鼠附睾Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的分布*
作者：崔丽 许增禄 刘霄 徐健 钱晓菁 叶惟三 黄玉苓
单位：崔丽** 许增禄 刘霄 徐健 钱晓菁 叶惟三 黄玉苓(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)
关键词：附睾；Ⅳ型胶原；层粘连蛋白
解剖学报990322
【摘要】 目的 研究附睾发育过程中Ⅳ型胶原和层粘连蛋白(liaminin,LN)的定位和分布。 方法 应用生物素-抗生物素DCS体系间接免疫荧光染色技术。 结果 15d幼鼠附睾基膜内Ⅳ型胶原和LN荧光强度较弱；3个月成年鼠附睾基膜内Ⅳ型胶原和LN荧光强度最强；18个月老年鼠附睾基膜内Ⅳ型胶原和LN荧光强度比3个月弱。3月龄成年小鼠附睾各部分的荧光强度从头部至尾部呈逐渐增强的趋势。 结论 小鼠附睾内的细胞外基质成分可能与附睾各部分功能状态有密切关系。
, 百拇医药
DISTRIBUTION OF TYPE Ⅳ COLLAGEN AND LAMININ
IN THE MICE EPIDIDYMIS
Cui Li, Xu Zenglu△, Liu Xiao, Xu Jian, Qian Xiaojing, Ye Weisan, Huang Yuling
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of
Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing)
【Abstract】 Objective To investigate the location and distribution of the important components of the extracellular matrix (ECM) during the development of epididymis. Method The biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescent technique was used. Results The intensities of fluorescence of type Ⅳ collagen and laminin (LN) in the basement membrane of ducts epididymis were weaker in 15 day old mice and the strongest in 3 month old mice. The fluorescence expressed by type Ⅳ collagen and LN of 18 month old mice was weaker than that of 3 month old mice. The intensities of fluorescence tend to be strengthen from epididymal caput to epdidymal cauda. Conclusion These results suggest that the extracellular matrix of mouse epididymis may have intimate relation to the function of epididymis.
, 百拇医药
【Key words】 Epididymis; Type Ⅳ collagen; Laminin
附睾是收集和贮存精子、使其进一步生理性成熟并获得主动运动和受精能力的场所。基膜中的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分对组织的分化及正常结构的维持起重要作用[1]，其主要成分Ⅳ型胶原和LN的结构和功能已经证实。本实验旨在通过对幼年、成年及老年小鼠附睾中Ⅳ型胶原和LN的分布及其变化的研究，探讨ECM成分对精子成熟的影响。
材料和方法
1. 动物分组
选用雄性昆明小鼠，按年龄段分为3组。生后15d为幼年组；3月龄为成年组；18月龄为老年组。每组鼠均为10只。
2. 切片制备
, 百拇医药
用颈椎脱臼法处死小鼠，取出双侧附睾。一侧附睾放入10%中性福尔马林液固定24h后，按常规方法制成石蜡切片(厚5 μm)。另一侧附睾用冷冻剂复合物OCT(Miles Inc.USA)包埋，经液氮冷冻，于恒冷箱冰冻切片，(厚10 μm)，切片贮存于-30℃，直至染色。
3. HE染色及间接免疫荧光染色
石蜡切片按常规脱蜡后，经Harris苏木素和伊红染色，再脱水、透明及封片。
将冰冻切片以PBS配制10%山羊血清，4℃孵育20min；10%山羊血清稀释的1∶100兔抗小鼠Ⅳ型胶原或LN第一抗体(北京医科大学提供)，4℃孵育过夜；10%山羊血清稀释的1∶200生物素化的山羊抗兔IgG第2抗体(Vector Laboratories Burlin game, CA,USA)，4℃孵育1h；涮洗切片后，加10 mg/L荧光素-抗生物素DCS(VLB)，4℃孵育1h；每步骤后均用0.1 mol/L的PBS(pH7.4磷酸缓冲液)充分洗涤。阴性对照实验不加第一抗体。用含10%PBS和1%对苯基二胺(p-phenylenediamine)的甘油封片剂封片[2]。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察，并用Kodak 400ASA胶卷摄片。
, http://www.100md.com
结果和讨论
1. HE染色
15d幼鼠附睾各段不易区分。近附睾头端输出小管的数量多，管壁上皮较高，管腔小，近尾端管壁上皮变矮，腔变大，腔内未见精子，固有层内可见管周细胞(亦称为收缩细胞)，体积较大。管周基质较少。
