大鼠运动皮层甘氨酸免疫反应性神经元的分布及其超微结构特征
作者：高文军 郑则慧
单位：高文军(中国科学院上海脑研究所，上海 200031)；郑则慧(中国科学院上海脑研究所，上海 200031)
关键词：甘氨酸；免疫组织化学；电镜；运动皮层；大鼠
解剖学报000101 摘 要：目的 探讨甘氨酸能神经元(Gly-ir)在大脑皮层内的分布及特征。 方法 用免疫组织化学与免疫电镜方法，在光镜与电镜水平观察甘氨酸免疫反应性神经元在大鼠运动皮层内的分布及其超微结构特征。 结果 甘氨酸免疫反应性神经元均为非锥体细胞，在运动皮层内Ⅰ～Ⅵ层均有分布，以Ⅰ～Ⅲ层较多，Ⅵ层最少，免疫反应性细胞以小细胞(41.5%)及中等大小细胞(44%)为主，也可见少量梭形细胞(13.5%)，而大细胞极少(1%)。这些不同形态与大小的细胞也有层次分布的特征：Ⅰ、Ⅵ层以小细胞为主，而Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ层则以中等大小细胞为主。电镜下，甘氨酸免疫反应性神经元呈现中间神经元的特征：胞体小、核大浆少、核内陷。胞体上既可见具有扁平或多形囊泡的终末形成的对称型突触(79.7%)，也可见含球形、清亮囊泡的终末形成的非对称型突触(20.3%)。它的树突上也可见这两种突触类型，近端树突上与胞体相似，以对称型突触为主；而远端细小树突(直径<1μm)上则以非对称型突触为主；呈现树突越细，非对称型突触越多，而对称型突触越少的特征。在运动皮层内未能找到Gly免疫反应性终末分布。 结论 首次观察到大脑运动皮层内确实存在甘氨酸能神经元，但目前尚不能肯定甘氨酸在皮层内是否具有神经递质的作用，有待进一步研究。
, 百拇医药
分类号：R322.81 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-1
DISTRIBUTION OF GLYCINE-IMMUNOREACTIVE PROFILES
IN THE RAT MOTOR CORTEX:A LIGHT AND
ELECTRON MICROSCOPIC STUDY
GAO Wen-Jun
(Shanghai Brain Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031,China)
ZHENG Ze-hui
, 百拇医药
(Shanghai Brain Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031,China)
Abstract：Objective It is known that glycine receptor(GlyR) exists extensively in motor cortex,but there is no report on the distribution and characteristics of glycinergic neurons in the cerebral cortex.Here it is the aim.Methods By means of immunocytochemical technique at the light and electronic microscopic level,we examined the morphological and ultrastructural characteristics of the glycinergic neurons in rat motor cortex.Results The Gly-ir neurons appeared in all layers,but mainly in layers Ⅰ-Ⅲ,fewer in layer Ⅴ and the least in layer Ⅵ.They were exclusively non-pyramidal shapes and were morphologically heterogeneous with soma size ranging from less than 10μm to greater than 15μm.However,the well-labeled neurons were predominantly small(41.5%) and medium(44%),some spindle-like(13.5%) and few large(1%) cells could also be observed.At the electron microscopic level,the somata of Gly-ir neurons received both of symmetric and asymmetric axosomatic synapses,but the symmetric type accounted for 80% of the total synapses.Likewise,these two types of synapse were also characterized on the Gly-ir dendrites,but the percentage of asymmetric synapses increased progressively with distance from soma.Conclusions These data first reported the presence of the Gly-ir neurons in the cerebral cortex.However,it remains unknown whether glycine acts as a neurotransmitter in neocortex, needs further studies.
