鞘糖脂研究的创新思路
作者：张宗城 张积仁 张健
单位：张宗城(沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110015)；张积仁(第一军医大学珠江医院 肿瘤中心，广东 广州 510282)；张健(第一军医大学珠江医院 肿瘤中心，广东 广州 510282)
关键词：
医学与哲学000216中图分类号：Q546 文献标识码：A
文章编号：1002-0772(2000)02-0039-03
鞘糖脂作为真核细胞质膜的组成成分之一，不仅维持着细胞的基本结构，而且在细胞粘附、生长、分化、增殖、信号转导等细胞基本活动中发挥重要作用，还参与了细胞恶变、肿瘤转移等过程[1～3]。本实验室在国家自然科学基金的资助下，对肿瘤相关中性鞘糖脂进行了深入研究，已经发表10余篇论文，并且将研究成果申请了一项国家发明专利。下面就我们在研究过程中的创新体会做一个总结。
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1 相关知识
鞘糖脂是由糖基和神经酰胺组成的两性分子，其神经鞘氨醇骨架一侧通过糖苷键连有寡糖链，另一侧通过酰胺键与脂肪酸相连。尽管鞘糖脂结构中只发现有7种单糖，但已报道不同糖链的鞘糖脂达400余种。而理论上近200种糖链与10种神经酰胺组合，可形成2 000种鞘糖脂，说明还有多种鞘糖脂未被人们发现。鞘糖脂的多样性及其在细胞中的位置决定了它的功能[1～4]。
自从1968年Hakomori等[5]开始鞘糖脂与肿瘤关系研究以来，人们对各种诱变细胞、实验性肿瘤及人体肿瘤中的鞘糖脂进行了多方面的研究。近十余年来，鞘糖脂研究方法学的发展及杂交瘤技术的应用，进一步加速了这一领域的发展。研究结果表明，肿瘤细胞膜鞘糖脂的组成和代谢均发生改变，肿瘤组织高表达的鞘糖脂组分通常具有较强的特异性，可作为粘附分子加速肿瘤转移，诱导信号转导，控制肿瘤的生长和流动性；有些还具有免疫抑制活性，使肿瘤组织局部形成免疫“空洞”，逃避机体免疫系统的攻击。这些特点为鞘糖脂应用于肿瘤治疗提供了线索。目前已有的研究结果有：(1)如果阻断肿瘤鞘糖脂合成，则可能促使病人产生抗体和活化T细胞，从而杀灭肿瘤细胞[6]；肿瘤转移需要鞘糖脂参与，因此鞘糖脂合成抑制剂有助于阻断转移途径[6]；鞘糖脂介导的粘附和信号转导可作为肿瘤治疗的分子靶点[7]；直接运用抗鞘糖脂的单抗或将其作为载体可用于肿瘤导向治疗。以上方法有的在探索之中，有的已经应用于临床[8]。(2)肿瘤相关鞘糖脂抗原用于构建肿瘤疫苗。肿瘤相关鞘糖脂具有较强特异性，其相应抗体在肿瘤免疫应答中起重要作用[9]，应用这些抗原辅以佐剂构建的瘤苗在某些肿瘤治疗中取得了成功。如Livingston等制备的黑色素瘤细胞GM2/BCG瘤苗能诱导机体产生抗GM2的抗体，可能提高病人的生存率[10]；另一项黑色素瘤瘤苗的前期临床试验证实小鼠体内产生抗GD3的抗体[11]。(3)在肿瘤耐药方面，近年来发现鞘糖脂与多药耐药(MDR)存在相关性[12]，肿瘤产生多药耐药时，合成鞘糖脂的速度加快。这一研究为肿瘤多药耐药提供了新的逆转靶点。虽然鞘糖脂影响MDR的确切机制仍在研究之中，但体外实验已证实运用糖脂合成抑制剂如PPMP、三苯氧胺等可逆转耐药[13]，说明通过抑制鞘糖脂合成有可能使肿瘤细胞保持对抗癌药物的敏感性[14]。
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2 传统研究中存在的问题
目前对鞘糖脂的研究集中于神经节苷脂，而对中性鞘糖脂研究较少，其中原因之一是中性鞘糖脂的纯化、分离、鉴定较困难，缺乏商品化的标准品。
根据国内外的研究报道[15～18]，中性鞘糖脂的显色方法有两种，采用的显色剂不同，中性鞘糖脂的颜色也有所差异。这给中性鞘糖脂的研究带来极大不便，这也是鞘糖脂研究进展缓慢的原因之一。