3个月成年鼠附睾头、体、尾部区分明显。头部(含起始段)为输出小管，腔面凹凸不平。体、尾部为附睾管，腔面规则，上皮游离面可见静纤毛。从头部至尾部，管腔逐渐增大，腔内可见精子。固有层内管周细胞增多，体积变小，管周基质逐渐增多，且排列紧密。
18个月老年鼠附睾头、体、尾各段变化不明显。但是腔内精子数量减少。固有层管周细胞呈扁平形，排列紧密。管周基质结缔组织排列疏松。
2. 生物素-抗生物素DCS染色
, 百拇医药
Ⅳ型胶原和LN的荧光强度及其分布基本相同。15d幼鼠附睾管基膜及固有层管周细胞周围可见Ⅳ型胶原和LN荧光，强度较弱，且强度不均匀，呈不连续的网状，头、体、尾各部无明显差异(P>0.05；图1，2)。3个月成年鼠附睾内Ⅳ型胶原和LN荧光强度最强，多连续呈网状，从头部至尾部呈逐渐增强的趋势(图3，4)。18个月老年鼠附睾内Ⅳ型胶原和LN荧光强度较3个月鼠为弱(图5，6)，较15d幼鼠略强。且头、体、尾各部分未见明显差异(P>0.05)。各年龄段附睾管周基质内血管基膜处亦可见荧光存在。
3. 讨论
附睾不仅具有吸收、分泌和浓缩功能，而且还为精子的贮存和成熟提供了适宜的微环境[1]。组织学上将附睾分为头、体、尾3部分，其各部分附睾上皮的厚度、管径大小、管周结缔组织含量及血管数量是不同的[3]。从头部至尾部附睾上皮吸收和分泌的某些物质，如：唾液酸、肉毒碱和甘油磷酸胆碱的含量逐渐增高；附睾管腔内贮存的精子数目及精子固着于透明带，获得受精的能力也逐渐增强[1]。本实验结果显示，3月龄成年小鼠Ⅳ型胶原和LN荧光强度在附睾头部较弱，而在体部和尾部逐渐增强，则提示附睾内ECM成分可能与附睾各部分的功能状态有密切关系。
, 百拇医药
Ⅳ型胶原是基膜的主要胶原成分，形成结构网架，它存在于所有的基膜中，使其具有韧性和通透性。LN则是存在于基膜中最丰富的细胞外基质成分[4]，但也广泛存在于基质中，具有多方面的连接和介导作用，还可能具有控制基膜形成的作用[1]。有实验证明，在个体发育期间Ⅳ型胶原和LN的免疫荧光染色是相平行的[5]。我们的实验结果也显示了两者在附睾管壁基膜的分布和变化规律是相平行的。
附睾在男性生殖细胞发育成熟中承担着重要的角色，附睾管壁的成熟发生在出生后[5]。出生后，附睾的发育分为3个期：未分化期(出生至生后15d)；分化期(生后15～44d)；伸展期(生后45d至3个月)。本实验选择的15d幼鼠正处于未分化期及分化期交界点，此时睾丸的曲细精管内精母细胞增多，但未见精子，而附睾各部分管壁基膜中Ⅳ型胶原和LN含量较少且分布不连续。3个月成年鼠处于伸展期，睾丸曲细精管内已有大量精子生成，此时附睾管腔中也出现了精子，说明生精功能旺盛。而且3个月正是小鼠交配生育的高峰期，附睾各部分基膜内Ⅳ型胶原和LN含量均较15d和18个月鼠为高，3个月后随年龄增加，Ⅳ型胶原和LN含量逐渐减少。一般认为12月龄小鼠为老年鼠。18个月老年鼠睾丸内的生精功能减弱，而且附睾内ECM成分也随之减少，并维持一定水平，提示附睾各部分ECM含量的变化是一个与年龄相关的过程。
, 百拇医药
Gelly等[5]的研究表明，在附睾的生后成熟期间，其管壁比曲细精管的固有层厚，并由一些可收缩的细胞层构成。N型胶原和LN沿上皮基膜和围绕可收缩细胞分布，而且管周细胞的分化的逐渐凝集与管周基质的生物合成相伴随。我们的结果显示出Ⅳ型胶原和LN荧光强度主要位于基膜处及沿着管周收缩细胞周围分布。这与Gelly等的结果一致，从而提示管周收缩细胞可能与Ⅳ型胶原和LN的合成与分泌有关。尽管本实验结果表明Ⅳ型胶原和LN在附睾不同发育时期和附睾内的不同部分的分布及变化规律是不同的，但其分子作用机制还有待于深入研究。
图版说明
图1 15d小鼠附睾头部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色，箭头示管周细胞 ×200
图2 15d小鼠附睾头部抗Ⅳ型胶原抗体间接免疫荧光染色，箭头示基膜 ×250
, 百拇医药
图3 3个月小鼠附睾头部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色 ×200
图4 3个月小鼠附睾尾部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色 ×200
图5 18个月小鼠附睾头部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色 ×200
图6 18个月小鼠附睾头部抗Ⅳ型胶原抗体间接免疫荧光染色 ×200
Fig.1 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 15 day old mouse stained with antibody against laminin. Arrow indicates a peritubullar cell. ×200
, 百拇医药 Fig.2 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 15 day old mouse stained with antibody against type Ⅳ collagen. Arrow indicates basement membrane. ×250
Fig.3 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 3 month old mouse stained with antibody against laminin. ×200
Fig.4 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of cauda epididymis in 3 month old mouse stained with antibody against laminin. ×200
, 百拇医药