, 百拇医药
Key words：Glycine;Immunocytochemistry;Electron microscopy;Motor cortex;Rat▲
甘氨酸(glycine,Gly)是中枢神经系统抑制性神经递质之一，而且是脊髓及部分脑干神经核团内中间神经元的主要抑制性递质，参与感觉传入及运动反射的调控[1]。然而，关于Gly在皮层内是否作为抑制性神经递质参与锥体神经元的调控至今仍不明了，并有较大的争议[2～4]。近年来有关Gly的许多生理、生化及受体的研究均表明，Gly可能是皮层内抑制性递质之一[2，3，5～7]，因为将甘氨酸拮抗剂士的宁(strychnine)直接用于大脑皮质可引起惊厥[8]。而微电泳Gly则可使皮层内约15%～20%的神经元的细胞膜电位超极化、放电频率阻断、EPSP-IPSP的幅度及膜阻抗降低，从而抑制皮层内神经元的活动[2，5]。Engblom等[6]证明皮层内Gly与GABAA受体一样，可介导Cl-内流而使神经元超极化。但也有研究证明Gly在大脑皮层的作用主要在于调制NMDA受体通道复合体、加强Glu的活性[4]。自从Gly受体(GlyR)抗体制备成功，人们发现GlyR广泛分布于皮层内锥体神经元胞体及顶树突[3，7]，而关于Gly-ir神经元在皮层内的分布及其特征却至今未见报道。为此，本实验用免疫组织化学与免疫电镜方法研究Gly免疫阳性神经元在运动皮层内的分布及其形态和超微结构特征。
, 百拇医药
材料和方法
雄性SD大鼠9只，体重180～250g。动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(42mg/kg)、由心脏灌流生理盐水100ml后，再充以0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)配制的4%多聚甲醛和0.5%～2.5%戊二醛溶液，灌流固定40～60min。取脑于4%多聚甲醛溶液中后固定1～2h，0.1mol/L PB(pH7.4)漂洗数次后，振动切片20～30μm,保存于0.1mol/L PB溶液中。免疫组织化学方法步骤如下：含3%正常羊血清(NGS)+0.03%Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液(PBS)2h；抗Gly多克隆抗体(1∶500～1 000,Chemicon)孵育液，4℃，48～72h；然后用羊抗兔lgG和兔-PAP复合物(均为1∶200，上海医科大学病理教研室产品)，室温下孵育1～2h；DAB显色。各步骤之间均以0.02mol/L PBS(pH7.4)充分漂洗。光镜切片经裱片、晾干、脱水、中性树指封片、显微镜观察。部分切片在光镜下选片后按电镜常规包埋，步骤简述如下：1%锇酸1h，升度丙酮脱水，Epon 812包埋于60℃,48h聚合。超薄切片，JEM-100CXll电镜观察并摄片。
, http://www.100md.com
对照试验：用3%NGS代替一抗做空白对照，染色结果呈阴性。
方法：(1)层次分布：选取3只大鼠运动皮层的5张20μm切片(Fr.1或Fr.3区)，在显微镜(×250)下通过Camera lucida将Gly-ir神经元描绘于白纸上，再从皮层表面至白质在纸上标出宽为500μm的柱状范围，层次的边界通过邻近焦油紫染色切片确定；然后计数每个层次的阳性细胞数，压在右、上线的细胞计数，而左、下线的细胞则不计。(2)细胞大小：在总放大倍数为500倍下，每一层测量50个阳性神经元(Ⅰ层：25个)的长、短径，再根据两者的平均直径和形态对神经元进行分类和计算百分比。(3)电镜观察：将电镜下观察到的阳性标记结构全部摄片并记录。在解剖镜下观察与测量电镜底片上阳性标记结构周围的各种终末形态。以有明显的突触小泡、突触前致密、突触后致密等特征作为突触部位。突触类型和突触所在部位按胞体及树突粗细统计并计算百分比。
结果
, 百拇医药
1.层次分布
甘氨酸免疫反应性神经元散在地分布于皮层内Ⅰ～Ⅵ层，其中Ⅱ～Ⅲ层相对较多，Ⅰ、Ⅴ层次之，Ⅵ层最低(图1～3)。在每500μm宽度的皮层范围内的平均阳性细胞数为37.3±3.16个。
2.细胞大小与形态
Gly-ir神经元为非锥体形神经元。在大鼠运动皮层内根据Gly-ir细胞的大、中、小以及有一种较明显是梭形的细胞来划分(图2，3；表1)，其中主要为中、小细胞，分别占44.0%和41.5%；大细胞极少见(1%)，梭形细胞相对较多，占13.5%。Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ层以中等大小细胞为主(56%)，Ⅰ、Ⅵ层则主要为小细胞(56%)。
图1 Camera lucida描绘的Gly-ir神经元的层次分布。在切片20μm厚，500μm宽的柱形方块内，其中Gly-ir神经元的数量较少，见于Ⅰ～Ⅵ层，以Ⅱ～Ⅲ层较多。标尺示200μm
, 百拇医药
Fig.1 Camera lucida drawing of the laminar distribution of the Gly immunoreactive neurons with 500μm width column in 20μm sections.Gly-ir cells sparsely distributed in layers Ⅰ-Ⅵ,among which they were slightly more in layer Ⅱ-Ⅲ.Bar=200μm
图2 Nomarski照片显示运动皮层Ⅰ～Ⅲ层Gly-ir神经元的分布。Gly-ir神经元也具有多种形态，且在Ⅱ～Ⅲ层较多，Ⅰ层偶有分布。箭头示Gly-ir神经元 标尺示75μm
Fig.2 Nomarski photograph showing the Gly-ir neurons in layer Ⅰ-Ⅲ of rat motor cortex.Gly-ir cells were relative more in layer Ⅱ-Ⅲ.Arrows indicating the Gly-ir neurons.Bar=75μm
, 百拇医药
图3 显示运动皮层Ⅴ层Gly-ir神经元的分布，数量较Ⅱ～Ⅲ层少。箭头示Gly-ir神经元 标尺示75μm
Fig.3 Nomarski photograph showing the Gly-ir neurons in layer Ⅴ.The number of immunoreactive neurons was less than those of layers Ⅱ-Ⅲ in comparison.Arrows indicating the Gly-ir neurons. Bar=75μm
