G蛋白介导促胰液素对大鼠胃平滑肌细胞的舒张作用△
作者：王 玲 周 吕
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京100005
关键词：胃平滑肌细胞；促胰液素；舒张；G蛋白
基础医学与临床990607 摘要 本研究应用大鼠游离胃平滑肌细胞和采用[35S]GTPγS 结合法测定肌细胞的G蛋白，观察促胰液素舒张胃平滑肌细胞中的G蛋白的变化及其信号转导通路。结果显示：(1)促胰液素对胃体、胃窦平滑肌细胞均有舒张作用，促胰液素抗血清可阻断促胰液素对胃窦平滑肌细胞的舒张反应，Forskolin与cAMP抑制剂分别加强和抑制促胰液素的这一作用。(2)Gαs抗体可抑制促胰液素的舒张作用，促胰液素明显引起Gas抗体与[35S]GTPγS结合的增加，表明胃平滑肌细胞中促胰液素受体与Gs蛋白相偶联，激活cAMP系统介导促胰液素舒张胃平滑肌细胞。
, 百拇医药
G Protein Involved in Secretin Induced Relaxation of
Rat Gastric Smooth Muscle Cell
Wang Ling Zhou Lu
(Department of physiology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100005)
The aim of study was to elucidate the G protein involved in secretin-induced relaxation of gastric smooth muscle cell in rat.Gastric muscle cells were isolated by enzymatic digestion with collagenase.[35S]GTPgS-binding properties of G proteins were assesed in crude membranes of gastric muscle with or without secretin stimulation.Results:(1)Secretin relaxed smooth muscle cells of both gastric body and antrum.Secretin antiserum blocked the relaxation of secretin on antrum smooth muscle cells.Forskolin and cAMP inhibitor potentiated and weakened the effect of secretin，respectively.(2)The relaxation induced by secretin was blocked by Gas-specific antibodies.Secretin caused a significantly increase in [35S]GTPgS binding to Gas， but not to Gaq/11 or Gai-3 .In conclusion，secretin activates a cAMP dependent pathway through Gs proteins in antrum.
, 百拇医药
key words gastric smooth muscle cells secretin relaxation G protein
促胰液素是调节胃肠运动的重要脑肠肽，它可以引起胃的舒张[1]，在去除中枢神经和体液因素影响的离体全胃制备中，促胰液素明显抑制胃运动[2]。促胰液素引起胃平滑肌细胞舒张是通过特异性受体实现的[3]。已知促胰液素受体属于G蛋白偶联受体家族[4] ，但是介导促胰液素舒张胃平滑肌细胞中的G蛋白尚不清楚。本研究的目的在于观察介导促胰液素对胃平滑肌细胞舒张过程中G蛋白的类型及其偶联的信号转导通路。1 材料和方法
1.1 材料
Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物中心提供，Ⅱ型胶原酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、促胰液素、促胰液素抗血清、Forskolin、cAMP抑制剂、GTPγS、皂苷均购自Sigma公司，兔多克隆G蛋白抗体Gαs、Gαi-3、Gαq/11为Santa Cruz产品，羊抗兔抗体(亲和纯化)为华美公司产品，[35S]GTPγS(1132Ci/mmol)为Amersham产品。
, 百拇医药
1.2 游离的单个胃平滑肌细胞的制备
参照文献[5]。
1.3 可通透胃平滑肌细胞的制备[6]
