用BrdU标记技术观察大鼠脊髓上胸段灰质细胞的分化发育
作者：沈伟哉 郭国庆 卢洪伟
单位：沈伟哉(暨南大学医学院解剖学教研室，广州 510630)；郭国庆(暨南大学医学院解剖学教研室，广州 510630)；卢洪伟(香港中文大学医学院解剖学系)
关键词：5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)；脊髓；发育；移植；大鼠
解剖学报000401 【摘要】 目的 观察脊髓灰质细胞的分化发育，寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。 方法 用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记DNA，ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。 结果孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角的BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元增多；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E13d、E14d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元。 结论 BrdU标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞，胎鼠脊髓进行BrdU标记的最佳时间应选择E12d，已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间为E13d。观察脊髓灰质细胞的分化发育，寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。 方法 用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记DNA，ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。 结果孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角的BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元增多；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E13d、E14d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元。 结论 BrdU标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞，胎鼠脊髓进行BrdU标记的最佳时间应选择E12d，已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间为E13d。
, 百拇医药
【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-289
APPLICATION OF BrdU LABEL TECHNIQUE FOR STUDYING
DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT OF SUPERIOR
THORACIC GRAY MATTER OF RAT SPINAL CORD
SHEN Wei-zai GUO Guo-qing
(Department of Anatomy,Medical College,Jinan University,Guangzhou 510630,China)
, 百拇医药 LU Hong-wei
(Department of Anatomy,Faculty of Medicine,the Chinese University of Hong Kong,China)
【Abstract】 Objective
To search for appropriate time of embryonic spinal grafting,we have observed the differentiation and development of cells of spinal gray matter. Methods The development and proliferation of spinal gray matter cells of superior thoracic spinal cord were observed by using 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU) to mark DNA and ABC immunocytochemical technique. Results When pregnant rat at E10d was given BrdU by intraperitoneal injection,most of BrdU immunoreactive neurons were located in posterior horn of superior thoracic segment of spinal cord in embronic rat,only a few of BrdU immunoreactive neurons appeared in anterior horn and lateral horn.Given BrdU at E11d,the number of BrdU immunoreactive neurons decreased in posterior horn and increased in anterior and lateral horn of superior thoracic segment of spinal cord in embronic rat.Given BrdU at E12d,most of BrdU immunoreactive neurons were mainly found in anterior and lateral horn of superior thoracic segment of spinal cord in embronic rat,only a few of BrdU immunoreactive neurons appeared in posterior horn. Conclusions BrdU label technique might be a good method for symbolizing cells of spinal gray matter,the appropriate time of BrdU symbol was at E12d,the perfect time of embryonic spinal graft symbolized by BrdU was at E13d.