Fig.5 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 18 month old mouse stained with antibody against laminin. ×200
Fig.6 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 18 month old mouse stained with antibody against type Ⅳ collagen. ×200
* 国家自然科学基金资助课题(No.39270380)和国家计划生育委员会基金资助课题(No.94-37)
**CMB国内访问学者(白求恩医科大学)
, http://www.100md.com
△ Department of Histology and Embryology, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China
参考文献
[1]成令忠主编.组织学.第2版，北京：人民卫生出版社，1994：1369～1375
[2]Xu ZL, Parker S B, Minkoff R. Distribution of type Ⅳ collagen, laminin and fibronection during maxillary process formation in the chick embryo. Am J Anat, 1990, 187(3):232
[3]Pera I, Ivell R, Kirchhoff C. Regional variation of specific gene-expression in the dog epididymis as revealed by in situ transrip thybridization. Int J Andrl 1994, 17(6):324
, http://www.100md.com
[4]Karl T. Molecular properties and diseases of collagen. Kidney Int, 1995, 49(suppl):24
[5]Gelly JL, Richoux JP, Leheup BP, et al. Immunolocalization of type Ⅳ collagen and laminin during rat gonadal morphogenesis and postnatal development of the testis and epididymids. Histochemistry, 1989,93(1):31
收稿1998-06 收回1998-09, 百拇医药
单位：崔丽** 许增禄 刘霄 徐健 钱晓菁 叶惟三 黄玉苓(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)
关键词：附睾；Ⅳ型胶原；层粘连蛋白
解剖学报990322
【摘要】 目的 研究附睾发育过程中Ⅳ型胶原和层粘连蛋白(liaminin,LN)的定位和分布。 方法 应用生物素-抗生物素DCS体系间接免疫荧光染色技术。 结果 15d幼鼠附睾基膜内Ⅳ型胶原和LN荧光强度较弱；3个月成年鼠附睾基膜内Ⅳ型胶原和LN荧光强度最强；18个月老年鼠附睾基膜内Ⅳ型胶原和LN荧光强度比3个月弱。3月龄成年小鼠附睾各部分的荧光强度从头部至尾部呈逐渐增强的趋势。 结论 小鼠附睾内的细胞外基质成分可能与附睾各部分功能状态有密切关系。
, 百拇医药
DISTRIBUTION OF TYPE Ⅳ COLLAGEN AND LAMININ
IN THE MICE EPIDIDYMIS
Cui Li, Xu Zenglu△, Liu Xiao, Xu Jian, Qian Xiaojing, Ye Weisan, Huang Yuling
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of
Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing)
【Abstract】 Objective To investigate the location and distribution of the important components of the extracellular matrix (ECM) during the development of epididymis. Method The biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescent technique was used. Results The intensities of fluorescence of type Ⅳ collagen and laminin (LN) in the basement membrane of ducts epididymis were weaker in 15 day old mice and the strongest in 3 month old mice. The fluorescence expressed by type Ⅳ collagen and LN of 18 month old mice was weaker than that of 3 month old mice. The intensities of fluorescence tend to be strengthen from epididymal caput to epdidymal cauda. Conclusion These results suggest that the extracellular matrix of mouse epididymis may have intimate relation to the function of epididymis.