当酶消化过程完成后，将消化液吸出，并用细胞质缓冲液(mmol/L: NaC l20，KCl 100，MgSO4 5，NaH2PO4 0.96, CaCl2 0.61，EGTA 1，2% BSA 。pH: 7.2)洗3次，将洗液与消化液一起，1 000 r/min离心5min，弃上清，用2mL的细胞质缓冲液悬浮沉淀，并吹打成细胞悬液。细胞分散后，加入75μg/mL的皂苷孵育4min，1 000r/min离心5min，沉淀重新悬液于无皂苷的、含1.5mmol/L ATP，5mmol/L磷酸肌酸，10U/mL肌酸磷酸激酶的细胞质缓冲液中。由于G蛋白抗体不能透过完整的细胞膜扩散，所以利用可通透细胞观察G蛋白抗体对胃平滑肌细胞的作用。
, 百拇医药
1.4 胃平滑肌细胞膜的制备[6]
将胃平滑肌肌块置于冰冷的匀浆缓冲液(mmol/L：HEPES 20，MgCl2 2，EDTA 1，DTT 2，pH:7.4)，冰浴超声粉碎，粉碎液600r/min离心，2min，收集上清，沉淀再次超声粉碎，并用两层200μm的尼龙网过滤，合并两次上清，4℃，40 000r/min 离心，30min。膜沉淀混溶于缓冲液(mmol/L:HEPES 20，NaCl 240，EDTA 2， leupeptin 2，phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)2，pH:7.4)中，考马斯亮蓝G-250染色法测定样品的蛋白含量。1.5 [35S]GTPγS结合实验[7]
将细胞膜蛋白加入含1μmol/L GDP的G蛋白测定缓冲液(mmol/L：HEPES 10，EDTA 0.1，MgCl2 10，pH :7.4)，置25℃水浴摇床 30min，随后加入0.5 nmol/L [35S]GTPgS，继续反应30min，终体积500ml。用3mL冰冷的终止液(mmol/L：Tris-HCl 100，MgCl2 10，NaCl 100，pH:8.0)终止反应，GF/B滤膜快速抽滤，滤膜用3mL的终止缓冲液洗3遍，干燥后液闪测定。用100mmol/L的GTPγS确定非特异结合的量。1.6 ELISA法测定[35S]GTPγS结合实验[6]
, 百拇医药
将细胞膜蛋白加入G蛋白测定缓冲液中，加入30nmol/L 的[35S]GTPγS，37℃孵育，总体积300μL，用10倍体积、含20μmol/L GTP的冰冷终止液终止反应，将200μL的反应液加至已包被好特异性G蛋白抗体的酶标板内，冰上孵育2h后，用含0.05% Tween 20的冰冷PBS洗3次，每次5min，孔干燥后液闪测定。酶标板先用1：1000的羊抗兔IgG抗体包被，再用1：1000的特异性G蛋白抗体包被。1.7 细胞舒张反应的测量
在胃平滑肌细胞悬液中，加入促胰液素反应60s后，再加入CCK-8(10-9mol/L)作用30s，以2.5%戊二醛终止反应 。观察G-蛋白抗体对促胰液素作用影响时，先在可通透细胞悬液中加入1：200的抗体孵育1h。在倒置显微镜下，用测微尺测定随机遇到的30个完整细胞的长度，计算其平均值。以抑制收缩的百分率表示舒张，即细胞舒张百分率=(给药组细胞平均长度-对照组细胞平均长度)/对照组细胞平均长度×100%。1.8 统计学处理
, 百拇医药
各组实验数据以平均数±标准误(
±S
)表示组间差异的比较采用双侧t检验。2 结果
2.1 促胰液素对胃平滑肌细胞的作用
促胰液素对胃体、胃窦平滑肌细胞均有舒张作用，对胃窦的舒张作用强于胃体，在10-9～10-5mol/L范围内，促胰液素对胃平滑肌细胞出现剂量-依赖性舒张，最大反应浓度均为10-6mol/L。促胰液素对胃平滑肌细胞的剂量-效应曲线见图1。
图1 促胰液素对胃平滑肌细胞舒张作用的剂量-效应曲线
, 百拇医药
Fig1 Dise-response curves for the relaxant effect of secretin in dispersed rat gastric muscle cells n=5,*P<0.05,**P<0.01,compared with control
2.2 促胰液素抗血清、Forskolin、cAMP抑制剂对促胰液素效应的影响
促胰液素抗血清抑制促胰液素效应的95.7%(P<0.001)，基本取消促胰液素对胃平滑肌细胞的舒张作用。cAMP抑制剂明显抑制促胰液素舒张效应的88.3%(P<0.001)，腺苷酸环化酶激动剂Forskolin则增强促胰液素的舒张效应，与单独促胰液素组比较，舒张百分数增加33.4%(P<0.05)。见表1。
表1 促胰液素抗血清、Forskolin、cAMP抑制剂对促胰液素效应的影响
, 百拇医药
Table 1 The effect of antisecretin serum,Forskolin and cAMP inhibitor on the relaxant effect of secretin in dispersed rat gastric muscle cells G
R
Secretin(10-6mol/L)
40.7±4.4
Antisecretin cerum(1:100)+secretin
1.8±0.8***
Forskolin(10-8mol/L)+secretin