, 百拇医药
【Key words】 5-bromo-2-deoxyuridine; Spinal cord; Development; Graft; Rat
有关脊髓损伤后神经再生和功能修复的研究已有近百年的历史，但由于神经元轴突再生能力极其有限[1]，人们试图通过胚胎神经组织的脊髓内移植，达到脊髓损伤后的神经再生和功能修复的目的[2]。胚胎脊髓是一种低分化神经组织，在被移植后可继续生长分化，并向宿主脊髓投送新生的神经纤维[3]，近年来，人们已开始用富含运动神经元的脊髓腹侧组织植入被特异性损毁运动神经元的大鼠脊髓内，但对供体神经组织取材的最佳时间尚不统一[4～6]，由于发育分化后的胎鼠脊髓组织与成体脊髓非常相似，难以辨别，所以人们开始考虑引入神经标记技术[4]。本实验用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记DNA，并用抗BrdU单克隆抗体进行ABC免疫细胞化学染色，观察大鼠脊髓灰质细胞的增殖分化情况，以期了解脊髓灰质细胞分化完成的确切时间，寻找供体组织取材的适合时间，为下一步进行脊髓移植提供实验资料。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 实验动物
实验用健康雄性SD大鼠18只，以上午8∶00阴栓出现确定受孕时间。孕鼠分别于受孕后E10、E11、E12、E13和E14d共5个时间，于母体腹腔注射BrdU(Sigma B5002)25g/2L生理盐水，每隔2.5h注射1次，共6次，BrdU总量150mg/只。每个时间点3～4只大鼠。
2. ABC免疫细胞化学染色
于E17d，深麻醉下取胎鼠放入4%多聚甲醛(4℃)，固定8d。在手术显微镜下取胎鼠上胸段脊髓，入10%蔗糖磷酸缓冲液2h，再入30%蔗糖磷酸缓冲液至沉底。恒冷箱切片机(-20℃)切片，片厚20μm，所有切片均为脊髓横切面。用抗BrdU单克隆抗体(Sigma,B-2531)进行ABC免疫细胞化学染色；简要过程如下：(1)4N HCl，室温，10min；(2)0.3% H\-2O\-2，室温，5min；(3)正常羊血清，室温，1h(不冲洗)；(4)1∶1 500兔抗BrdU单克隆抗体，4℃，湿盒，24h；(5)1∶200生物素化羊抗兔IgG抗体，4℃，湿盒，4h;(6)1∶100 ABC复合物，4℃，湿盒，4h；(7)用葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-硫酸镍铵(GDN)法呈色5min；以上各步骤前后均用0.01mol/L PBS(pH7.35)漂洗3×10min；常规脱水、透明、封片。染色结果用Olympus BH-2显微镜观察并摄片。本实验用0.01mol/L PBS或正常羊血清替代第一抗体作为阴性对照。
, 百拇医药
结果
孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元(图1)；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元较E10d增多(图2)；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元(图3)；孕鼠于E13、E14d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元出现。各例鼠胎脊髓的部分相邻切片以磷酸缓冲液替代抗BrdU第一抗体后未见BrdU免疫反应神经元(图4)。各实验组BrdU标记结果稳定，形态学变化基本一致。
讨论
细胞增殖周期包括G1、S、G2和M 4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。作为一种嘧啶类似物，其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环与5位C原子连接的甲基被Br代替，当细胞处于DNA合成期而同时有BrdU存在时就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU在胞核的DNA中存留将是永久的。BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，经免疫组织化学染色可观察BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU标记和检测的准确性高，而且方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖的理想指标[7～9]。有报道认为，标记BrdU的细胞只要不受到紫外线的照射对细胞没有功能损害[10]。我们的研究显示，标记BrdU的神经元能继续生存，细胞核形态上与未标记BrdU的神经元无明显区别，提示标记BrdU的神经元在结构和功能上都保持了较好的完整性。
, http://www.100md.com
脊髓移植的成败除受受体组织状态的影响外，另一关键是供体组织胎龄的选择，胚胎脊髓神经组织分化程度较低，在受体脊髓内有较强的可塑性，但神经元的分裂有明显的时间性，因此选择适宜的时间十分重要。对于供体组织的取材时间各家报道不一，Clowry等[5]认为在E12d时效果较好，但李兵仓等[6]却认为E14d为最佳的取材时间。就脊髓来说，各段脊髓神经元分裂的先后不同；同一脊髓段的不同神经元的分裂次序也不一样。本研究结果显示，在胎鼠上胸段脊髓，后角区域的神经元分裂期约在E10～11d；中间带区域的神经元分裂期约在E11～12d；前角区域的神经元(主要含运动神经元)其分裂期约在E12～13d。而E13d以后，上胸段脊髓神经元的分裂已基本结束。提示，进行脊髓内胎鼠脊髓移植时，若目的主要是观察运动功能的恢复，则行BrdU的标记的最佳时间应选择E12d；而已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间，虽然晚至E15～17d都是可行的，但基于神经元越年轻可塑性越好的原理，取E13d上胸段大鼠脊髓的腹侧半较合理。