, 百拇医药
【Key words】 Epididymis; Type Ⅳ collagen; Laminin
附睾是收集和贮存精子、使其进一步生理性成熟并获得主动运动和受精能力的场所。基膜中的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分对组织的分化及正常结构的维持起重要作用[1]，其主要成分Ⅳ型胶原和LN的结构和功能已经证实。本实验旨在通过对幼年、成年及老年小鼠附睾中Ⅳ型胶原和LN的分布及其变化的研究，探讨ECM成分对精子成熟的影响。
材料和方法
1. 动物分组
选用雄性昆明小鼠，按年龄段分为3组。生后15d为幼年组；3月龄为成年组；18月龄为老年组。每组鼠均为10只。
2. 切片制备
, 百拇医药
用颈椎脱臼法处死小鼠，取出双侧附睾。一侧附睾放入10%中性福尔马林液固定24h后，按常规方法制成石蜡切片(厚5 μm)。另一侧附睾用冷冻剂复合物OCT(Miles Inc.USA)包埋，经液氮冷冻，于恒冷箱冰冻切片，(厚10 μm)，切片贮存于-30℃，直至染色。
3. HE染色及间接免疫荧光染色
石蜡切片按常规脱蜡后，经Harris苏木素和伊红染色，再脱水、透明及封片。
将冰冻切片以PBS配制10%山羊血清，4℃孵育20min；10%山羊血清稀释的1∶100兔抗小鼠Ⅳ型胶原或LN第一抗体(北京医科大学提供)，4℃孵育过夜；10%山羊血清稀释的1∶200生物素化的山羊抗兔IgG第2抗体(Vector Laboratories Burlin game, CA,USA)，4℃孵育1h；涮洗切片后，加10 mg/L荧光素-抗生物素DCS(VLB)，4℃孵育1h；每步骤后均用0.1 mol/L的PBS(pH7.4磷酸缓冲液)充分洗涤。阴性对照实验不加第一抗体。用含10%PBS和1%对苯基二胺(p-phenylenediamine)的甘油封片剂封片[2]。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察，并用Kodak 400ASA胶卷摄片。
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结果和讨论
1. HE染色
15d幼鼠附睾各段不易区分。近附睾头端输出小管的数量多，管壁上皮较高，管腔小，近尾端管壁上皮变矮，腔变大，腔内未见精子，固有层内可见管周细胞(亦称为收缩细胞)，体积较大。管周基质较少。
3个月成年鼠附睾头、体、尾部区分明显。头部(含起始段)为输出小管，腔面凹凸不平。体、尾部为附睾管，腔面规则，上皮游离面可见静纤毛。从头部至尾部，管腔逐渐增大，腔内可见精子。固有层内管周细胞增多，体积变小，管周基质逐渐增多，且排列紧密。
18个月老年鼠附睾头、体、尾各段变化不明显。但是腔内精子数量减少。固有层管周细胞呈扁平形，排列紧密。管周基质结缔组织排列疏松。
2. 生物素-抗生物素DCS染色
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Ⅳ型胶原和LN的荧光强度及其分布基本相同。15d幼鼠附睾管基膜及固有层管周细胞周围可见Ⅳ型胶原和LN荧光，强度较弱，且强度不均匀，呈不连续的网状，头、体、尾各部无明显差异(P>0.05；图1，2)。3个月成年鼠附睾内Ⅳ型胶原和LN荧光强度最强，多连续呈网状，从头部至尾部呈逐渐增强的趋势(图3，4)。18个月老年鼠附睾内Ⅳ型胶原和LN荧光强度较3个月鼠为弱(图5，6)，较15d幼鼠略强。且头、体、尾各部分未见明显差异(P>0.05)。各年龄段附睾管周基质内血管基膜处亦可见荧光存在。
3. 讨论
附睾不仅具有吸收、分泌和浓缩功能，而且还为精子的贮存和成熟提供了适宜的微环境[1]。组织学上将附睾分为头、体、尾3部分，其各部分附睾上皮的厚度、管径大小、管周结缔组织含量及血管数量是不同的[3]。从头部至尾部附睾上皮吸收和分泌的某些物质，如：唾液酸、肉毒碱和甘油磷酸胆碱的含量逐渐增高；附睾管腔内贮存的精子数目及精子固着于透明带，获得受精的能力也逐渐增强[1]。本实验结果显示，3月龄成年小鼠Ⅳ型胶原和LN荧光强度在附睾头部较弱，而在体部和尾部逐渐增强，则提示附睾内ECM成分可能与附睾各部分的功能状态有密切关系。
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Ⅳ型胶原是基膜的主要胶原成分，形成结构网架，它存在于所有的基膜中，使其具有韧性和通透性。LN则是存在于基膜中最丰富的细胞外基质成分[4]，但也广泛存在于基质中，具有多方面的连接和介导作用，还可能具有控制基膜形成的作用[1]。有实验证明，在个体发育期间Ⅳ型胶原和LN的免疫荧光染色是相平行的[5]。我们的实验结果也显示了两者在附睾管壁基膜的分布和变化规律是相平行的。
附睾在男性生殖细胞发育成熟中承担着重要的角色，附睾管壁的成熟发生在出生后[5]。出生后，附睾的发育分为3个期：未分化期(出生至生后15d)；分化期(生后15～44d)；伸展期(生后45d至3个月)。本实验选择的15d幼鼠正处于未分化期及分化期交界点，此时睾丸的曲细精管内精母细胞增多，但未见精子，而附睾各部分管壁基膜中Ⅳ型胶原和LN含量较少且分布不连续。3个月成年鼠处于伸展期，睾丸曲细精管内已有大量精子生成，此时附睾管腔中也出现了精子，说明生精功能旺盛。而且3个月正是小鼠交配生育的高峰期，附睾各部分基膜内Ⅳ型胶原和LN含量均较15d和18个月鼠为高，3个月后随年龄增加，Ⅳ型胶原和LN含量逐渐减少。一般认为12月龄小鼠为老年鼠。18个月老年鼠睾丸内的生精功能减弱，而且附睾内ECM成分也随之减少，并维持一定水平，提示附睾各部分ECM含量的变化是一个与年龄相关的过程。
