高温、烟碱及其联合作用对大鼠肝热应激蛋白70合成与分布的影响
作者：汤平涛 陈胜 贺涵贞 张国高
单位：
关键词：烟碱；高温；联合作用；热应激蛋白；肝
中华劳动卫生职业病杂志980208 【摘要】 目的 探讨烟碱、高温及其联合作用对肝热应激蛋白70合成与细胞胞核、胞浆分布的影响。方法 利用Western dot blot和流式细胞术对经烟碱(2.2 mg*kg-1*d-1、6.5 mg*kg-1*d-1，ig，8 天)或(和)高温(42℃60分钟)处理的大鼠肝细胞胞浆、胞核HSP70进行定量研究和超微结构的观察。结果 低、高剂量烟碱、高温及其联合作用下，肝细胞胞浆、胞核HSP70均明显升高；高剂量烟碱组胞浆HSP70升高程度明显低于低剂量组和高温组，烟碱、高温联合作用组较高温组低。高温组肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度明显升高，荧光强度明显高于烟碱和联合作用组。高温组大鼠恢复6小时后，胞浆HSP70升高，胞核无明显变化；烟碱组恢复后HSP70较立即处死组低，胞核HSP70升高。各组肝细胞超微结构变化明显，有剂量依存关系。结论 烟碱可诱导HSP70合成，其诱导作用较高温弱，与高温联合作用时对高温诱导作用呈明显的抑制效应。
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Effect of nicotine and high temperature on the synthesis and distribution of HSP70 in rat liver Tang Pingtao,Chen Sheng,He Hanzhen,et al.Laboratory of Thermobiology and Molecular Toxicolgy,Tongji Medical University,Wuhan 430030
Abstract To explore the effect of nicotine or high temperature and their combined effect on the synthesis and distribution of heat stress protein70(HSP70).HSP70 in hepatocyte cytoplasm and nuclei of rats were determined with Western dot blotting and flow cytometry,and the ultrastructural changes were observed following nicotine (2.2 mg*kg-1*d-1,6.5 mg*kg-1*d-1,ig for 8 days) and heat exposure (42℃ 1 h).The results showed that HSP70 increased significantly in cytolplasm and nuclei of the rats exposed to nicotine and heat;the increase of HSP70 in cytoplasm of high dose group was less than low dose group and heat group,and cytoplasm HSP70 in the rats of the combined effect group was decreased compared to the heat group.The rate of gated hepatocyte and fluorescent intensity of HSP70 in heat group increased significantly compared to both high dose group and the combined effect group.6 h after recovery,cytoplasm HSP70 increased in heat group,nuclei HSP70 increased in the rats exposed to nicotine.There were ultrastructural changes in hepatocyte of the rats in each group and a dose dependent relationship in nicotine group.It is concluded that nicotine may induce the synthesis and changes of distribution of HSP70 but its effect induced is less than high temperature.Nicotine may inhibit the effect induced by high temperature if they combine together.
, 百拇医药
Key words Nicotine High temperature Combined effect Heat stress protein Liver
热应激蛋白(heat stress proteins,HSPs)不仅是高温诱导的一类进化上高度保守的蛋白质[1]，而且可以被其它应激因素如重金属、缺氧、中毒、氧自由基诱导[2，3]。目前认为HSP70含量增多亦是最重要的HSP，为一种非特异的细胞保护蛋白[4]，肝脏是最主要的合成脏器之一[5]。本室以前研究表明：HSPs胞核转移与细胞核抗损伤作用有关[6]。我们通过Western dot blot和流式细胞计数的方法，进一步探讨HSP70生物学作用和烟碱及其与高温联合作用的毒理学意义。
材料与方法