, http://www.100md.com 本文图1～4见插图第1页
图1 E10d腹腔注射BrdU，E17d脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角(PH)，脊髓侧角(LH)阳性神经元较少，前角(AH)仅有少量的BrdU免疫反应神经元。标尺1.0cm=0.3mm(图2～4同此)
Fig.1 When pregnant rat at E10d was given BrdU by intraperitoneal injection,most of BrdU immunoreactive neurons were located in posterior horn(PH) of superior thoracic segment of spinal cord in rat,only few of BrdU immunoreactive neurons appeared in anterior horn(AH) and lateral horn(LH).Bar 1.0cm=0.3mm
, http://www.100md.com
图2 E11d腹腔注射BrdU，E17d脊髓上胸段后角(PH)BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角(LH)和前角(AH)BrdU免疫反应神经元较E10d增多。
Fig.2 Given BrdU at E11d,the number of BrdU immunoreactive neurons decreased in posterior horn(PH) of superior thoracic segment of spinal cord in rat,BrdU immuoreactive neurons in anterior horn(AH) and lateral lorn(LH) increased,when compared with these at E10d.Bar 1.0cm=0.3mm
图3 E12d腹腔注射BrdU，E17d脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角(AH)和侧角(LH)，后角(PH)仅有少量的BrdU免疫反应神经元。
, 百拇医药
Fig.3 Given BrdU at E12d,most of BrdU immunoreactive neurons were located in anterior horn(AH) and lateral horn(LH) of superior thoracic segment of spinal cord in rat,only few of BrdU immunoreactive neurons appeared in posterior horn(PH) horn(LH).Bar 1.0cm=0.3mm
图4 以磷酸缓冲液替代抗BrdU第一抗体后，未见有BrdU免疫反应神经元。
Fig.4 When phosphatic buffer substituted for the first anti-Brdu antibody,no BrdU immunoreactive neurons appeared.Bar 1.0cm=0.3mm
, http://www.100md.com
【基金项目】 国务院侨办重点科研基金资助项目(93-95-46)
【作者简介】 沈伟哉(1956—)，男(汉族)，上海市人，医学博士，副教授
参考文献
[1]郭畹华.胶质细胞与神经再生[J].解剖学报，1993，24(4)：424～430.
[2]Sieradzan K,Vrbova G.Replacement of missing motoneurons by grafts in the rat spinal cord[J].Neurosci,1989,31(1):115-130.
[3]Reier PJ,Anderson DK,Thompson F,et al.Neural tissue transplantation and CNS trauma:anatomical and functional repair of the injured spinal cord[J].J Neurotrauma,1992,9(suppl 1):S223-248.
, http://www.100md.com
[4]黄巨恩，郭畹华，曾园山.缺损运动神经元的大鼠脊髓内胚胎脊髓移植的存活与生长[J].解剖学报，1995，26(3)：252～255.
[5]Clowry GJ,Vrbova G.Observations on the development of transplanted embryonic ventral horn neurons grafted into adult rat spinal cord and connected to skeletal muscle implants via a peripheral nerve[J].Exp Brain Res,1992,91(2):249-258.
[6]李兵仓，王正国，廖维宏，等.妊14d脊髓植入成鼠损伤脊髓前后的发育变化[J].解剖学杂志，1997，20(1)：12～16.
[7]Gratzner HG.Monoclonal antibody to 5-bromo and 5-iododeoxyuridine: a new reagent for detection of DNA replication[J].Science,1982,218(4571):474-475.
, 百拇医药
[8]Nakamura S,Takeda Y,Kanno M,et al.Application of bromodeoxyuridine(BrdU) and anti-BrdU monoclonal antibody for the in vivo analysis of proliferative characteristics of human leukemia cells in bone marrows[J].Oncology,1991,48(4):285-289.
[9]陈广平，郭慕依，陈琦，等.应用BrdU单抗免疫组化染色观察大鼠系膜细胞生长情况[J].上海医科大学学报，1996，23(4)：305～306.
[10]王承龙，王绮如.应用BrdU测定造血细胞自杀率[J].湖南医科大学学报，1992，17(1)：19～21.
