大鼠精子发生中核基质-核纤层-中间丝体系的研究
作者：劳萍 徐炎 章静波 陈延文 刘世广 孙英丽
单位：劳萍(山东省立医院中心实验室，济南 250021)； 徐炎 章静波 陈延文 刘世广(中国医学科学院中国协和医科大学)；孙英丽(基础医学研究所细胞生物室，北京；北京大学生物系，北京)
关键词：精子发生；核基质-核纤层-中间丝体系；整装电镜技术
解剖学报990412 【摘要】 目的 研究精子发生中的核基质-核纤层-中间丝体系(nuclear matrix-lamina-intermediate filament,NM-L-IF)的变化趋向。 方法 利用整装电镜技术、SDS-PAGE和Southwestern blot等技术观察与分析经单位重力沉降法分离的大鼠精母细胞、早期精子细胞和晚期精子细胞的NM-L-IF的形态结构、蛋白组成及其与A-T重复序列的相互关系。 结果 精母细胞核基质由核纤层、核仁残余物及内部纤维网络组成。精子细胞中，中间丝丰富，核基质结构被致密的染色质团簇所掩盖。精子形成Ⅷ～Ⅸ期时，核基质分化出两部分：疏松的头端(Ap)和致密的尾端(Ca)，中间丝连接细胞核与细胞膜；精子形成Ⅹ～Ⅺ期时，头端和尾端间形成弯曲；ⅩⅡ～ⅩⅣ期，头端进一步弯曲，一部分中间丝连接头端的顶部和头尾端的连接部。SDS-PAGE显示分子量小于40kD的蛋白在不同细胞中组成有差异，而分子量大于40kD的蛋白没有明显差异。Southwestern blot显示精母细胞的低分子量蛋白对A-T重复序列的吸附能力强，而只有早期精子细胞的部分高分子量蛋白对该序列具有很强的亲和力。 结论 精子发生中NM-L-IF的形态结构、蛋白组成及与DNA的相互作用发生显著变化，这可能与精子细胞核的浓缩变形以及形态发生密切相关。
STUDY ON THE NUCLEAR MATRIX-LAMINA-INTERMEDIATE
FILAMENT SYSTEM IN THE RAT SPERMATOGENESIS
Lao Ping, Xu Yan*△，Zhang Jingbo*，Chen Yanwen*，Liu Shiguang*，Sun Yingli**
(Centre Laboratory of Shandong Provincial Hospital, Ji'nan;*Department of Cell Biology, Institute of Basic medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing; **Department of Biology, Peking University, Beijing)
【Abstract】 Objective To study the changes of the nuclear matrix-lamina-intermediate filament(NM-L-IF) during the rat spermatogenesis. Methods Spermatocytes, early stage spermatids and the later stage spermatids were separated from the adult rat testis by the velocity gravitative sedimentation technique. Using the whole mount electron microscopy, SDS-PAGE and Southwestern blot, the morphology, components of NM-L-IF and the relationship between an A-T repetitive DNA fragment and the proteins of NM-L-IF in those cells were analyzed. Results: In spermatocytes, the NM is composed of a lamina, a large mass of residual nucleolar material and fibers. In spermatids, there are many IFs and the NM is concealed beneath the clumps of chromatin. NM becomes to form two portions, a less condensed apical(Ap) and a more condensed caudal(Ca) in spermatogenic stages Ⅷ-Ⅸ.IFs of these cells appear to be attached to the nuclear envelope and the cell surface. In the stages Ⅹ-Ⅺ, the NM bends between Ap and Ca. Furthermore Ap becomes more curved in the stages ⅩⅡ-ⅩⅣ. And that some IF links the tip of Ap and the region that connects the Ap and Ca. SDS-PAGE shows that there are some changes in the proteins of NM-L-IF below 40kD and no significantly changes in higher 40kD in different cells. In spermatocytes, the proteins of lower MW have high affinity to the A-T repetitive DNA fragment, but it is only in round spermatids that some proteins of higher 40kD have strong affinity. Conclusion Some proteins change their affinity to the given DNA fragment depending on spermatogenesis. It suggests that the NM-L-IF is the most important in the condensation and remodeling of the sperm nucleus and in the morphogenesis of spermatids.