表1 甘氨酸免疫反应性神经元胞体大小
和形态的百分率比较
Table 1 Comparison of Gly-ir neuronal somatic
, http://www.100md.com size and shape in percentage 大小或形态
size of shape
皮质层次
cortical layers
Ⅰ
Ⅱ-Ⅲ
Ⅴ
Ⅵ
平均
mean
≤10μm
62
, http://www.100md.com
36
18
50
41.5
10～15μm
32
46
66
32
44
≥15μm
0
2
, 百拇医药 2
0
1
梭形
spindle
6
16
14
18
13.5
合计(total)
100
100
, 百拇医药 100
100
100
3.电镜观察表2 大鼠运动皮层内甘氨酸神经元的突触分布
Table 2 The Distribution patterns of synapses on
Gly-ir neurons in rat motor cortex
总突触数
total No.of
synapses
非对称型突触(%)
, 百拇医药
asymmetric
synapses(%)
对称型突触(%)
symmetric
synapses(%)
胞体
soma
64
13(20.3)
51(79.7)
树突
dendrites
, 百拇医药
≥2μm
22
3(13.6)
19(86.4)
1～2μm
36
12(33.3)
24(66.7)
≤1μm
30
18(60.0)
12(40.0)
Gly-ir神经元胞体内Golgi体、内质网、线粒体等细胞器丰富。细胞核大，胞浆少，核膜内陷，呈现非锥体形神经元的特征。DAB絮状产物主要沉积于内质网膜表面与树突内微管表面。胞体表面可见对称型与非对称型两种突触类型，以含扁平或多形囊泡的对称型突触为主(79.7%)；含圆形清亮囊泡的非对称型突触相对较少(20.3%)(表2)。图4，5显示Gly-ir神经元胞体表面接受无免疫反应性的终末形成对称型突触(图4)和非对称型突触(图5)，以对称型突触多见。Gly-ir树突表面也可见两种类型突触。图6，7为粗细不同的两个树突截面，粗树突(>1μm,图6)上的突触分布与胞体类似，以对称型突触为主；而细树突(<1μm，图7)上则非对称型突触比例较高。表2为Gly-ir胞体与树突上的突触分布统计结果，可见随树突直径由粗变细，对称型突触越来越少，而非对称型突触越来越多。远端细小树突(直径<1μm)上非对称型突触占60%。在整个实验观察过程中，未能观察到Gly-ir终末。
, http://www.100md.com
图4 电镜照片显示Gly-ir神经元胞体表面对称型突触，两个无免疫反应性终末在Gly-ir神经元胞体上形成对称型突触(箭头) 标尺示0.5μm
Fig.4 Electron micrograph showing the symmetric synapses on the cell body of Gly-ir neuron.Two immunonegative axon terminals with flattened or pleomorphic vesicles formed symmetric synapses onto the Gly-ir cell body(arrows). Bar=0.5μm
图5 示Gly-ir神经元胞体上的两种类型突触。Gly-ir神经元胞体上既可见对称型突触(箭头)又可见非对称型突触(三角箭头) 标尺示0.5μm
, http://www.100md.com
Fig.5 Electron micrograph showing two types of synapse.Both the asymmetric (arrowhead) and symmetric (arrow) synapses could be observed on the Gly-ir cell body. Bar=0.5μm
图6 Gly-ir神经元树突的电镜观察。显示在较粗的树突(>1μm)上无免疫反应性终末形成对称型突触(箭头)与非对称型突触(三角箭头) 标尺示0.5μm
Fig.6 Electron micrograph showing the synapses on Gly-ir dendrties.A Gly-ir thick dendrite (>1μm) receiving two immunonegative axon terminals forming asymmetric (arrowhead) and symmetric (arrow) synapses respectively. Bar=0.5μm
, 百拇医药
图7 示Gly-ir细小树突(<1μm)上两个无免疫反应性的含球形囊泡S)终末形成非对称型突触(三角箭头) 标尺示0.5μm
Fig.7 The Gly-ir thin dendrite (<1μm) which received two immunonegative terminals with sphere vesicles (S-type) forming two asymmetric synapses(arrowheads). Bar=0.5μm
讨 论
在光镜下观察Gly-ir神经元是属于非锥体型神经元。以中、小细胞为主(约85%)，大细胞极少(1%)；其他为梭形细胞。与过去的工作相比较，可知Gly-ir神经元仅占皮层内GABA能神经元的1/5左右，在层次分布上，与GABA能神经元相似，在Ⅰ、Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ与Ⅵ层均有，只是在Ⅵ层，GABA能细胞以中等细胞为主(73%)，Gly-ir神经元则以小细胞为主(50%)。Parvalbumin免疫反应性神经元(PV-ir)是GABA能神经元的一种主要亚型，Gly-ir与PV-ir神经元相比则区别较大。皮层内Ⅰ层无PV-ir神经元分布，而Gly-ir则在Ⅰ层多见；并且PV主要标记中等细胞(78%)，小细胞相对较少(11%)；而Gly-ir则以小细胞比例较高(41.5%)[9]。
, 百拇医药