1.动物分组与处理：雄性SD大鼠体重210±15 g(二级动物，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)，室温(20±2℃)环境下饲养，随机分为4组：(1)高温组(8只)，3只热应激(42±0.5℃，相对湿度19%，黑球温度44℃)60分钟后立即处死，5只热应激60分钟室温放置6小时处死；(2)烟碱组(13只)，烟碱(sigma产品，G.R)分别配成2.6 mmol/L、7.7 mmol/L溶液,低、高剂量分别按2.2 mg*kg-1*d-1(1/24LD50)、6.5 mg*kg-1*d-1(1/8LD50)灌胃,连续8天；(3)高温+烟碱组(8只)，第8天染毒后热应激60分钟室温放置6小时处死。灌胃容积5 ml/kg；高剂量第8天染毒后立即处死4只；(4)对照组(5只)，等体积芝麻油溶剂灌胃对照，室温处死，取血和肝脏备用。
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2.肝细胞核、胞浆制备[7]。
3.HSP70的检测：用已知HSP70 300 mg/L配成100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L、6.75 mg/L参与系列，与样品同步处理点样于同一NC膜上，以Western dot blot方法检测[8]。根据参比系列HSP70浓度的光密度值计算每毫克组织蛋白HSP70蛋白含量(μg/mg prot.)。
4.流式细胞荧光分析：取肝置冰冷70%乙醇溶液中剪碎(1 mm3)，胰酶消化，调整样品细胞1.108个/升。第一抗体兔抗入HSP70，第二抗体荧光素标记的羊抗兔(北京中山公司)，用美国BD公司FACS 420型FCM分析10 000个细胞，测定荧光抗体细胞标记率和荧光强度指数，以表示肝细胞HSP70表达的阳性率和表达的水平。
, 百拇医药 5.肝细胞超微结构观察：取小块肝戊二醛固定，锇酸双固定，乙醇、丙酮系列脱水，Epon-812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸复染，OPTON电镜(EMIOC型)观察、摄影。
6.数据处理：用SAS软件进行方差分析及两两比较，两组资料进行t检验。
结 果
一、高温、烟碱及其联合作用对大鼠肝匀浆、肝细胞胞浆、胞核和血清HSP70变化的影响(表1)
1.烟碱+高温和高温组大鼠，受热1小时后肛温明显升高，体重减轻。烟碱低、高剂量染毒组动物肝细胞胞浆、胞核HSP70明显升高，以低剂量组胞浆HSP70升高较明显并高于高剂量组水平(P<0.01)。肝组织匀浆HSP70高剂量组高于低剂量组19.5%，血清HSP70未见明显变化(P<0.05)。
表1 高温、烟碱及其两者联合作用对大鼠肝匀浆、肝细胞胞浆、核和血清HSP70变化的影响(±s)
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Table 1 The effects of high temperature,nicotine and their combined effect
on the changes of HSP70 in liver homogenate,cytoplasm,nuclei and serum in rats (±s)
组别
Group
剂量
Dose
(mg.kg-1)
动物数
Animal
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number
HSP70(μg/mg prot.)
血清HSP70
HSP70 in serum
(mg/L prot.)
匀浆
Homogenate
细胞胞浆
Cytoplasm
细胞核
Nuclei
低剂量烟碱
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Nicotine
2.2
4
58.4
79.4±4.8*△
110.8±10.4*
42.2±2.6
高剂量烟碱
Nicotine
6.5
5
69.8
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69.4±6.0*
111.4±10.2*
40.5±6.6*
低剂量烟碱+高温
Nicotine+42℃
2.2
3
77.9
83.2±7.4*
102.6±8.3*
37.4±5.9
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高剂量烟碱+高温
Nicotine+42℃
6.5
5
63.6
69.7±2.4*#
108.6±9.8*
44.9±9.4#
高温
42℃
5
77.0
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85.1±4.9*
105.8±4.7*
64.7±14.9*
对照
Control
5
53.6
56.8±4.3
78.6±6.1
39.4±3.8
与对照组比较，* P<0.01；与高剂量组比较，△ P<0.01；与高温组比较，# P<0.01
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* P<0.01 vs control;△ P<0.01 vs high dose (6.5 mg/kg) group;# P<0.01 vs 42℃ group 2.低剂量烟碱、高温及其联合作用组肝细胞胞浆、核HSP70明显升高(P<0.01)，高温组血清HSP70明显升高(P<0.01)、肝组织匀浆HSP70高温和烟碱+高温组高于对照组45%。
3.高剂量烟碱、高温及其联合作用组动物肝细胞胞浆、核HSP70均明显升高(P<0.01)，胞浆HSP70以高温组升高较明显，高于烟碱和联合作用组(P<0.01)。
二、受热和(或)暴露高剂量烟碱大鼠肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度指数
高温组肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度明显升高(P<0.01)。高剂量烟碱和烟碱+高温组肝细胞HSP70表达的阳性率无明显变化，但明显低于单纯高温组(P<0.05)，细胞的荧光强度有降低趋势，但差异无显著性(P>0.05)(表2)。
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表2 受热和(或)暴露高剂量烟碱(6.5 mg/kg)大鼠
肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度指数的变化
Table 2 The changes of rate of gated hepatocytes and
index of fluorescent intensity of HSP70 in rats exposed
to high dose nicotine B(6.5 mg/kg) or heat (±s)
组别
Groups
肝细胞表达阳性率
, 百拇医药
Rate of gated
hepatocytes(%)
荧光强度指数
Index of
fluorescent intensity
烟碱
Nicotine
20.5±3.7
0.94±0.046#
烟碱+高温
Nicotine+42℃
, 百拇医药
16.7±3.5
0.94±0.053#
高温
42℃
28.5±5.7*
1.09±0.050*
对照 Control
20℃
21.9±1.79
1.00±0.045
n=5；每只大鼠计数10 000个细胞；与对照组比较，*P<0.01；与高温组比较，#P<0.01
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Cytometer:10 000 cells per rat,*P<0.01 vs control;
#P<0.01 vs 42℃ group
三、受热或暴露烟碱大鼠不同时相肝细胞胞浆、核HSP70的变化
高剂量烟碱染毒第8天立即处死组动物，肝细胞胞浆HSP70明显高于染毒后恢复6小时组(P<0.01)，而胞核升高值明显低于恢复6小时组(P<0.05)；高温组恢复6小时后胞浆HSP70明显高于立即处死组动物(P<0.05)，胞核HSP70无明显变化(P>0.05)(表3)。
各实验组肝超微结构改变明显。烟碱高剂量及其与高温联合作用组肝细胞核溶解、溶酶体增多；细胞器模糊较低剂量组明显且糖原颗粒消失。
, http://www.100md.com 表3 受热或暴露烟碱(6.5 mg/kg)大鼠不同时相
肝细胞胞浆、核HSP70的变化
Table 3 Changes of HSP70 in liver cytoplasm and
nuclei of rats exposed to heat or nicotine (6.5 mg/kg)
in different periods (±s)
立即处死
Immediatly
after killing
恢复6小时后
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6 h after
recovery
t值
t value
P值
P value
高温 42℃
胞浆
Cytoplasm
76.0±3.7
85.1±4.9
2.732
, 百拇医药
<0.05
胞核
Nuclei
108.2±9.0
105.8±4.7
0.327
>0.05
烟碱 Nicotine
胞浆
Cytoplasm
106.6±12.4
69.4±6.0
, 百拇医药
6.963
<0.01
胞核
Nuclei
96.3±4.1
111.4±6.0
2.920
<0.01
n=3～5;HSP70 μg/mg prot.
讨 论
热应激反应是一种普遍存在而且高度保守的生理性防御反应。越来越多的资料表明：当组织、细胞受到损伤时，伴随HSP含量的增加，因而普遍认为HSP的功能主要在于稳定细胞的结构，维持正常的生理功能。烟碱和高温均可导致肝微粒体脂质过氧化，抑制SOD的活力,但是否影响肝HSP70合成与核浆分布，是否具有联合作用，阐明这些问题对于防治措施的提出，丰富HSP70生物学功能的知识具有十分重要的意义。
, 百拇医药
实验表明：烟碱可以诱导肝HSP70表达、分布在肝细胞胞浆、胞核。但其诱导的作用不如高温明显，两者同时作用并不能增加高温或烟碱单独作用下肝HSP70合成水平，而且表现对高温诱导作用呈明显抑制效应。虽然核浆比值提高，但烟碱与高温联合作用组动物肝细胞胞核HSP70含量并不增多,而且胞浆HSP70含量较低。因此，也不能用核内转移来解释联合作用组胞浆HSP70含量较低。表达HSP70的细胞数和细胞荧光强度分析也表明烟碱对高温的诱导作用具有抑制效应。
进一步分析烟碱染毒剂量-效应关系发现:肝细胞胞浆HSP70含量有剂量依存关系。表现为低剂量烟碱染毒(2.2 mg*kg-1*d-1,8 天)高于高剂量(6.5 mg*kg-1*d-1，8 天)，而胞核HSP70水平在两种剂量作用下未见差异；低剂量烟碱染毒与高温联合作用与单纯热应激动物肝细胞胞浆HSP70合成水平相近且明显高于高剂量烟碱与高温联合作用组动物。表明：当烟碱染毒剂量(1/24 LD50)达到一定强度后，再增加剂量并不能提高HSP70的合成，相反对高温诱导HSP70合成作用有抑制效应，其机制是由于烟碱的直接损害细胞结构还是影响信号传导与转录调控元件，有待进一步研究。
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结合超微结构改变的分析，烟碱对肝细胞核损伤明显，表现为肝细胞核固缩、核溶解、细胞结构模糊、糖原消失、溶酶体增多，细胞损伤程度有剂量依存关系。提示：高剂量烟碱肝细胞损伤较严重，一方面应激诱导HSP70合成同时也因结构破坏加重而使其合成受抑制。
对热应激后热应激蛋白细胞核转移现象的研究表明：热应激(42℃1 小时)恢复6小时后胞浆HSP70明显高于未经恢复的动物，而胞核HSP70无明显变化。提示：热应激过程中细胞内有限的热应激蛋白优先进入胞核。有人认为在急性应激后，HSP首先稳定或溶解核、核仁和(或)染色体损伤蛋白[9]，而恢复一定时间后，HSP70并没有立即返回胞浆，胞核内HSP70含量无明显变化，其核浆比值的下降是胞浆HSP在离开应激环境后继续合成使其含量增多所致。这可能与细胞内氧自由基、脂质过氧化产物诱导合成的因素继续存在有关[10]，HSP可防止溶酶体破坏，提高细胞膜稳定性。因此，HSP70对细胞的抗损伤和恢复起到极其重要的作用。与热应激不同的是，烟碱染毒胞浆HSP70迅速升高，恢复6小时后则迅速下降。这可能与恢复过程HSP70动物肝细胞胞核转移和细胞损伤导致HSP70合成障碍有关。
, 百拇医药