【Key words】 Spermatogenesis; Nuclear matrix-lamina-intermediate filament; Whole mount electron microscopy
核基质(nuclear matrix)是存在于真核生物细胞核内的一种精细的非组蛋白网络结构，它与核纤层(lamina)以及胞质中的中间丝(intermediate filament)相互联系形成一个贯穿细胞核细胞质的纤维网络体系，称为核基质-核纤层-中间丝体系(NM-L-IF)[1]。它不仅是细胞形态的支架，而且参与细胞内的许多重要生命活动，如DNA复制基因的表达调控，RNA合成修饰等，在细胞生长、分化、分裂、细胞的信息传递和肿瘤发生等方面均起着重要作用[2]。
精子发生是指精原细胞经过一系列发育阶段成为精子的过程，包括3个阶段：有丝分裂，减数分裂和精子形成[3]。由于核基质-核纤层-中间丝体系在细胞中的重要作用，推测其可能在精子发生中也起着不可忽视的作用，对其深入研究将有助于精子发生机制的阐明，为人们寻找薄弱环节控制男性生殖提供依据及指导[3]。我们运用整装电镜技术、SDS-PAGE和Southwestern blot技术对部分分离的生精细胞的核基质-核纤层-中间丝体系的形态结构、蛋白组成及与DNA的相互作用进行研究，以探讨其在精子发生中变化趋向和作用。
材料和方法
1.材料
1.1 实验动物：成熟Wistar大鼠购自中国医学科学院动物所动物繁育场。
1.2 主要试剂：CSK-TritonX-100 细胞骨架缓冲液[10mol/L PIPES,100mol/L KCl,300 mmol/L sucrose, 3mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA,1.2mol/L PMSF，2mg/L aportinin, 0.5%(v/v) Triton Ⅹ-100, pH 6.8], RBS-Majik(42.5 mmol/L Tris-Cl,8.5 mmol/L NaCl,2.6 mmol/L MgCl2，1.2 mmol/L PMSF, 2mg/L aportinin, 1% Tween 40，0.5%脱氧胆酸钠，pH7.4)，样品溶解液(2% SDS， 10%甘油，5% β-巯基乙醇，0.2%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-Cl,pH6.8)，预杂交液(10 mmol/L Tris-Cl,pH7.5,50 mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA,0.1% picoll 400,0.1% BSA，0.1% PVP)，杂交液(含标记探针的预杂交液，探针：鲑精DNA=1:1 000，探针浓度80μg/L)。
1.3 探针[4]：为日本富山医药大学的Sugano博士惠赠。克隆在puc19中的C10-Hind IV双体，可用Xmn I切下370bp的A-T的重复序列。
2.方法[5]
2.1 睾丸细胞的分离与纯化：取成熟大鼠睾丸，剪碎制成匀浆，用0.25%胰酶、室温消化10min，4%小牛血清抑制胰酶活性，然后收集混合的睾丸细胞。利用单位重力沉降法分离纯化生精细胞，以蔗糖为介质，浓度梯度1%～2%，4℃静止3h，以流速5ml/min，每管10ml收集梯度液。苏木精染色，确定各管内细胞类别：精母细胞大；早期精子细胞小，核质比例大，染色深；晚期精子小，细胞核浓缩或变形[6]。按需收集所要的细胞。
2.2 整装电镜技术观察细胞核基质-核纤层-中间丝体系：将细胞滴加在覆以Formvar膜碳膜和涂有多聚左旋赖氨酸的铜网上，经CSK-Triton X-100细胞骨架缓冲液RSB-Majik液抽提，DNase Ⅰ消化，(NH4)2SO4作用，经戊二醛锇酸固定，系列乙醇脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，透射电镜下观察，摄片。
2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：将抽提的NM-L-IF用样品溶解液溶解，紫外分光光度法(215～225nm)测蛋白浓度[7]。制备电泳胶12×9×0.1cm，分离胶和浓缩胶浓度分别为12%和5%，上样蛋白20mg，恒流电泳，考马斯亮蓝R250染色。
2.4 探针的制备与标记参考《分子克隆》和试剂盒说明书。
2.5 Southwestern blot[7]：SDS-PAGE结束后，切下蛋白分子量标准，并行考马斯亮蓝R250染色。其他蛋白通过电转移至硝酸纤维素膜上后，对照已染色的蛋白分子量标准在膜上标出分子量标准的位置。膜加预杂交液室温平衡2h，杂交液室温作用8h，预杂交液37℃漂洗8h，按试剂盒说明书显色。