在电镜下的观察也证实了Gly-ir神经元具有典型的中间神经元的特征。在Gly-ir胞体与树突上可见两种类型突触。胞体上80%为对称型突触，20%为非对称型突触；树突上的突触分布则与树突粗细有关，树突越细，非对称型突触越多而对称型突触越少。这种突触的分布方式及数量百分比与DeFelipe等[11]报道的猴视皮层内GABA能篮状细胞一致。但与猴前额叶皮层内PV-ir的GABA能神经元[12]及小鼠感觉皮层内GABA能神经元[13]的突触分布不同。虽然这几位作者都未进行定量统计分析，但都报道PV或GABA能神经元胞体与树突表面以非对称型突触为主，对称型突触较少。这种矛盾结果出现的原因尚不清楚，可能与所观察神经元种类、层次、部位及动物种属等有关；也可能因Gly-ir神经元与GABA能神经元属不同类型的中间神经元。根据目前的结果尚难得出一致的结论。
现已证实Gly及其受体在中枢神经系统内的分布不均匀，Gly的含量在脊髓最高，脑干次之，前脑含量最少[14]。许多实验已经证明，Gly是脊髓及部分脑干神经核团的主要抑制性神经递质[1]。然而，Gly是否与GABA一样为大脑皮质内抑制性神经递质?目前还不能肯定。虽然电生理、生化试验均表明Gly满足神经递质的一些条件，如：(1)Gly可在神经元胞体内合成与运送；(2)存在相应的激动剂(如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等)与拮抗剂(如士的宁)；(3)有相应的Gly受体分布；(4)直接加入Gly可引起效应细胞特定的功能改变等。Levi等[5]也用生理及标记Gly前体Serine的方法证明Gly确可在皮层神经元突触体内快速合成并通过Ca2+依赖性释放，但是，到目前为止，在皮层内尚未找到Gly-ir终末存在的直接证据，因此，要证明Gly是否为皮层内抑制性神经递质还需进一步研究。
, 百拇医药
感谢毛金标老师和徐慧娟老师在图片处理上的大力帮助。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570244)
作者简介：高文军(1963—)，男，四川省人，美国耶鲁大学博士后
参考文献：
[1]Carlton SM,Hargett GL,Coggeshall RE.Distribution of glycine-immunoreactive profiles in the monkey spinalcord:a light microscopic and ultrastructural study[J].J Comp Neurol,1996,371(3):589-602.
[2]Bernardi G,Cherubini E,Marciani MG,et al.The inhibitory action of glycine on rat cortical neurons[J].Neurosci Lett, 1979,12(2):335-338.
, 百拇医药
[3]Becker CM,Betz H,Schroder H.Expression of inhibitory glycine receptors in postnatal rat cerebral cortex[J].Brain Res,1993,606(2):220-226.
[4]Thomson AM.Glycine is a coagonist at the NMDA receptor/channel complex[J].Prog Neurobiol,1990,35(1):53-74.
[5]Levi.Evidence in favor of a neurotransmitter role of glycine in the rat cerebral cortex[J].Brain Res,1982,236(1):121-131.
[6]Engblom AC,Eriksson KS,Akerman KEO.Glycine and GABAA receptor-mediated chloride fluxes in synaptoneurosomes from different parts of the rat brain[J].Brain Res,1996,712(1):74-83.
, 百拇医药
[7]Naas E,Zilles K,Gnahn H,et al.Glycine receptor immunoreactivity in rat and human cerebral cortex[J].Brain Res,1991,561(1):139-146.
[8]Biscoe TJ,Curtis DR.Strychine and cortical inhibition[J].Nature,1967,214(91):914-915.
[9]高文军，郑则慧.Parvalbumin免疫阳性神经元在大鼠运动皮层的分布[J].解剖学杂志，1996年增刊：130.
[10]Fairen A,DeFelipe J,Regider J.Nonpyramidal neurons:general account.In:Peters and Jones EG(eds):Cerebral Cortex Vol.1,cellular components of the cerebral cortex[M].New York:Plenum Press,1984:201-253.
, 百拇医药
[11]DeFelipe J,Hendry SHC,Jones EG.A correlative electron microscopic study of basket cells and large GABAergic neurons in the monkey sensory-motor cortex[J].Neurosci,1986,17(4):991-1009.
[12]Williams SM,Goldman-Rakic PS,Leranth C.The synaptology of parvalbumin immunoreactive neurons in the primate prefrontal cortex[J].J Comp Neurol,1992,320(3):353-369.
[13]Kellers A,White EL.Synaptic organization of GABAergic neurons in the mouse Sml cortex[J].J Comp Neurol,1987,262(1):1-12.
[14]Van den Pol AN,Gorcs T.Glycine and glycine receptor immunoreactivity in brain and spinal cord[J].J Neurosci,1988,8(2):472-492.