, http://www.100md.com
54.3±1.7*
cAMP inghibitor(2×10-6mol/L)+secretin
408±1.1***
2.3 促胰液素对[35S]GTPγS结合的影响
促胰液素(10-6mol/L)刺激胃平滑肌细胞膜后，[35S]GTPγS结合率明显升高，cpm值为470±46.9，未给促胰液素刺激的对照组cpm值为630.5±61.7，升高34.4%(n=5，P<0.05)。2.4 特异性G蛋白抗体对促胰液素舒张胃平滑肌细胞效应的影响
用可通透胃平滑肌细胞，单独促胰液素(10-6mol/L)引起胃平滑肌舒张39.0%±3.7%，Gαs抗体加促胰液素仅舒张胃肌细胞4.5%±1.2%，抑制促胰液素舒张效应的88.5%(P<0.001)，而Gαi-3、Gαq/11抗体对促胰液素的舒张效应无显著影响(图2)。
, 百拇医药
图2 特异性G蛋白抗体对促胰液素舒张效应的影响
Fig2 Effects of antibodies to G protein subunits on secretin induced relaxation in gastric muscle cells n=5,***P<0.001,compared with secretin group
2.5 促胰液素引起G蛋白抗体与[35S]GTPγS结合的变化
与未给促胰液素刺激的对照组比较，促胰液素引起Gαs抗体与[35S]GTPγS结合明显增加，cpm值由655.8±36.3升高到942.9±28.2，增加44.1%(n=5，P<0.001)，而Gαi-3、Gαq/11抗体与[35S]GTPγS结合无明显变化。3 讨论
, 百拇医药
促胰液素是一个重要的脑肠肽。在体情况下，生理剂量的促胰液素即可抑制胃的运动，使胃舒张[1,2]。我们的实验表明，促胰液素引起大鼠胃体、胃窦平滑肌细胞舒张，其反应呈剂量依赖性。Steiner[3]等发现：大鼠的胃平滑肌表达一种高亲和力的特异性的促胰液素结合位点，与介导舒张有关。本研究用促胰液素抗体可以完全阻断促胰液素对胃肌细胞的舒张效应，证明促胰液素是与胃肌细胞上的促胰液素受体结合而发挥作用的。
G蛋白因能与鸟苷酸结合，故名鸟苷酸结合蛋白(GTP binding protein)，简称G蛋白(G protein)[8]。G蛋白是细胞外受体与胞内效应分子的偶联体，G蛋白偶联受体需与G蛋白偶联后才能产生胞内第二信使，将信号传到胞内，G蛋白在跨膜信息传递中起着“桥梁”的作用，因此阐明与受体偶联的G蛋白具有重要意义。当脑肠肽与受体结合后，使G蛋白a亚单位中的GDP释放，GTP取代GDP与a亚单位结合，激发一系列细胞内反应。利用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)法的原理，在酶标板上预先包被特异性的抗G蛋白α亚单位抗体可测定出与相应受体偶联的G蛋白类型[6]。我们的研究发现：促胰液素使大鼠胃平滑肌细胞膜蛋白与[35S]GTPγS的结合率明显增加，说明促胰液素与胃平滑肌细胞受体结合后激活了G蛋白。进一步的实验显示，Gαs抗体可以明显抑制促胰液素引起的胃肌细胞的舒张效应，表明促胰液素引起的胃平滑肌细胞的舒张由Gs蛋白介导。鉴于促胰液素引起Gas抗体与[35S]GTPγS的结合率明显升高，而Gαi-3、Gαq/11抗体与[35S]GTPγS的结合率并无明显变化，可以初步确定胃平滑肌细胞中促胰液素受体与Gs蛋白相偶联。
, 百拇医药
促胰液素对靶器官的作用主要通过激活腺苷酸环化酶，随后产生环一磷酸腺苷并激活蛋白激酶A所介导[4]。但介导促胰液素舒张胃平滑肌细胞的信号转导通路是否与此相同，尚不完全清楚。我们的实验结果表明：腺苷酸环化酶激动剂Forskolin可增强促胰液素对肌细胞的舒张效应，而环一磷酸腺苷抑制剂则抑制促胰液素的舒张效应。进一步测定细胞内环一磷酸腺苷含量[9]，发现促胰液素使胞内环一磷酸腺苷含量升高，呈剂量依赖性，与促胰液素舒张肌细胞的量效曲线一致。充分说明促胰液素与肌细胞膜受体结合后，通过活化与受体偶联的G蛋白Gs，激活腺苷酸环化酶，使环一磷酸腺苷生成增加，介导促胰液素激发胃平滑肌细胞的舒张。蛋白激酶A在促胰液素舒张胃平滑肌细胞中的作用还需进一步研究。
参考文献
1 Lu Y，Owyang C.Secretin at physiological doses inhibits gastric motility via a afferent pathway.Am J Physiol，1995，268:G1012
, 百拇医药
2 周吕，王立东.促胰液素对血管灌流大鼠离体胃运动的抑制作用.生理学报，1990，42：460
3 Steiner TS，Mangel AW，McVey DC，et al.Secretin receptors mediating rat forestomach relaxation.Am J Physiol，1993，264:G863