结 果
我们采用单位重力沉降法分离成熟大鼠睾丸细胞，按沉降先后次序收集到3部分细胞：精母细胞、早期精子细胞、晚期精子细胞，细胞纯度大于80%(图1～4)。精母细胞大，核内有絮状染色质(图2)；早期精子细胞小，核质比例大，细胞染色深(图3)；晚期精子细胞小，核浓缩或变形(图4)。
电镜观察核基质-核纤层-中间丝体系表明：精母细胞显示核纤层、核内残余物和内部纤维网络，未显示中间丝(图5)；减数分裂过程中完成胞核分裂而未完成胞质分裂的生精细胞中，中间丝丰富，核纤层明显，核内染色质小团簇结构掩盖了核基质网络(图6，7)；Ⅷ～Ⅸ期精子细胞，中间丝始于细胞核，止于细胞膜，呈放射状分布；核基质、核纤层结构不明显，细胞核浓缩并出现两部分：疏松区和相对致密区，这两部分将发育成精子头部的头端(apical ,Ap)及尾端(caudal,Ca)(图8)；Ⅹ～Ⅺ期精子细胞中，Ap和Ca的分化更明显，头端与尾端间形成弯曲(图9)；ⅩⅡ～ⅩⅣ期精子细胞，Ap进一部弯曲，中间丝出现分布的差异，一部分中间丝始于细胞核止于细胞膜，呈放射状分布，另一部分始于Ap顶点止于Ap与Ca连接处(图10)。以上结果显示精子发生中核基质-核纤层-中间丝体系的形态发生明显的变化。
经分级抽提得到的NM-L-IF蛋白经SDS-PAGE可显示十几种蛋白，其中分子量大于40kD的蛋白在不同发育阶段的生精细胞中没有明显的差异。精母细胞含有许多分子量25～40kD的蛋白，早期精子细胞、晚期精子细胞中，低分子量蛋白的种类及数量在减少(图11)。选取一段370bp的A-T重复序列与NM-L-IF蛋白进行Southwestern杂交，精母细胞中分子量50kD以下，特别是30kD以下的蛋白对该序列显示很强的亲合力；早期精子细胞中，分子量100、93、80、67、50kD蛋白有特异性的结合。同时也与分子量30kD蛋白结合；晚期精子细胞中，分子量80、67、50kD蛋白具有弱亲合力(图12)。因此，结果显示不同发育阶段生精细胞NM-L-IF蛋白对该A-T序列的亲合力具有明显差异。
图11 NM-L-IF蛋白的SDS-PAGE图谱，1.蛋白分子量标准 2.精母细胞 3.早期精子细胞 4.晚期精子细胞
Fig. 11 SDS-PAGE of NM-L-IF protein. 1. protein marker, 2.Spermatocyte,3.Early spermatids,4.Later stage spermatids.
图12 NM-L-IF蛋白与一段370bp A-T重复序列的Southwestern blot图谱 1.蛋白分子量标准 2.精母细胞 3.早期精子细胞，4.晚期精子细胞
Fig.12 Southwestern blot of the NM-L-IF protein and a 370 bp A-T repetitive DNA fragment.1. protein marker, 2.Spermato-cyte,3.Early spermatids,4.Later stage spermatids
讨 论
核基质-核纤层-中间丝体系通常由3部分组成：1.始于核膜止于细胞膜的中间丝；2.核纤层及残余的核孔复合物；3.核内纤维、颗粒及核仁残体形成的核内基质网络[8]。实际工作中我们很难示踪纤维在细胞生命活动中的变化，不同的细胞以及细胞的不同生存状态间，NM-L-IF形态结构的可比性较差[8，9]。我们以生精细胞为对象，动态观察几个不同发育时相生精细胞的NM-L-IF的形态结构。精母细胞显示核纤层、残余的核孔复合物及核基质内部纤维，这与其他体细胞的核基质形态结构没有明显的差异，但不知由于抽提的原因还是由于中间丝不稳定，结果没能显示精母细胞的中间丝。减数分裂后，中间丝丰富，细胞核显示很强的对抗高盐溶液及非离子去污剂抽提的稳定性，这与文献报道的抽提精子核基质的结果相似[10]。核基质结构被掩盖，但还是展示了一些值得我们注意的变化：伴随精子细胞核浓缩变形，核基质由充满团簇结构的疏松圆形分化形成两部分：致密的尾端(Ca)和相对疏松的头端(Ap)，这与Oko等[11]报道的精子变态过程中染色质纤维发生变化的时相吻合。另外，核浓缩变形的Ⅺ～ⅩⅣ期精子细胞，出现一部分始于Ap的顶点止于Ap与Ca的连接部的中间丝。目前，我们没有发现有关精子变态中的中间丝形态变化的相关报道。由于中间丝在体细胞核形态及核定位中的作用[12]，推断其在精子变态核变形中可能起重要作用。