收稿日期：1998-12-01
修回日期：1999-04-27, 百拇医药
单位：高文军(中国科学院上海脑研究所，上海 200031)；郑则慧(中国科学院上海脑研究所，上海 200031)
关键词：甘氨酸；免疫组织化学；电镜；运动皮层；大鼠
解剖学报000101 摘 要：目的 探讨甘氨酸能神经元(Gly-ir)在大脑皮层内的分布及特征。 方法 用免疫组织化学与免疫电镜方法，在光镜与电镜水平观察甘氨酸免疫反应性神经元在大鼠运动皮层内的分布及其超微结构特征。 结果 甘氨酸免疫反应性神经元均为非锥体细胞，在运动皮层内Ⅰ～Ⅵ层均有分布，以Ⅰ～Ⅲ层较多，Ⅵ层最少，免疫反应性细胞以小细胞(41.5%)及中等大小细胞(44%)为主，也可见少量梭形细胞(13.5%)，而大细胞极少(1%)。这些不同形态与大小的细胞也有层次分布的特征：Ⅰ、Ⅵ层以小细胞为主，而Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ层则以中等大小细胞为主。电镜下，甘氨酸免疫反应性神经元呈现中间神经元的特征：胞体小、核大浆少、核内陷。胞体上既可见具有扁平或多形囊泡的终末形成的对称型突触(79.7%)，也可见含球形、清亮囊泡的终末形成的非对称型突触(20.3%)。它的树突上也可见这两种突触类型，近端树突上与胞体相似，以对称型突触为主；而远端细小树突(直径<1μm)上则以非对称型突触为主；呈现树突越细，非对称型突触越多，而对称型突触越少的特征。在运动皮层内未能找到Gly免疫反应性终末分布。 结论 首次观察到大脑运动皮层内确实存在甘氨酸能神经元，但目前尚不能肯定甘氨酸在皮层内是否具有神经递质的作用，有待进一步研究。
, 百拇医药
分类号：R322.81 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-1
DISTRIBUTION OF GLYCINE-IMMUNOREACTIVE PROFILES
IN THE RAT MOTOR CORTEX:A LIGHT AND
ELECTRON MICROSCOPIC STUDY
GAO Wen-Jun
(Shanghai Brain Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031,China)
ZHENG Ze-hui
, 百拇医药
(Shanghai Brain Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031,China)
Abstract：Objective It is known that glycine receptor(GlyR) exists extensively in motor cortex,but there is no report on the distribution and characteristics of glycinergic neurons in the cerebral cortex.Here it is the aim.Methods By means of immunocytochemical technique at the light and electronic microscopic level,we examined the morphological and ultrastructural characteristics of the glycinergic neurons in rat motor cortex.Results The Gly-ir neurons appeared in all layers,but mainly in layers Ⅰ-Ⅲ,fewer in layer Ⅴ and the least in layer Ⅵ.They were exclusively non-pyramidal shapes and were morphologically heterogeneous with soma size ranging from less than 10μm to greater than 15μm.However,the well-labeled neurons were predominantly small(41.5%) and medium(44%),some spindle-like(13.5%) and few large(1%) cells could also be observed.At the electron microscopic level,the somata of Gly-ir neurons received both of symmetric and asymmetric axosomatic synapses,but the symmetric type accounted for 80% of the total synapses.Likewise,these two types of synapse were also characterized on the Gly-ir dendrites,but the percentage of asymmetric synapses increased progressively with distance from soma.Conclusions These data first reported the presence of the Gly-ir neurons in the cerebral cortex.However,it remains unknown whether glycine acts as a neurotransmitter in neocortex, needs further studies.