4 Ulrich II CD，Holtmann M，Miller LJ.Secretin and vasoactive intestinal peptide receptors:membrane of a unique family of G protein-coupled receptors.Gastroenterology，1998，114:382
5 周吕，王新.胃动素对大鼠胃平滑肌细胞收缩活动的作用，生理学报，1996，48：165
, http://www.100md.com
6 Yu PR，Chen Q，Xiao ZL.et al.Signal transduction pathways mediating CCK-induced gallbladder muscle contraction.Am J Physiol，1998，275:G203
7 Hermans E，Geurts M and Maloteaux JM.Agonist and antagonist modulation of [35S]GTPgS in transfected CHO cells expressing the neruotensin receptor.Br J Pharmacol，1997，121:1817
8 Hepler JR and Gilman AG.G proteins.Trends Bilchem Sci，1992，17:383
9 王文颖，周吕，郝维，等.胞内cAMP在促胰液素和生长抑素引起胃平滑肌细胞舒张中的作用，基础医学与临床，1996，6：444, 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所生理研究室，北京100005
关键词：胃平滑肌细胞；促胰液素；舒张；G蛋白
基础医学与临床990607 摘要 本研究应用大鼠游离胃平滑肌细胞和采用[35S]GTPγS 结合法测定肌细胞的G蛋白，观察促胰液素舒张胃平滑肌细胞中的G蛋白的变化及其信号转导通路。结果显示：(1)促胰液素对胃体、胃窦平滑肌细胞均有舒张作用，促胰液素抗血清可阻断促胰液素对胃窦平滑肌细胞的舒张反应，Forskolin与cAMP抑制剂分别加强和抑制促胰液素的这一作用。(2)Gαs抗体可抑制促胰液素的舒张作用，促胰液素明显引起Gas抗体与[35S]GTPγS结合的增加，表明胃平滑肌细胞中促胰液素受体与Gs蛋白相偶联，激活cAMP系统介导促胰液素舒张胃平滑肌细胞。
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G Protein Involved in Secretin Induced Relaxation of
Rat Gastric Smooth Muscle Cell
Wang Ling Zhou Lu
(Department of physiology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing 100005)
The aim of study was to elucidate the G protein involved in secretin-induced relaxation of gastric smooth muscle cell in rat.Gastric muscle cells were isolated by enzymatic digestion with collagenase.[35S]GTPgS-binding properties of G proteins were assesed in crude membranes of gastric muscle with or without secretin stimulation.Results:(1)Secretin relaxed smooth muscle cells of both gastric body and antrum.Secretin antiserum blocked the relaxation of secretin on antrum smooth muscle cells.Forskolin and cAMP inhibitor potentiated and weakened the effect of secretin，respectively.(2)The relaxation induced by secretin was blocked by Gas-specific antibodies.Secretin caused a significantly increase in [35S]GTPgS binding to Gas， but not to Gaq/11 or Gai-3 .In conclusion，secretin activates a cAMP dependent pathway through Gs proteins in antrum.