分离纯化组织中中性鞘糖脂的方法有三种：(1)采用高压液相色谱(HPLC)[19，20]。分为分析型和制备型两种，其中制备型HPLC具有很好的分离效果，也是国外较常用的手段。但该方法所需成本高，且由于鞘糖脂的非水溶性，采用的溶媒如氯仿、甲醇对仪器损耗大，难以广泛开展；(2)采用高效薄层层析(HPTLC)，将带荧光的硅胶铺在层析板上，样品经展开后在紫外灯下直接从层析板上刮取。该方法比较简单，但制备的成品量少，不适合大量提取；1996年Muthing采取可逆性亲脂荧光色素分离中性鞘糖脂[21]，可得到较为纯净的单一组分；(3)薄层层析印迹法(TLC blotting)。1994年Taki T[22]报道了一种新的糖脂和磷脂提取方法，命名为“TLC Blotting”。与在紫外光下直接从HPTLC板上刮取分离相比，该方法提取率高，且对鞘糖脂的结构没有影响。但由于PVDF膜很薄，所以该方法仍不适合大量制备鞘糖脂。因此迫切需要建立一种大量提取中性鞘糖脂单一组分的新方法，使中性鞘糖脂的研究能够继续深入进行。
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3 我们的创新点
3.1新的中性鞘糖脂显色方法的建立
我们首次建立了一种新的中性鞘糖脂显色方法，即应用化学分析中常用的碘显色法。该方法快速、简单、敏感、无毒。与二苯胺显色法比较，中性鞘糖脂在HPTLC板上的位置没有变化，说明碘显色剂对显色底物的位置和结构没有影响；而采用碘显色法进行中性鞘糖脂显色，方法简单，只需将展开后的HPTLC板置入碘缸中即可；显色具有反复性。如果将显色后的HPTLC板从碘缸中取出，显色结果会逐渐消退，但重新置入碘缸中，颜色又会再次出现。这种重复显色特点极大地方便了中性鞘糖脂的分析研究。
既往两种显色方法的原理类似，主要是由于酸与鞘糖脂中的糖基不可逆性结合，进而根据显色剂不同使得中性鞘糖脂显示蓝色或紫红色；而本显色方法的原理是根据不饱和键能吸引碘原子聚集，在其周围生成棕黄色的物质。由于不饱和键与碘原子的结合具有可逆性，从碘缸中取出层析板后，中性鞘糖脂的颜色会逐渐消退，但将TLC板重新置入碘缸中，中性鞘糖脂可再次显色，在层析化学研究中，经常使用碘作为显色剂。而中性鞘糖脂的结构中含有双键，可吸引碘原子，故可应用碘作为其显色剂。
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中性鞘糖脂碘显色法具有以下特点：(1)简单；(2)经济，所用试剂非常普通易得；(3)显色迅速；(4)较既往两种方法更加敏感；(5)无毒；(6)可反复显色。所以该方法值得在中性鞘糖脂的研究中推广应用。由于神经节甘脂中同样含有双键，该显色方法是否同样适用于神经节苷脂的显色，有待进一步研究。
3.2 中性鞘糖脂单一组分的纯化方法
我们将柱层析引入中性鞘糖脂单一组分的纯化分离之中。
为了提取纯化各种单一组分，首先必须确定其在TLC中的迁移行为，为此我们采用了不同极性的展开液作预实验，分别以含甲醇8%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%(V/V)甲醇/氯仿溶液作为展开剂，将中性鞘糖脂展开，观察不同组分Rf值的变化情况。发现随着展开液极性的增大，各种组分的Rf值也逐渐增大，因此采用了浓度梯度递增的甲醇/氯仿溶液梯度洗脱，平均每种浓度2个柱体积，逐个将单糖基、双糖基、三糖基神经酰胺洗脱下来，最后采用含甲醇70%的甲醇/氯仿溶液洗脱，将Glob分离纯化，并经TLC板检测证实达到了层析纯。说明柱层析是一种有效的中性鞘糖脂分离手段。
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3.3 不同动物脑组织Glob的结构和活性比较
鉴于前期实验结果，我们采用上述方法分别提取了猪脑、牛脑、人脑组织的Glob，并进行1H-NMR、13C-NMR、飞行时间质谱分析，比较结构特点。分别将其作用于胶质瘤细胞株，比较了其活性特点，并分析它们结构与活性的关系。发现尽管来源不同，但可能因为三种Glob结构上的共同点，使得它们具有一些共同的活性。而糖基数量较少的CDH不具有上述活性。还发现三种Glob活性上的差异也与其结构有关。
4 反思
创新是科研工作的灵魂，我们进行的中性鞘糖脂研究课题多年来得到国家自然科学基金的资助，研究水平一直处于国内领先。回顾走过的道路，我们对医学研究工作中的创新有以下几点思考：