(本实验在同济医科大学完成，在实验中得到王瑞波、吴广林、孙振林实习生，左道富、穆雅生、鲁翠荣、刘藏、邬堂春老师，艾宝民、牛玉杰、李震中博士，吴少平硕士的大力帮助，志谢)
参 考 文 献
1 Schlesinger MJ.Heat shock proteins.J Biol Chem,1990,265:12111～12114.
2 Kampinga HH,Brunsting JF,Stege GJ,et al.Thermal protein denaturation and protein aggregation in cells made thermotolerant by various chemicls:role of heat shock proteins.Exp Cell Res,1995,219:536～546.
, 百拇医药
3 Kelly E,Morgan N,Woo ES,et al.Metallothionein and HSP72 are induced in the liver by hemorrhagic shock and resuscitation but not by shock alone.Surgery,1996,120:403～410.
4 Hotchkiss R,Nunnally I,Lindquist,et al.Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin.Am J Physol,1993,265 (6Pt2):1447～1457.
5 Pannen BH,Maeda K,Ayuse T,et al.Hepatic heat shock and acute phase gene expresion are induced simultaneously after celiotomy in the anesthetized pig.Anesthesiology,1995,83:850～859.
, 百拇医药
6 吴扬，张伟，徐代根，等.热应激蛋白的诱导、定位与再分布研究.同济医科大学学报，1995，24：419～421.
7 汤平涛，王翔朴，卢迪生.磷、砷、四氯化碳肝损伤线粒体微粒体乳酸脱氢酶的改变.中国药理学与毒理学杂志，1992，6：292～296.
8 何骁生，潘秋萍，邬堂春，等.Western斑点印迹法检测主要热应激蛋白.中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：376～377.
9 Currie RW,Tanguay RM,Kingma Jr JG.Heat shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit heart.Circulation,1993,87:963.
10汤平涛，吴广林，王瑞波，等.烟碱、高温及其联合作用对大鼠肝GST、Cp和脂质过氧化反应的影响.中华劳动卫生职业病杂志，1997，15：160～162.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药
单位：
关键词：烟碱；高温；联合作用；热应激蛋白；肝
中华劳动卫生职业病杂志980208 【摘要】 目的 探讨烟碱、高温及其联合作用对肝热应激蛋白70合成与细胞胞核、胞浆分布的影响。方法 利用Western dot blot和流式细胞术对经烟碱(2.2 mg*kg-1*d-1、6.5 mg*kg-1*d-1，ig，8 天)或(和)高温(42℃60分钟)处理的大鼠肝细胞胞浆、胞核HSP70进行定量研究和超微结构的观察。结果 低、高剂量烟碱、高温及其联合作用下，肝细胞胞浆、胞核HSP70均明显升高；高剂量烟碱组胞浆HSP70升高程度明显低于低剂量组和高温组，烟碱、高温联合作用组较高温组低。高温组肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度明显升高，荧光强度明显高于烟碱和联合作用组。高温组大鼠恢复6小时后，胞浆HSP70升高，胞核无明显变化；烟碱组恢复后HSP70较立即处死组低，胞核HSP70升高。各组肝细胞超微结构变化明显，有剂量依存关系。结论 烟碱可诱导HSP70合成，其诱导作用较高温弱，与高温联合作用时对高温诱导作用呈明显的抑制效应。
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Effect of nicotine and high temperature on the synthesis and distribution of HSP70 in rat liver Tang Pingtao,Chen Sheng,He Hanzhen,et al.Laboratory of Thermobiology and Molecular Toxicolgy,Tongji Medical University,Wuhan 430030
Abstract To explore the effect of nicotine or high temperature and their combined effect on the synthesis and distribution of heat stress protein70(HSP70).HSP70 in hepatocyte cytoplasm and nuclei of rats were determined with Western dot blotting and flow cytometry,and the ultrastructural changes were observed following nicotine (2.2 mg*kg-1*d-1,6.5 mg*kg-1*d-1,ig for 8 days) and heat exposure (42℃ 1 h).The results showed that HSP70 increased significantly in cytolplasm and nuclei of the rats exposed to nicotine and heat;the increase of HSP70 in cytoplasm of high dose group was less than low dose