【收稿日期】 1999-10-08
【修回日期】 2000-02-03, 百拇医药
单位：沈伟哉(暨南大学医学院解剖学教研室，广州 510630)；郭国庆(暨南大学医学院解剖学教研室，广州 510630)；卢洪伟(香港中文大学医学院解剖学系)
关键词：5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)；脊髓；发育；移植；大鼠
解剖学报000401 【摘要】 目的 观察脊髓灰质细胞的分化发育，寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。 方法 用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记DNA，ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。 结果孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角的BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元增多；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E13d、E14d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元。 结论 BrdU标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞，胎鼠脊髓进行BrdU标记的最佳时间应选择E12d，已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间为E13d。观察脊髓灰质细胞的分化发育，寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。 方法 用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)标记DNA，ABC免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。 结果孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角的BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元增多；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元；孕鼠于E13d、E14d腹腔注射BrdU，胎鼠脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元。 结论 BrdU标记技术能较好的标记脊髓灰质细胞，胎鼠脊髓进行BrdU标记的最佳时间应选择E12d，已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间为E13d。
, 百拇医药
【中图分类号】 R322.81 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-289
APPLICATION OF BrdU LABEL TECHNIQUE FOR STUDYING
DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT OF SUPERIOR
THORACIC GRAY MATTER OF RAT SPINAL CORD
SHEN Wei-zai GUO Guo-qing
(Department of Anatomy,Medical College,Jinan University,Guangzhou 510630,China)
, 百拇医药 LU Hong-wei
(Department of Anatomy,Faculty of Medicine,the Chinese University of Hong Kong,China)
【Abstract】 Objective
To search for appropriate time of embryonic spinal grafting,we have observed the differentiation and development of cells of spinal gray matter. Methods The development and proliferation of spinal gray matter cells of superior thoracic spinal cord were observed by using 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU) to mark DNA and ABC immunocytochemical technique. Results When pregnant rat at E10d was given BrdU by intraperitoneal injection,most of BrdU immunoreactive neurons were located in posterior horn of superior thoracic segment of spinal cord in embronic rat,only a few of BrdU immunoreactive neurons appeared in anterior horn and lateral horn.Given BrdU at E11d,the number of BrdU immunoreactive neurons decreased in posterior horn and increased in anterior and lateral horn of superior thoracic segment of spinal cord in embronic rat.Given BrdU at E12d,most of BrdU immunoreactive neurons were mainly found in anterior and lateral horn of superior thoracic segment of spinal cord in embronic rat,only a few of BrdU immunoreactive neurons appeared in posterior horn. Conclusions BrdU label technique might be a good method for symbolizing cells of spinal gray matter,the appropriate time of BrdU symbol was at E12d,the perfect time of embryonic spinal graft symbolized by BrdU was at E13d.