, 百拇医药
Key words：Glycine;Immunocytochemistry;Electron microscopy;Motor cortex;Rat▲
甘氨酸(glycine,Gly)是中枢神经系统抑制性神经递质之一，而且是脊髓及部分脑干神经核团内中间神经元的主要抑制性递质，参与感觉传入及运动反射的调控[1]。然而，关于Gly在皮层内是否作为抑制性神经递质参与锥体神经元的调控至今仍不明了，并有较大的争议[2～4]。近年来有关Gly的许多生理、生化及受体的研究均表明，Gly可能是皮层内抑制性递质之一[2，3，5～7]，因为将甘氨酸拮抗剂士的宁(strychnine)直接用于大脑皮质可引起惊厥[8]。而微电泳Gly则可使皮层内约15%～20%的神经元的细胞膜电位超极化、放电频率阻断、EPSP-IPSP的幅度及膜阻抗降低，从而抑制皮层内神经元的活动[2，5]。Engblom等[6]证明皮层内Gly与GABAA受体一样，可介导Cl-内流而使神经元超极化。但也有研究证明Gly在大脑皮层的作用主要在于调制NMDA受体通道复合体、加强Glu的活性[4]。自从Gly受体(GlyR)抗体制备成功，人们发现GlyR广泛分布于皮层内锥体神经元胞体及顶树突[3，7]，而关于Gly-ir神经元在皮层内的分布及其特征却至今未见报道。为此，本实验用免疫组织化学与免疫电镜方法研究Gly免疫阳性神经元在运动皮层内的分布及其形态和超微结构特征。
, 百拇医药
材料和方法
雄性SD大鼠9只，体重180～250g。动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(42mg/kg)、由心脏灌流生理盐水100ml后，再充以0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)配制的4%多聚甲醛和0.5%～2.5%戊二醛溶液，灌流固定40～60min。取脑于4%多聚甲醛溶液中后固定1～2h，0.1mol/L PB(pH7.4)漂洗数次后，振动切片20～30μm,保存于0.1mol/L PB溶液中。免疫组织化学方法步骤如下：含3%正常羊血清(NGS)+0.03%Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液(PBS)2h；抗Gly多克隆抗体(1∶500～1 000,Chemicon)孵育液，4℃，48～72h；然后用羊抗兔lgG和兔-PAP复合物(均为1∶200，上海医科大学病理教研室产品)，室温下孵育1～2h；DAB显色。各步骤之间均以0.02mol/L PBS(pH7.4)充分漂洗。光镜切片经裱片、晾干、脱水、中性树指封片、显微镜观察。部分切片在光镜下选片后按电镜常规包埋，步骤简述如下：1%锇酸1h，升度丙酮脱水，Epon 812包埋于60℃,48h聚合。超薄切片，JEM-100CXll电镜观察并摄片。
, http://www.100md.com
对照试验：用3%NGS代替一抗做空白对照，染色结果呈阴性。
方法：(1)层次分布：选取3只大鼠运动皮层的5张20μm切片(Fr.1或Fr.3区)，在显微镜(×250)下通过Camera lucida将Gly-ir神经元描绘于白纸上，再从皮层表面至白质在纸上标出宽为500μm的柱状范围，层次的边界通过邻近焦油紫染色切片确定；然后计数每个层次的阳性细胞数，压在右、上线的细胞计数，而左、下线的细胞则不计。(2)细胞大小：在总放大倍数为500倍下，每一层测量50个阳性神经元(Ⅰ层：25个)的长、短径，再根据两者的平均直径和形态对神经元进行分类和计算百分比。(3)电镜观察：将电镜下观察到的阳性标记结构全部摄片并记录。在解剖镜下观察与测量电镜底片上阳性标记结构周围的各种终末形态。以有明显的突触小泡、突触前致密、突触后致密等特征作为突触部位。突触类型和突触所在部位按胞体及树突粗细统计并计算百分比。
结果
, 百拇医药
1.层次分布
甘氨酸免疫反应性神经元散在地分布于皮层内Ⅰ～Ⅵ层，其中Ⅱ～Ⅲ层相对较多，Ⅰ、Ⅴ层次之，Ⅵ层最低(图1～3)。在每500μm宽度的皮层范围内的平均阳性细胞数为37.3±3.16个。
2.细胞大小与形态
Gly-ir神经元为非锥体形神经元。在大鼠运动皮层内根据Gly-ir细胞的大、中、小以及有一种较明显是梭形的细胞来划分(图2，3；表1)，其中主要为中、小细胞，分别占44.0%和41.5%；大细胞极少见(1%)，梭形细胞相对较多，占13.5%。Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ层以中等大小细胞为主(56%)，Ⅰ、Ⅵ层则主要为小细胞(56%)。
图1 Camera lucida描绘的Gly-ir神经元的层次分布。在切片20μm厚，500μm宽的柱形方块内，其中Gly-ir神经元的数量较少，见于Ⅰ～Ⅵ层，以Ⅱ～Ⅲ层较多。标尺示200μm
, 百拇医药
Fig.1 Camera lucida drawing of the laminar distribution of the Gly immunoreactive neurons with 500μm width column in 20μm sections.Gly-ir cells sparsely distributed in layers Ⅰ-Ⅵ,among which they were slightly more in layer Ⅱ-Ⅲ.Bar=200μm
图2 Nomarski照片显示运动皮层Ⅰ～Ⅲ层Gly-ir神经元的分布。Gly-ir神经元也具有多种形态，且在Ⅱ～Ⅲ层较多，Ⅰ层偶有分布。箭头示Gly-ir神经元 标尺示75μm
Fig.2 Nomarski photograph showing the Gly-ir neurons in layer Ⅰ-Ⅲ of rat motor cortex.Gly-ir cells were relative more in layer Ⅱ-Ⅲ.Arrows indicating the Gly-ir neurons.Bar=75μm
, 百拇医药
图3 显示运动皮层Ⅴ层Gly-ir神经元的分布，数量较Ⅱ～Ⅲ层少。箭头示Gly-ir神经元 标尺示75μm
Fig.3 Nomarski photograph showing the Gly-ir neurons in layer Ⅴ.The number of immunoreactive neurons was less than those of layers Ⅱ-Ⅲ in comparison.Arrows indicating the Gly-ir neurons. Bar=75μm