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key words gastric smooth muscle cells secretin relaxation G protein
促胰液素是调节胃肠运动的重要脑肠肽，它可以引起胃的舒张[1]，在去除中枢神经和体液因素影响的离体全胃制备中，促胰液素明显抑制胃运动[2]。促胰液素引起胃平滑肌细胞舒张是通过特异性受体实现的[3]。已知促胰液素受体属于G蛋白偶联受体家族[4] ，但是介导促胰液素舒张胃平滑肌细胞中的G蛋白尚不清楚。本研究的目的在于观察介导促胰液素对胃平滑肌细胞舒张过程中G蛋白的类型及其偶联的信号转导通路。1 材料和方法
1.1 材料
Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物中心提供，Ⅱ型胶原酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、促胰液素、促胰液素抗血清、Forskolin、cAMP抑制剂、GTPγS、皂苷均购自Sigma公司，兔多克隆G蛋白抗体Gαs、Gαi-3、Gαq/11为Santa Cruz产品，羊抗兔抗体(亲和纯化)为华美公司产品，[35S]GTPγS(1132Ci/mmol)为Amersham产品。
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1.2 游离的单个胃平滑肌细胞的制备
参照文献[5]。
1.3 可通透胃平滑肌细胞的制备[6]
当酶消化过程完成后，将消化液吸出，并用细胞质缓冲液(mmol/L: NaC l20，KCl 100，MgSO4 5，NaH2PO4 0.96, CaCl2 0.61，EGTA 1，2% BSA 。pH: 7.2)洗3次，将洗液与消化液一起，1 000 r/min离心5min，弃上清，用2mL的细胞质缓冲液悬浮沉淀，并吹打成细胞悬液。细胞分散后，加入75μg/mL的皂苷孵育4min，1 000r/min离心5min，沉淀重新悬液于无皂苷的、含1.5mmol/L ATP，5mmol/L磷酸肌酸，10U/mL肌酸磷酸激酶的细胞质缓冲液中。由于G蛋白抗体不能透过完整的细胞膜扩散，所以利用可通透细胞观察G蛋白抗体对胃平滑肌细胞的作用。
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1.4 胃平滑肌细胞膜的制备[6]
将胃平滑肌肌块置于冰冷的匀浆缓冲液(mmol/L：HEPES 20，MgCl2 2，EDTA 1，DTT 2，pH:7.4)，冰浴超声粉碎，粉碎液600r/min离心，2min，收集上清，沉淀再次超声粉碎，并用两层200μm的尼龙网过滤，合并两次上清，4℃，40 000r/min 离心，30min。膜沉淀混溶于缓冲液(mmol/L:HEPES 20，NaCl 240，EDTA 2， leupeptin 2，phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)2，pH:7.4)中，考马斯亮蓝G-250染色法测定样品的蛋白含量。1.5 [35S]GTPγS结合实验[7]
将细胞膜蛋白加入含1μmol/L GDP的G蛋白测定缓冲液(mmol/L：HEPES 10，EDTA 0.1，MgCl2 10，pH :7.4)，置25℃水浴摇床 30min，随后加入0.5 nmol/L [35S]GTPgS，继续反应30min，终体积500ml。用3mL冰冷的终止液(mmol/L：Tris-HCl 100，MgCl2 10，NaCl 100，pH:8.0)终止反应，GF/B滤膜快速抽滤，滤膜用3mL的终止缓冲液洗3遍，干燥后液闪测定。用100mmol/L的GTPγS确定非特异结合的量。1.6 ELISA法测定[35S]GTPγS结合实验[6]