4.1 选题是关键。国内外对肿瘤相关鞘糖脂的研究主要集中在含唾液酸的鞘糖脂即神经节苷脂方面，而对中性鞘糖脂研究较少。但我们并没有从所谓的“热门课题”开始研究，而是选择了研究较少的中性鞘糖脂；脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其特性是不论其组织学恶性程度如何，它都浸润其周围的正常脑组织。这是治疗的最大障碍。但目前对胶质瘤的研究手段以分子生物学为热点，其它手段则很少见。我们研究胶质瘤是通过比较其与正常人脑及胚胎脑组织中性鞘糖脂组成上的差异开始，这也是不为人们注意的“冷门”，因此课题的创新性较强。
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4.2 巧妙设计。本实验在1994～1997年国家自然基金的资助下，对脑胶质瘤中性鞘糖脂进行了深入的研究，发现肿瘤及胚胎脑组织高表达CMH及CDH，缺失或低表达Glob，而正常人脑组织却高表达这种长糖链的中性鞘糖脂。要研究这种现象的意义，通常是利用分子生物学手段研究相应糖苷转移酶的变化，进而从基因水平寻找答案。我们没有按常规进行研究，而是直接提取了少量Glob，初步实验发现正常脑组织Glob-N能抑制胶质瘤细胞的生长及轴突形成，而胶质瘤来源的CDH则无此作用。这一实验结果是前人从未报道过的，意义非常大，为此我们又申请了国家自然科学基金，继续深入研究。
4.3 善于借鉴。如上所述，中性鞘糖脂在组织中的含量很小，以我们目前的实验条件，要提取足够量的单一组分进行下一步实验，确实难度很大。但通过与高等理工院校化学系合作，我们找到了简单实用的提取方法，不仅保证了课题的进行，同时还改进了中性鞘糖脂的显色方法，解决了长期困扰鞘糖脂整体研究的一个难题，并利用别人的有利条件，进行了单一组分的结构鉴定。此类研究在国内尚属首次，即使国外也没有从不同动物脑组织中提取中性鞘糖脂组分进行结构分析的研究。
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4.4 及时保护研究成果。我们最初发现正常人脑Glob能抑制脑胶质瘤细胞生长，这一发现是前所未有的。按通行的做法，应该马上向外公开。但我们并没有这样做，而是等到后来的研究证实不同动物脑组织来源的Glob均具有抑制力，且与其结构有关等一系列实验证实，并且我们就Glob的治疗应用申报国家发明专利后才陆续将论文投稿。这既是一种科学严谨的态度，也是对自身工作的肯定和成果的保护。
作者简介：张宗城(1969～)，男，肿瘤学硕士，主治医师。1999年7月毕业于第一军医大学。现在沈阳军区总医院第一干部病房工作。
参考文献：
[1]Hakomori S,Igarashi Y.Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling[J].J Biochem,1995,118:1 091～1 103.
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[2]Hakomori S.Cancer-associated glycosphingolipid antigens:their structure,organization,and function[J].Acta Anat Basel,1998,161(1～4):79～90.
[3]Hakomori S,Yamamura S,Handa AK.Signal transduction through glyco(sphingo)lipids.Introduction and recent studies on glyco(sphingo)lipid-enriched microdomains[J].Ann N Y Acad Sci,1998,845:1～10.
[4]Hakomori S.Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingo (glyco)lipid metabolism[J].Cancer Res,1996,56(23):5 309～5 318.