表1 甘氨酸免疫反应性神经元胞体大小
和形态的百分率比较
Table 1 Comparison of Gly-ir neuronal somatic
, http://www.100md.com size and shape in percentage 大小或形态
size of shape
皮质层次
cortical layers
Ⅰ
Ⅱ-Ⅲ
Ⅴ
Ⅵ
平均
mean
≤10μm
62
, http://www.100md.com
36
18
50
41.5
10～15μm
32
46
66
32
44
≥15μm
0
2
, 百拇医药 2
0
1
梭形
spindle
6
16
14
18
13.5
合计(total)
100
100
, 百拇医药 100
100
100
3.电镜观察表2 大鼠运动皮层内甘氨酸神经元的突触分布
Table 2 The Distribution patterns of synapses on
Gly-ir neurons in rat motor cortex
总突触数
total No.of
synapses
非对称型突触(%)
, 百拇医药
asymmetric
synapses(%)
对称型突触(%)
symmetric
synapses(%)
胞体
soma
64
13(20.3)
51(79.7)
树突
dendrites
, 百拇医药
≥2μm
22
3(13.6)
19(86.4)
1～2μm
36
12(33.3)
24(66.7)
≤1μm
30
18(60.0)
12(40.0)
Gly-ir神经元胞体内Golgi体、内质网、线粒体等细胞器丰富。细胞核大，胞浆少，核膜内陷，呈现非锥体形神经元的特征。DAB絮状产物主要沉积于内质网膜表面与树突内微管表面。胞体表面可见对称型与非对称型两种突触类型，以含扁平或多形囊泡的对称型突触为主(79.7%)；含圆形清亮囊泡的非对称型突触相对较少(20.3%)(表2)。图4，5显示Gly-ir神经元胞体表面接受无免疫反应性的终末形成对称型突触(图4)和非对称型突触(图5)，以对称型突触多见。Gly-ir树突表面也可见两种类型突触。图6，7为粗细不同的两个树突截面，粗树突(>1μm,图6)上的突触分布与胞体类似，以对称型突触为主；而细树突(<1μm，图7)上则非对称型突触比例较高。表2为Gly-ir胞体与树突上的突触分布统计结果，可见随树突直径由粗变细，对称型突触越来越少，而非对称型突触越来越多。远端细小树突(直径<1μm)上非对称型突触占60%。在整个实验观察过程中，未能观察到Gly-ir终末。
, http://www.100md.com
图4 电镜照片显示Gly-ir神经元胞体表面对称型突触，两个无免疫反应性终末在Gly-ir神经元胞体上形成对称型突触(箭头) 标尺示0.5μm
Fig.4 Electron micrograph showing the symmetric synapses on the cell body of Gly-ir neuron.Two immunonegative axon terminals with flattened or pleomorphic vesicles formed symmetric synapses onto the Gly-ir cell body(arrows). Bar=0.5μm
图5 示Gly-ir神经元胞体上的两种类型突触。Gly-ir神经元胞体上既可见对称型突触(箭头)又可见非对称型突触(三角箭头) 标尺示0.5μm
, http://www.100md.com
Fig.5 Electron micrograph showing two types of synapse.Both the asymmetric (arrowhead) and symmetric (arrow) synapses could be observed on the Gly-ir cell body. Bar=0.5μm
图6 Gly-ir神经元树突的电镜观察。显示在较粗的树突(>1μm)上无免疫反应性终末形成对称型突触(箭头)与非对称型突触(三角箭头) 标尺示0.5μm
Fig.6 Electron micrograph showing the synapses on Gly-ir dendrties.A Gly-ir thick dendrite (>1μm) receiving two immunonegative axon terminals forming asymmetric (arrowhead) and symmetric (arrow) synapses respectively. Bar=0.5μm
, 百拇医药
图7 示Gly-ir细小树突(<1μm)上两个无免疫反应性的含球形囊泡S)终末形成非对称型突触(三角箭头) 标尺示0.5μm
Fig.7 The Gly-ir thin dendrite (<1μm) which received two immunonegative terminals with sphere vesicles (S-type) forming two asymmetric synapses(arrowheads). Bar=0.5μm
讨 论
在光镜下观察Gly-ir神经元是属于非锥体型神经元。以中、小细胞为主(约85%)，大细胞极少(1%)；其他为梭形细胞。与过去的工作相比较，可知Gly-ir神经元仅占皮层内GABA能神经元的1/5左右，在层次分布上，与GABA能神经元相似，在Ⅰ、Ⅱ～Ⅲ、Ⅴ与Ⅵ层均有，只是在Ⅵ层，GABA能细胞以中等细胞为主(73%)，Gly-ir神经元则以小细胞为主(50%)。Parvalbumin免疫反应性神经元(PV-ir)是GABA能神经元的一种主要亚型，Gly-ir与PV-ir神经元相比则区别较大。皮层内Ⅰ层无PV-ir神经元分布，而Gly-ir则在Ⅰ层多见；并且PV主要标记中等细胞(78%)，小细胞相对较少(11%)；而Gly-ir则以小细胞比例较高(41.5%)[9]。
, 百拇医药