group and heat group,and cytoplasm HSP70 in the rats of the combined effect group was decreased compared to the heat group.The rate of gated hepatocyte and fluorescent intensity of HSP70 in heat group increased significantly compared to both high dose group and the combined effect group.6 h after recovery,cytoplasm HSP70 increased in heat group,nuclei HSP70 increased in the rats exposed to nicotine.There were ultrastructural changes in hepatocyte of the rats in each group and a dose dependent relationship in nicotine group.It is concluded that nicotine may induce the synthesis and changes of distribution of HSP70 but its effect induced is less than high temperature.Nicotine may inhibit the effect induced by high temperature if they combine together.
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Key words Nicotine High temperature Combined effect Heat stress protein Liver
热应激蛋白(heat stress proteins,HSPs)不仅是高温诱导的一类进化上高度保守的蛋白质[1]，而且可以被其它应激因素如重金属、缺氧、中毒、氧自由基诱导[2，3]。目前认为HSP70含量增多亦是最重要的HSP，为一种非特异的细胞保护蛋白[4]，肝脏是最主要的合成脏器之一[5]。本室以前研究表明：HSPs胞核转移与细胞核抗损伤作用有关[6]。我们通过Western dot blot和流式细胞计数的方法，进一步探讨HSP70生物学作用和烟碱及其与高温联合作用的毒理学意义。
材料与方法
1.动物分组与处理：雄性SD大鼠体重210±15 g(二级动物，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供)，室温(20±2℃)环境下饲养，随机分为4组：(1)高温组(8只)，3只热应激(42±0.5℃，相对湿度19%，黑球温度44℃)60分钟后立即处死，5只热应激60分钟室温放置6小时处死；(2)烟碱组(13只)，烟碱(sigma产品，G.R)分别配成2.6 mmol/L、7.7 mmol/L溶液,低、高剂量分别按2.2 mg*kg-1*d-1(1/24LD50)、6.5 mg*kg-1*d-1(1/8LD50)灌胃,连续8天；(3)高温+烟碱组(8只)，第8天染毒后热应激60分钟室温放置6小时处死。灌胃容积5 ml/kg；高剂量第8天染毒后立即处死4只；(4)对照组(5只)，等体积芝麻油溶剂灌胃对照，室温处死，取血和肝脏备用。
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2.肝细胞核、胞浆制备[7]。
3.HSP70的检测：用已知HSP70 300 mg/L配成100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L、6.75 mg/L参与系列，与样品同步处理点样于同一NC膜上，以Western dot blot方法检测[8]。根据参比系列HSP70浓度的光密度值计算每毫克组织蛋白HSP70蛋白含量(μg/mg prot.)。
4.流式细胞荧光分析：取肝置冰冷70%乙醇溶液中剪碎(1 mm3)，胰酶消化，调整样品细胞1.108个/升。第一抗体兔抗入HSP70，第二抗体荧光素标记的羊抗兔(北京中山公司)，用美国BD公司FACS 420型FCM分析10 000个细胞，测定荧光抗体细胞标记率和荧光强度指数，以表示肝细胞HSP70表达的阳性率和表达的水平。
, 百拇医药 5.肝细胞超微结构观察：取小块肝戊二醛固定，锇酸双固定，乙醇、丙酮系列脱水，Epon-812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸复染，OPTON电镜(EMIOC型)观察、摄影。
6.数据处理：用SAS软件进行方差分析及两两比较，两组资料进行t检验。
结 果
一、高温、烟碱及其联合作用对大鼠肝匀浆、肝细胞胞浆、胞核和血清HSP70变化的影响(表1)
1.烟碱+高温和高温组大鼠，受热1小时后肛温明显升高，体重减轻。烟碱低、高剂量染毒组动物肝细胞胞浆、胞核HSP70明显升高，以低剂量组胞浆HSP70升高较明显并高于高剂量组水平(P<0.01)。肝组织匀浆HSP70高剂量组高于低剂量组19.5%，血清HSP70未见明显变化(P<0.05)。
表1 高温、烟碱及其两者联合作用对大鼠肝匀浆、肝细胞胞浆、核和血清HSP70变化的影响(±s)
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Table 1 The effects of high temperature,nicotine and their combined effect
on the changes of HSP70 in liver homogenate,cytoplasm,nuclei and serum in rats (±s)
组别
Group
剂量
Dose
(mg.kg-1)
动物数
Animal
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number
HSP70(μg/mg prot.)