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[5]Hakomori.SI,Murakami WT.Glycolipids of hamster fibroblasts and derived malignant-transformed cell lines[J].Proc Natl Acad Sci USA,1968,599(1):254～261.
[6]Radin N S.Chemotherapy by slowing glucosphingolipid synthesis[J].Biochem Pharmacol,1999,57(6):589～595.
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收稿日期：1999-11-28, http://www.100md.com
单位：张宗城(沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110015)；张积仁(第一军医大学珠江医院 肿瘤中心，广东 广州 510282)；张健(第一军医大学珠江医院 肿瘤中心，广东 广州 510282)
关键词：
医学与哲学000216中图分类号：Q546 文献标识码：A
文章编号：1002-0772(2000)02-0039-03
鞘糖脂作为真核细胞质膜的组成成分之一，不仅维持着细胞的基本结构，而且在细胞粘附、生长、分化、增殖、信号转导等细胞基本活动中发挥重要作用，还参与了细胞恶变、肿瘤转移等过程[1～3]。本实验室在国家自然科学基金的资助下，对肿瘤相关中性鞘糖脂进行了深入研究，已经发表10余篇论文，并且将研究成果申请了一项国家发明专利。下面就我们在研究过程中的创新体会做一个总结。
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1 相关知识
鞘糖脂是由糖基和神经酰胺组成的两性分子，其神经鞘氨醇骨架一侧通过糖苷键连有寡糖链，另一侧通过酰胺键与脂肪酸相连。尽管鞘糖脂结构中只发现有7种单糖，但已报道不同糖链的鞘糖脂达400余种。而理论上近200种糖链与10种神经酰胺组合，可形成2 000种鞘糖脂，说明还有多种鞘糖脂未被人们发现。鞘糖脂的多样性及其在细胞中的位置决定了它的功能[1～4]。
自从1968年Hakomori等[5]开始鞘糖脂与肿瘤关系研究以来，人们对各种诱变细胞、实验性肿瘤及人体肿瘤中的鞘糖脂进行了多方面的研究。近十余年来，鞘糖脂研究方法学的发展及杂交瘤技术的应用，进一步加速了这一领域的发展。研究结果表明，肿瘤细胞膜鞘糖脂的组成和代谢均发生改变，肿瘤组织高表达的鞘糖脂组分通常具有较强的特异性，可作为粘附分子加速肿瘤转移，诱导信号转导，控制肿瘤的生长和流动性；有些还具有免疫抑制活性，使肿瘤组织局部形成免疫“空洞”，逃避机体免疫系统的攻击。这些特点为鞘糖脂应用于肿瘤治疗提供了线索。目前已有的研究结果有：(1)如果阻断肿瘤鞘糖脂合成，则可能促使病人产生抗体和活化T细胞，从而杀灭肿瘤细胞[6]；肿瘤转移需要鞘糖脂参与，因此鞘糖脂合成抑制剂有助于阻断转移途径[6]；鞘糖脂介导的粘附和信号转导可作为肿瘤治疗的分子靶点[7]；直接运用抗鞘糖脂的单抗或将其作为载体可用于肿瘤导向治疗。以上方法有的在探索之中，有的已经应用于临床[8]。(2)肿瘤相关鞘糖脂抗原用于构建肿瘤疫苗。肿瘤相关鞘糖脂具有较强特异性，其相应抗体在肿瘤免疫应答中起重要作用[9]，应用这些抗原辅以佐剂构建的瘤苗在某些肿瘤治疗中取得了成功。如Livingston等制备的黑色素瘤细胞GM2/BCG瘤苗能诱导机体产生抗GM2的抗体，可能提高病人的生存率[10]；另一项黑色素瘤瘤苗的前期临床试验证实小鼠体内产生抗GD3的抗体[11]。(3)在肿瘤耐药方面，近年来发现鞘糖脂与多药耐药(MDR)存在相关性[12]，肿瘤产生多药耐药时，合成鞘糖脂的速度加快。这一研究为肿瘤多药耐药提供了新的逆转靶点。虽然鞘糖脂影响MDR的确切机制仍在研究之中，但体外实验已证实运用糖脂合成抑制剂如PPMP、三苯氧胺等可逆转耐药[13]，说明通过抑制鞘糖脂合成有可能使肿瘤细胞保持对抗癌药物的敏感性[14]。