在电镜下的观察也证实了Gly-ir神经元具有典型的中间神经元的特征。在Gly-ir胞体与树突上可见两种类型突触。胞体上80%为对称型突触，20%为非对称型突触；树突上的突触分布则与树突粗细有关，树突越细，非对称型突触越多而对称型突触越少。这种突触的分布方式及数量百分比与DeFelipe等[11]报道的猴视皮层内GABA能篮状细胞一致。但与猴前额叶皮层内PV-ir的GABA能神经元[12]及小鼠感觉皮层内GABA能神经元[13]的突触分布不同。虽然这几位作者都未进行定量统计分析，但都报道PV或GABA能神经元胞体与树突表面以非对称型突触为主，对称型突触较少。这种矛盾结果出现的原因尚不清楚，可能与所观察神经元种类、层次、部位及动物种属等有关；也可能因Gly-ir神经元与GABA能神经元属不同类型的中间神经元。根据目前的结果尚难得出一致的结论。
现已证实Gly及其受体在中枢神经系统内的分布不均匀，Gly的含量在脊髓最高，脑干次之，前脑含量最少[14]。许多实验已经证明，Gly是脊髓及部分脑干神经核团的主要抑制性神经递质[1]。然而，Gly是否与GABA一样为大脑皮质内抑制性神经递质?目前还不能肯定。虽然电生理、生化试验均表明Gly满足神经递质的一些条件，如：(1)Gly可在神经元胞体内合成与运送；(2)存在相应的激动剂(如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等)与拮抗剂(如士的宁)；(3)有相应的Gly受体分布；(4)直接加入Gly可引起效应细胞特定的功能改变等。Levi等[5]也用生理及标记Gly前体Serine的方法证明Gly确可在皮层神经元突触体内快速合成并通过Ca2+依赖性释放，但是，到目前为止，在皮层内尚未找到Gly-ir终末存在的直接证据，因此，要证明Gly是否为皮层内抑制性神经递质还需进一步研究。
, 百拇医药
感谢毛金标老师和徐慧娟老师在图片处理上的大力帮助。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570244)
作者简介：高文军(1963—)，男，四川省人，美国耶鲁大学博士后
参考文献：
[1]Carlton SM,Hargett GL,Coggeshall RE.Distribution of glycine-immunoreactive profiles in the monkey spinalcord:a light microscopic and ultrastructural study[J].J Comp Neurol,1996,371(3):589-602.
[2]Bernardi G,Cherubini E,Marciani MG,et al.The inhibitory action of glycine on rat cortical neurons[J].Neurosci Lett, 1979,12(2):335-338.
, 百拇医药
[3]Becker CM,Betz H,Schroder H.Expression of inhibitory glycine receptors in postnatal rat cerebral cortex[J].Brain Res,1993,606(2):220-226.
[4]Thomson AM.Glycine is a coagonist at the NMDA receptor/channel complex[J].Prog Neurobiol,1990,35(1):53-74.
[5]Levi.Evidence in favor of a neurotransmitter role of glycine in the rat cerebral cortex[J].Brain Res,1982,236(1):121-131.
[6]Engblom AC,Eriksson KS,Akerman KEO.Glycine and GABAA receptor-mediated chloride fluxes in synaptoneurosomes from different parts of the rat brain[J].Brain Res,1996,712(1):74-83.
, 百拇医药
[7]Naas E,Zilles K,Gnahn H,et al.Glycine receptor immunoreactivity in rat and human cerebral cortex[J].Brain Res,1991,561(1):139-146.
[8]Biscoe TJ,Curtis DR.Strychine and cortical inhibition[J].Nature,1967,214(91):914-915.
[9]高文军，郑则慧.Parvalbumin免疫阳性神经元在大鼠运动皮层的分布[J].解剖学杂志，1996年增刊：130.
[10]Fairen A,DeFelipe J,Regider J.Nonpyramidal neurons:general account.In:Peters and Jones EG(eds):Cerebral Cortex Vol.1,cellular components of the cerebral cortex[M].New York:Plenum Press,1984:201-253.
, 百拇医药
[11]DeFelipe J,Hendry SHC,Jones EG.A correlative electron microscopic study of basket cells and large GABAergic neurons in the monkey sensory-motor cortex[J].Neurosci,1986,17(4):991-1009.
[12]Williams SM,Goldman-Rakic PS,Leranth C.The synaptology of parvalbumin immunoreactive neurons in the primate prefrontal cortex[J].J Comp Neurol,1992,320(3):353-369.
[13]Kellers A,White EL.Synaptic organization of GABAergic neurons in the mouse Sml cortex[J].J Comp Neurol,1987,262(1):1-12.
[14]Van den Pol AN,Gorcs T.Glycine and glycine receptor immunoreactivity in brain and spinal cord[J].J Neurosci,1988,8(2):472-492.
收稿日期：1998-12-01
修回日期：1999-04-27, 百拇医药