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Gelly等[5]的研究表明，在附睾的生后成熟期间，其管壁比曲细精管的固有层厚，并由一些可收缩的细胞层构成。N型胶原和LN沿上皮基膜和围绕可收缩细胞分布，而且管周细胞的分化的逐渐凝集与管周基质的生物合成相伴随。我们的结果显示出Ⅳ型胶原和LN荧光强度主要位于基膜处及沿着管周收缩细胞周围分布。这与Gelly等的结果一致，从而提示管周收缩细胞可能与Ⅳ型胶原和LN的合成与分泌有关。尽管本实验结果表明Ⅳ型胶原和LN在附睾不同发育时期和附睾内的不同部分的分布及变化规律是不同的，但其分子作用机制还有待于深入研究。
图版说明
图1 15d小鼠附睾头部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色，箭头示管周细胞 ×200
图2 15d小鼠附睾头部抗Ⅳ型胶原抗体间接免疫荧光染色，箭头示基膜 ×250
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图3 3个月小鼠附睾头部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色 ×200
图4 3个月小鼠附睾尾部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色 ×200
图5 18个月小鼠附睾头部抗层粘连蛋白抗体间接免疫荧光染色 ×200
图6 18个月小鼠附睾头部抗Ⅳ型胶原抗体间接免疫荧光染色 ×200
Fig.1 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 15 day old mouse stained with antibody against laminin. Arrow indicates a peritubullar cell. ×200
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Fig.3 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 3 month old mouse stained with antibody against laminin. ×200
Fig.4 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of cauda epididymis in 3 month old mouse stained with antibody against laminin. ×200
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Fig.5 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 18 month old mouse stained with antibody against laminin. ×200
Fig.6 Indirect immunofluorescent photomicrograph of frozen section of caput epididymis in 18 month old mouse stained with antibody against type Ⅳ collagen. ×200
* 国家自然科学基金资助课题(No.39270380)和国家计划生育委员会基金资助课题(No.94-37)
**CMB国内访问学者(白求恩医科大学)
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△ Department of Histology and Embryology, Peking Union Medical College, Beijing 100005, China
参考文献
[1]成令忠主编.组织学.第2版，北京：人民卫生出版社，1994：1369～1375
[2]Xu ZL, Parker S B, Minkoff R. Distribution of type Ⅳ collagen, laminin and fibronection during maxillary process formation in the chick embryo. Am J Anat, 1990, 187(3):232
[3]Pera I, Ivell R, Kirchhoff C. Regional variation of specific gene-expression in the dog epididymis as revealed by in situ transrip thybridization. Int J Andrl 1994, 17(6):324
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[4]Karl T. Molecular properties and diseases of collagen. Kidney Int, 1995, 49(suppl):24
[5]Gelly JL, Richoux JP, Leheup BP, et al. Immunolocalization of type Ⅳ collagen and laminin during rat gonadal morphogenesis and postnatal development of the testis and epididymids. Histochemistry, 1989,93(1):31
收稿1998-06 收回1998-09, 百拇医药