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2 传统研究中存在的问题
目前对鞘糖脂的研究集中于神经节苷脂，而对中性鞘糖脂研究较少，其中原因之一是中性鞘糖脂的纯化、分离、鉴定较困难，缺乏商品化的标准品。
根据国内外的研究报道[15～18]，中性鞘糖脂的显色方法有两种，采用的显色剂不同，中性鞘糖脂的颜色也有所差异。这给中性鞘糖脂的研究带来极大不便，这也是鞘糖脂研究进展缓慢的原因之一。
分离纯化组织中中性鞘糖脂的方法有三种：(1)采用高压液相色谱(HPLC)[19，20]。分为分析型和制备型两种，其中制备型HPLC具有很好的分离效果，也是国外较常用的手段。但该方法所需成本高，且由于鞘糖脂的非水溶性，采用的溶媒如氯仿、甲醇对仪器损耗大，难以广泛开展；(2)采用高效薄层层析(HPTLC)，将带荧光的硅胶铺在层析板上，样品经展开后在紫外灯下直接从层析板上刮取。该方法比较简单，但制备的成品量少，不适合大量提取；1996年Muthing采取可逆性亲脂荧光色素分离中性鞘糖脂[21]，可得到较为纯净的单一组分；(3)薄层层析印迹法(TLC blotting)。1994年Taki T[22]报道了一种新的糖脂和磷脂提取方法，命名为“TLC Blotting”。与在紫外光下直接从HPTLC板上刮取分离相比，该方法提取率高，且对鞘糖脂的结构没有影响。但由于PVDF膜很薄，所以该方法仍不适合大量制备鞘糖脂。因此迫切需要建立一种大量提取中性鞘糖脂单一组分的新方法，使中性鞘糖脂的研究能够继续深入进行。
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3 我们的创新点
3.1新的中性鞘糖脂显色方法的建立
我们首次建立了一种新的中性鞘糖脂显色方法，即应用化学分析中常用的碘显色法。该方法快速、简单、敏感、无毒。与二苯胺显色法比较，中性鞘糖脂在HPTLC板上的位置没有变化，说明碘显色剂对显色底物的位置和结构没有影响；而采用碘显色法进行中性鞘糖脂显色，方法简单，只需将展开后的HPTLC板置入碘缸中即可；显色具有反复性。如果将显色后的HPTLC板从碘缸中取出，显色结果会逐渐消退，但重新置入碘缸中，颜色又会再次出现。这种重复显色特点极大地方便了中性鞘糖脂的分析研究。
既往两种显色方法的原理类似，主要是由于酸与鞘糖脂中的糖基不可逆性结合，进而根据显色剂不同使得中性鞘糖脂显示蓝色或紫红色；而本显色方法的原理是根据不饱和键能吸引碘原子聚集，在其周围生成棕黄色的物质。由于不饱和键与碘原子的结合具有可逆性，从碘缸中取出层析板后，中性鞘糖脂的颜色会逐渐消退，但将TLC板重新置入碘缸中，中性鞘糖脂可再次显色，在层析化学研究中，经常使用碘作为显色剂。而中性鞘糖脂的结构中含有双键，可吸引碘原子，故可应用碘作为其显色剂。
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中性鞘糖脂碘显色法具有以下特点：(1)简单；(2)经济，所用试剂非常普通易得；(3)显色迅速；(4)较既往两种方法更加敏感；(5)无毒；(6)可反复显色。所以该方法值得在中性鞘糖脂的研究中推广应用。由于神经节甘脂中同样含有双键，该显色方法是否同样适用于神经节苷脂的显色，有待进一步研究。
3.2 中性鞘糖脂单一组分的纯化方法
我们将柱层析引入中性鞘糖脂单一组分的纯化分离之中。
为了提取纯化各种单一组分，首先必须确定其在TLC中的迁移行为，为此我们采用了不同极性的展开液作预实验，分别以含甲醇8%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%(V/V)甲醇/氯仿溶液作为展开剂，将中性鞘糖脂展开，观察不同组分Rf值的变化情况。发现随着展开液极性的增大，各种组分的Rf值也逐渐增大，因此采用了浓度梯度递增的甲醇/氯仿溶液梯度洗脱，平均每种浓度2个柱体积，逐个将单糖基、双糖基、三糖基神经酰胺洗脱下来，最后采用含甲醇70%的甲醇/氯仿溶液洗脱，将Glob分离纯化，并经TLC板检测证实达到了层析纯。说明柱层析是一种有效的中性鞘糖脂分离手段。