, 百拇医药
【Key words】 5-bromo-2-deoxyuridine; Spinal cord; Development; Graft; Rat
有关脊髓损伤后神经再生和功能修复的研究已有近百年的历史，但由于神经元轴突再生能力极其有限[1]，人们试图通过胚胎神经组织的脊髓内移植，达到脊髓损伤后的神经再生和功能修复的目的[2]。胚胎脊髓是一种低分化神经组织，在被移植后可继续生长分化，并向宿主脊髓投送新生的神经纤维[3]，近年来，人们已开始用富含运动神经元的脊髓腹侧组织植入被特异性损毁运动神经元的大鼠脊髓内，但对供体神经组织取材的最佳时间尚不统一[4～6]，由于发育分化后的胎鼠脊髓组织与成体脊髓非常相似，难以辨别，所以人们开始考虑引入神经标记技术[4]。本实验用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记DNA，并用抗BrdU单克隆抗体进行ABC免疫细胞化学染色，观察大鼠脊髓灰质细胞的增殖分化情况，以期了解脊髓灰质细胞分化完成的确切时间，寻找供体组织取材的适合时间，为下一步进行脊髓移植提供实验资料。
, http://www.100md.com
材料和方法
1. 实验动物
实验用健康雄性SD大鼠18只，以上午8∶00阴栓出现确定受孕时间。孕鼠分别于受孕后E10、E11、E12、E13和E14d共5个时间，于母体腹腔注射BrdU(Sigma B5002)25g/2L生理盐水，每隔2.5h注射1次，共6次，BrdU总量150mg/只。每个时间点3～4只大鼠。
2. ABC免疫细胞化学染色
于E17d，深麻醉下取胎鼠放入4%多聚甲醛(4℃)，固定8d。在手术显微镜下取胎鼠上胸段脊髓，入10%蔗糖磷酸缓冲液2h，再入30%蔗糖磷酸缓冲液至沉底。恒冷箱切片机(-20℃)切片，片厚20μm，所有切片均为脊髓横切面。用抗BrdU单克隆抗体(Sigma,B-2531)进行ABC免疫细胞化学染色；简要过程如下：(1)4N HCl，室温，10min；(2)0.3% H\-2O\-2，室温，5min；(3)正常羊血清，室温，1h(不冲洗)；(4)1∶1 500兔抗BrdU单克隆抗体，4℃，湿盒，24h；(5)1∶200生物素化羊抗兔IgG抗体，4℃，湿盒，4h;(6)1∶100 ABC复合物，4℃，湿盒，4h；(7)用葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-硫酸镍铵(GDN)法呈色5min；以上各步骤前后均用0.01mol/L PBS(pH7.35)漂洗3×10min；常规脱水、透明、封片。染色结果用Olympus BH-2显微镜观察并摄片。本实验用0.01mol/L PBS或正常羊血清替代第一抗体作为阴性对照。
, 百拇医药
结果
孕鼠于E10d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角，脊髓侧角BrdU免疫反应神经元较少，前角仅有少量的BrdU免疫反应神经元(图1)；孕鼠于E11d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段后角BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角和前角BrdU免疫反应神经元较E10d增多(图2)；孕鼠于E12d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角和侧角，而后角仅有少量的BrdU免疫反应神经元(图3)；孕鼠于E13、E14d腹腔注射BrdU，于胎鼠E17d时，脊髓上胸段未见BrdU免疫反应神经元出现。各例鼠胎脊髓的部分相邻切片以磷酸缓冲液替代抗BrdU第一抗体后未见BrdU免疫反应神经元(图4)。各实验组BrdU标记结果稳定，形态学变化基本一致。
讨论
细胞增殖周期包括G1、S、G2和M 4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。作为一种嘧啶类似物，其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环与5位C原子连接的甲基被Br代替，当细胞处于DNA合成期而同时有BrdU存在时就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU在胞核的DNA中存留将是永久的。BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，经免疫组织化学染色可观察BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU标记和检测的准确性高，而且方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖的理想指标[7～9]。有报道认为，标记BrdU的细胞只要不受到紫外线的照射对细胞没有功能损害[10]。我们的研究显示，标记BrdU的神经元能继续生存，细胞核形态上与未标记BrdU的神经元无明显区别，提示标记BrdU的神经元在结构和功能上都保持了较好的完整性。
, http://www.100md.com
脊髓移植的成败除受受体组织状态的影响外，另一关键是供体组织胎龄的选择，胚胎脊髓神经组织分化程度较低，在受体脊髓内有较强的可塑性，但神经元的分裂有明显的时间性，因此选择适宜的时间十分重要。对于供体组织的取材时间各家报道不一，Clowry等[5]认为在E12d时效果较好，但李兵仓等[6]却认为E14d为最佳的取材时间。就脊髓来说，各段脊髓神经元分裂的先后不同；同一脊髓段的不同神经元的分裂次序也不一样。本研究结果显示，在胎鼠上胸段脊髓，后角区域的神经元分裂期约在E10～11d；中间带区域的神经元分裂期约在E11～12d；前角区域的神经元(主要含运动神经元)其分裂期约在E12～13d。而E13d以后，上胸段脊髓神经元的分裂已基本结束。提示，进行脊髓内胎鼠脊髓移植时，若目的主要是观察运动功能的恢复，则行BrdU的标记的最佳时间应选择E12d；而已标记胎鼠脊髓的最佳移植取材时间，虽然晚至E15～17d都是可行的，但基于神经元越年轻可塑性越好的原理，取E13d上胸段大鼠脊髓的腹侧半较合理。