NM-L-IF体系中，核纤层与中间丝的成分是比较稳定的，而核基质的成分很复杂，同时有大量的酶和调节蛋白与之牢固结合[13]，因此，SDS-PAGE结果显示的差异可能是具有发育阶段特异性的核基质蛋白选择性表达的结果，也可能是牢固结合在核基质上的反式作用因子。在研究DNA与核基质的关系时，人们发现一种决定染色质结构与功能区域化的顺式作用因子：核基质结合序列(matrix attachment regions, MARs)。MARs常含有丰富的A-T碱基对，它们在染色质的包装、DNA的复制、RNA的转录等方面起着重要的作用[14]。我们将NM-L-IF蛋白与一段已知MARs进行杂交，在不同细胞中杂交结果显著差别，这与文献[15]报道的一段450bp的A-T重复序列Msp18与精子形成中的核基质蛋白亲和力变化的结果相似。然而在SDS-PAGE中大于40kD的蛋白没有明显的差异，为什么会有如此大的差别呢?可能是同分子量的不同蛋白、也可能是同种蛋白在不同发育阶段发生变化。许多研究认为，NM的主要成分在细胞中是比较恒定的，与细胞的类型和发育阶段无关[13]。因此，我们更倾向于第二种假设。有学者认为核基质蛋白与核基质网架结构的结合比其自身的合成更有意义，核内染色质结构的变化是由于核基质装配方式的改变[9]。精母细胞、早期精子细胞和晚期精子细胞间，核基质的装配方式可能已发生某些重要的变化，使核基质蛋白与DNA的结合发生差异，以适应精子发生的要求。
图版说明
图1 未经分离的睾丸细胞，形态各异 ×400
图2 分离的精母细胞大，部分细胞核内有絮状染色质 ×400
图3 分离的早期精子细胞小，核质比例大、染色深 ×400
图4 分离的晚期精子细胞小，核浓缩或变形 ×400
图5 精母细胞的核基质，显示核纤层(L)、核内的残余物(M)和纤维(F) ×20 000
图6 减数分裂后的生精细胞，显示中间丝(IF)，核基质结构被核内的团簇状残余物所掩盖 ×3000
图7 图6的放大，显示核纤层(L)与中间丝(IF) ×8000
图8 精子形成ⅩⅢ、Ⅸ期的精子细胞，中间丝(IF)连接核膜与细胞膜，核基质分化成两部分：疏松头端(Ap)和相对致密尾端(Ca) ×8000
图9 精了形成Ⅹ、Ⅺ期的精子细胞，Ap和Ca间形成弯曲且分化更明显 ×6000
图10 精子形成ⅩⅡ～ⅩⅣ期的精子细胞，Ap进一步弯曲，出现部分连接头端顶部和头尾端相连处的中间丝 ×6000
Explanation of figures
Fig.1 Unseparated testis cells showing irregular shapes. ×400
Fig.2 Spermatocytes are big and showing woolly mass of chromatin in the nucleus. ×400
Fig.3 Early stage spermatids are smaller and deeply stained. ×400
Fig.4 Later stage spermatids are small and containing condensed or elongated nucleus. ×400
Fig.5 After extraction spermatocyte showed nuclear matrix is formed by lamina(L), a large mass of residual material(M),fibers(F). ×20000
Fig.6 Spermaticd cell after miosis showing IF and NM concealed beneath the clumps of chromatin. ×3000
Fig.7 Higher magnification of figure 6 showing lamina(L) and IF.×8000
Fig.8 Spermatid belonging to the spermatogenic stages Ⅷ-Ⅸ, IFs attach to the nuclear envelope and the cell surface; NM forms two portions, a less condensed apical (Ap) and a more condensed caudal(Ca). ×8000
Fig.9 Spermatid in the spermatogenic stages Ⅹ-Ⅺ showing the NM bending between Ap and Ca. ×6000
Fig.10 Spermatid in the stages ⅩⅡ-ⅩⅣ showing Ap becoming more curved and some IF links the tip of Ap and the region that connect the Ap and the Ca. ×6000
△ Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China
参考文献
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收稿1998-07 修回1999-01