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将细胞膜蛋白加入G蛋白测定缓冲液中，加入30nmol/L 的[35S]GTPγS，37℃孵育，总体积300μL，用10倍体积、含20μmol/L GTP的冰冷终止液终止反应，将200μL的反应液加至已包被好特异性G蛋白抗体的酶标板内，冰上孵育2h后，用含0.05% Tween 20的冰冷PBS洗3次，每次5min，孔干燥后液闪测定。酶标板先用1：1000的羊抗兔IgG抗体包被，再用1：1000的特异性G蛋白抗体包被。1.7 细胞舒张反应的测量
在胃平滑肌细胞悬液中，加入促胰液素反应60s后，再加入CCK-8(10-9mol/L)作用30s，以2.5%戊二醛终止反应 。观察G-蛋白抗体对促胰液素作用影响时，先在可通透细胞悬液中加入1：200的抗体孵育1h。在倒置显微镜下，用测微尺测定随机遇到的30个完整细胞的长度，计算其平均值。以抑制收缩的百分率表示舒张，即细胞舒张百分率=(给药组细胞平均长度-对照组细胞平均长度)/对照组细胞平均长度×100%。1.8 统计学处理
, 百拇医药
各组实验数据以平均数±标准误(
±S)表示组间差异的比较采用双侧t检验。2 结果2.1 促胰液素对胃平滑肌细胞的作用
促胰液素对胃体、胃窦平滑肌细胞均有舒张作用，对胃窦的舒张作用强于胃体，在10-9～10-5mol/L范围内，促胰液素对胃平滑肌细胞出现剂量-依赖性舒张，最大反应浓度均为10-6mol/L。促胰液素对胃平滑肌细胞的剂量-效应曲线见图1。
图1 促胰液素对胃平滑肌细胞舒张作用的剂量-效应曲线, 百拇医药
Fig1 Dise-response curves for the relaxant effect of secretin in dispersed rat gastric muscle cells n=5,*P<0.05,**P<0.01,compared with control
2.2 促胰液素抗血清、Forskolin、cAMP抑制剂对促胰液素效应的影响
促胰液素抗血清抑制促胰液素效应的95.7%(P<0.001)，基本取消促胰液素对胃平滑肌细胞的舒张作用。cAMP抑制剂明显抑制促胰液素舒张效应的88.3%(P<0.001)，腺苷酸环化酶激动剂Forskolin则增强促胰液素的舒张效应，与单独促胰液素组比较，舒张百分数增加33.4%(P<0.05)。见表1。
表1 促胰液素抗血清、Forskolin、cAMP抑制剂对促胰液素效应的影响
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Table 1 The effect of antisecretin serum,Forskolin and cAMP inhibitor on the relaxant effect of secretin in dispersed rat gastric muscle cells G
R
Secretin(10-6mol/L)
40.7±4.4
Antisecretin cerum(1:100)+secretin
1.8±0.8***
Forskolin(10-8mol/L)+secretin
, http://www.100md.com
54.3±1.7*
cAMP inghibitor(2×10-6mol/L)+secretin
408±1.1***
2.3 促胰液素对[35S]GTPγS结合的影响
促胰液素(10-6mol/L)刺激胃平滑肌细胞膜后，[35S]GTPγS结合率明显升高，cpm值为470±46.9，未给促胰液素刺激的对照组cpm值为630.5±61.7，升高34.4%(n=5，P<0.05)。2.4 特异性G蛋白抗体对促胰液素舒张胃平滑肌细胞效应的影响
用可通透胃平滑肌细胞，单独促胰液素(10-6mol/L)引起胃平滑肌舒张39.0%±3.7%，Gαs抗体加促胰液素仅舒张胃肌细胞4.5%±1.2%，抑制促胰液素舒张效应的88.5%(P<0.001)，而Gαi-3、Gαq/11抗体对促胰液素的舒张效应无显著影响(图2)。
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图2 特异性G蛋白抗体对促胰液素舒张效应的影响