, http://www.100md.com 本文图1～4见插图第1页
图1 E10d腹腔注射BrdU，E17d脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中在脊髓后角(PH)，脊髓侧角(LH)阳性神经元较少，前角(AH)仅有少量的BrdU免疫反应神经元。标尺1.0cm=0.3mm(图2～4同此)
Fig.1 When pregnant rat at E10d was given BrdU by intraperitoneal injection,most of BrdU immunoreactive neurons were located in posterior horn(PH) of superior thoracic segment of spinal cord in rat,only few of BrdU immunoreactive neurons appeared in anterior horn(AH) and lateral horn(LH).Bar 1.0cm=0.3mm
, http://www.100md.com
图2 E11d腹腔注射BrdU，E17d脊髓上胸段后角(PH)BrdU免疫反应神经元较E10d减少，侧角(LH)和前角(AH)BrdU免疫反应神经元较E10d增多。
Fig.2 Given BrdU at E11d,the number of BrdU immunoreactive neurons decreased in posterior horn(PH) of superior thoracic segment of spinal cord in rat,BrdU immuoreactive neurons in anterior horn(AH) and lateral lorn(LH) increased,when compared with these at E10d.Bar 1.0cm=0.3mm
图3 E12d腹腔注射BrdU，E17d脊髓上胸段BrdU免疫反应神经元主要集中于前角(AH)和侧角(LH)，后角(PH)仅有少量的BrdU免疫反应神经元。
, 百拇医药
Fig.3 Given BrdU at E12d,most of BrdU immunoreactive neurons were located in anterior horn(AH) and lateral horn(LH) of superior thoracic segment of spinal cord in rat,only few of BrdU immunoreactive neurons appeared in posterior horn(PH) horn(LH).Bar 1.0cm=0.3mm
图4 以磷酸缓冲液替代抗BrdU第一抗体后，未见有BrdU免疫反应神经元。
Fig.4 When phosphatic buffer substituted for the first anti-Brdu antibody,no BrdU immunoreactive neurons appeared.Bar 1.0cm=0.3mm
, http://www.100md.com
【基金项目】 国务院侨办重点科研基金资助项目(93-95-46)
【作者简介】 沈伟哉(1956—)，男(汉族)，上海市人，医学博士，副教授
参考文献
[1]郭畹华.胶质细胞与神经再生[J].解剖学报，1993，24(4)：424～430.
[2]Sieradzan K,Vrbova G.Replacement of missing motoneurons by grafts in the rat spinal cord[J].Neurosci,1989,31(1):115-130.
[3]Reier PJ,Anderson DK,Thompson F,et al.Neural tissue transplantation and CNS trauma:anatomical and functional repair of the injured spinal cord[J].J Neurotrauma,1992,9(suppl 1):S223-248.
, http://www.100md.com
[4]黄巨恩，郭畹华，曾园山.缺损运动神经元的大鼠脊髓内胚胎脊髓移植的存活与生长[J].解剖学报，1995，26(3)：252～255.
[5]Clowry GJ,Vrbova G.Observations on the development of transplanted embryonic ventral horn neurons grafted into adult rat spinal cord and connected to skeletal muscle implants via a peripheral nerve[J].Exp Brain Res,1992,91(2):249-258.
[6]李兵仓，王正国，廖维宏，等.妊14d脊髓植入成鼠损伤脊髓前后的发育变化[J].解剖学杂志，1997，20(1)：12～16.
[7]Gratzner HG.Monoclonal antibody to 5-bromo and 5-iododeoxyuridine: a new reagent for detection of DNA replication[J].Science,1982,218(4571):474-475.
, 百拇医药
[8]Nakamura S,Takeda Y,Kanno M,et al.Application of bromodeoxyuridine(BrdU) and anti-BrdU monoclonal antibody for the in vivo analysis of proliferative characteristics of human leukemia cells in bone marrows[J].Oncology,1991,48(4):285-289.
[9]陈广平，郭慕依，陈琦，等.应用BrdU单抗免疫组化染色观察大鼠系膜细胞生长情况[J].上海医科大学学报，1996，23(4)：305～306.
[10]王承龙，王绮如.应用BrdU测定造血细胞自杀率[J].湖南医科大学学报，1992，17(1)：19～21.
【收稿日期】 1999-10-08
【修回日期】 2000-02-03, 百拇医药