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3.3 不同动物脑组织Glob的结构和活性比较
鉴于前期实验结果，我们采用上述方法分别提取了猪脑、牛脑、人脑组织的Glob，并进行1H-NMR、13C-NMR、飞行时间质谱分析，比较结构特点。分别将其作用于胶质瘤细胞株，比较了其活性特点，并分析它们结构与活性的关系。发现尽管来源不同，但可能因为三种Glob结构上的共同点，使得它们具有一些共同的活性。而糖基数量较少的CDH不具有上述活性。还发现三种Glob活性上的差异也与其结构有关。
4 反思
创新是科研工作的灵魂，我们进行的中性鞘糖脂研究课题多年来得到国家自然科学基金的资助，研究水平一直处于国内领先。回顾走过的道路，我们对医学研究工作中的创新有以下几点思考：
4.1 选题是关键。国内外对肿瘤相关鞘糖脂的研究主要集中在含唾液酸的鞘糖脂即神经节苷脂方面，而对中性鞘糖脂研究较少。但我们并没有从所谓的“热门课题”开始研究，而是选择了研究较少的中性鞘糖脂；脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其特性是不论其组织学恶性程度如何，它都浸润其周围的正常脑组织。这是治疗的最大障碍。但目前对胶质瘤的研究手段以分子生物学为热点，其它手段则很少见。我们研究胶质瘤是通过比较其与正常人脑及胚胎脑组织中性鞘糖脂组成上的差异开始，这也是不为人们注意的“冷门”，因此课题的创新性较强。
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4.2 巧妙设计。本实验在1994～1997年国家自然基金的资助下，对脑胶质瘤中性鞘糖脂进行了深入的研究，发现肿瘤及胚胎脑组织高表达CMH及CDH，缺失或低表达Glob，而正常人脑组织却高表达这种长糖链的中性鞘糖脂。要研究这种现象的意义，通常是利用分子生物学手段研究相应糖苷转移酶的变化，进而从基因水平寻找答案。我们没有按常规进行研究，而是直接提取了少量Glob，初步实验发现正常脑组织Glob-N能抑制胶质瘤细胞的生长及轴突形成，而胶质瘤来源的CDH则无此作用。这一实验结果是前人从未报道过的，意义非常大，为此我们又申请了国家自然科学基金，继续深入研究。
4.3 善于借鉴。如上所述，中性鞘糖脂在组织中的含量很小，以我们目前的实验条件，要提取足够量的单一组分进行下一步实验，确实难度很大。但通过与高等理工院校化学系合作，我们找到了简单实用的提取方法，不仅保证了课题的进行，同时还改进了中性鞘糖脂的显色方法，解决了长期困扰鞘糖脂整体研究的一个难题，并利用别人的有利条件，进行了单一组分的结构鉴定。此类研究在国内尚属首次，即使国外也没有从不同动物脑组织中提取中性鞘糖脂组分进行结构分析的研究。
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4.4 及时保护研究成果。我们最初发现正常人脑Glob能抑制脑胶质瘤细胞生长，这一发现是前所未有的。按通行的做法，应该马上向外公开。但我们并没有这样做，而是等到后来的研究证实不同动物脑组织来源的Glob均具有抑制力，且与其结构有关等一系列实验证实，并且我们就Glob的治疗应用申报国家发明专利后才陆续将论文投稿。这既是一种科学严谨的态度，也是对自身工作的肯定和成果的保护。
作者简介：张宗城(1969～)，男，肿瘤学硕士，主治医师。1999年7月毕业于第一军医大学。现在沈阳军区总医院第一干部病房工作。
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[1]Hakomori S,Igarashi Y.Functional role of glycosphingolipids in cell recognition and signaling[J].J Biochem,1995,118:1 091～1 103.
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收稿日期：1999-11-28, http://www.100md.com