Fig2 Effects of antibodies to G protein subunits on secretin induced relaxation in gastric muscle cells n=5,***P<0.001,compared with secretin group
2.5 促胰液素引起G蛋白抗体与[35S]GTPγS结合的变化
与未给促胰液素刺激的对照组比较，促胰液素引起Gαs抗体与[35S]GTPγS结合明显增加，cpm值由655.8±36.3升高到942.9±28.2，增加44.1%(n=5，P<0.001)，而Gαi-3、Gαq/11抗体与[35S]GTPγS结合无明显变化。3 讨论
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促胰液素是一个重要的脑肠肽。在体情况下，生理剂量的促胰液素即可抑制胃的运动，使胃舒张[1,2]。我们的实验表明，促胰液素引起大鼠胃体、胃窦平滑肌细胞舒张，其反应呈剂量依赖性。Steiner[3]等发现：大鼠的胃平滑肌表达一种高亲和力的特异性的促胰液素结合位点，与介导舒张有关。本研究用促胰液素抗体可以完全阻断促胰液素对胃肌细胞的舒张效应，证明促胰液素是与胃肌细胞上的促胰液素受体结合而发挥作用的。
G蛋白因能与鸟苷酸结合，故名鸟苷酸结合蛋白(GTP binding protein)，简称G蛋白(G protein)[8]。G蛋白是细胞外受体与胞内效应分子的偶联体，G蛋白偶联受体需与G蛋白偶联后才能产生胞内第二信使，将信号传到胞内，G蛋白在跨膜信息传递中起着“桥梁”的作用，因此阐明与受体偶联的G蛋白具有重要意义。当脑肠肽与受体结合后，使G蛋白a亚单位中的GDP释放，GTP取代GDP与a亚单位结合，激发一系列细胞内反应。利用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)法的原理，在酶标板上预先包被特异性的抗G蛋白α亚单位抗体可测定出与相应受体偶联的G蛋白类型[6]。我们的研究发现：促胰液素使大鼠胃平滑肌细胞膜蛋白与[35S]GTPγS的结合率明显增加，说明促胰液素与胃平滑肌细胞受体结合后激活了G蛋白。进一步的实验显示，Gαs抗体可以明显抑制促胰液素引起的胃肌细胞的舒张效应，表明促胰液素引起的胃平滑肌细胞的舒张由Gs蛋白介导。鉴于促胰液素引起Gas抗体与[35S]GTPγS的结合率明显升高，而Gαi-3、Gαq/11抗体与[35S]GTPγS的结合率并无明显变化，可以初步确定胃平滑肌细胞中促胰液素受体与Gs蛋白相偶联。
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促胰液素对靶器官的作用主要通过激活腺苷酸环化酶，随后产生环一磷酸腺苷并激活蛋白激酶A所介导[4]。但介导促胰液素舒张胃平滑肌细胞的信号转导通路是否与此相同，尚不完全清楚。我们的实验结果表明：腺苷酸环化酶激动剂Forskolin可增强促胰液素对肌细胞的舒张效应，而环一磷酸腺苷抑制剂则抑制促胰液素的舒张效应。进一步测定细胞内环一磷酸腺苷含量[9]，发现促胰液素使胞内环一磷酸腺苷含量升高，呈剂量依赖性，与促胰液素舒张肌细胞的量效曲线一致。充分说明促胰液素与肌细胞膜受体结合后，通过活化与受体偶联的G蛋白Gs，激活腺苷酸环化酶，使环一磷酸腺苷生成增加，介导促胰液素激发胃平滑肌细胞的舒张。蛋白激酶A在促胰液素舒张胃平滑肌细胞中的作用还需进一步研究。
参考文献
1 Lu Y，Owyang C.Secretin at physiological doses inhibits gastric motility via a afferent pathway.Am J Physiol，1995，268:G1012
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2 周吕，王立东.促胰液素对血管灌流大鼠离体胃运动的抑制作用.生理学报，1990，42：460
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