血清HSP70
HSP70 in serum
(mg/L prot.)
匀浆
Homogenate
细胞胞浆
Cytoplasm
细胞核
Nuclei
低剂量烟碱
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Nicotine
2.2
4
58.4
79.4±4.8*△
110.8±10.4*
42.2±2.6
高剂量烟碱
Nicotine
6.5
5
69.8
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69.4±6.0*
111.4±10.2*
40.5±6.6*
低剂量烟碱+高温
Nicotine+42℃
2.2
3
77.9
83.2±7.4*
102.6±8.3*
37.4±5.9
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高剂量烟碱+高温
Nicotine+42℃
6.5
5
63.6
69.7±2.4*#
108.6±9.8*
44.9±9.4#
高温
42℃
5
77.0
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85.1±4.9*
105.8±4.7*
64.7±14.9*
对照
Control
5
53.6
56.8±4.3
78.6±6.1
39.4±3.8
与对照组比较，* P<0.01；与高剂量组比较，△ P<0.01；与高温组比较，# P<0.01
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* P<0.01 vs control;△ P<0.01 vs high dose (6.5 mg/kg) group;# P<0.01 vs 42℃ group 2.低剂量烟碱、高温及其联合作用组肝细胞胞浆、核HSP70明显升高(P<0.01)，高温组血清HSP70明显升高(P<0.01)、肝组织匀浆HSP70高温和烟碱+高温组高于对照组45%。
3.高剂量烟碱、高温及其联合作用组动物肝细胞胞浆、核HSP70均明显升高(P<0.01)，胞浆HSP70以高温组升高较明显，高于烟碱和联合作用组(P<0.01)。
二、受热和(或)暴露高剂量烟碱大鼠肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度指数
高温组肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度明显升高(P<0.01)。高剂量烟碱和烟碱+高温组肝细胞HSP70表达的阳性率无明显变化，但明显低于单纯高温组(P<0.05)，细胞的荧光强度有降低趋势，但差异无显著性(P>0.05)(表2)。
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表2 受热和(或)暴露高剂量烟碱(6.5 mg/kg)大鼠
肝细胞HSP70表达阳性率和荧光强度指数的变化
Table 2 The changes of rate of gated hepatocytes and
index of fluorescent intensity of HSP70 in rats exposed
to high dose nicotine B(6.5 mg/kg) or heat (±s)
组别
Groups
肝细胞表达阳性率
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Rate of gated
hepatocytes(%)
荧光强度指数
Index of
fluorescent intensity
烟碱
Nicotine
20.5±3.7
0.94±0.046#
烟碱+高温
Nicotine+42℃
, 百拇医药
16.7±3.5
0.94±0.053#
高温
42℃
28.5±5.7*
1.09±0.050*
对照 Control
20℃
21.9±1.79
1.00±0.045
n=5；每只大鼠计数10 000个细胞；与对照组比较，*P<0.01；与高温组比较，#P<0.01
, 百拇医药
Cytometer:10 000 cells per rat,*P<0.01 vs control;
#P<0.01 vs 42℃ group
三、受热或暴露烟碱大鼠不同时相肝细胞胞浆、核HSP70的变化
高剂量烟碱染毒第8天立即处死组动物，肝细胞胞浆HSP70明显高于染毒后恢复6小时组(P<0.01)，而胞核升高值明显低于恢复6小时组(P<0.05)；高温组恢复6小时后胞浆HSP70明显高于立即处死组动物(P<0.05)，胞核HSP70无明显变化(P>0.05)(表3)。
各实验组肝超微结构改变明显。烟碱高剂量及其与高温联合作用组肝细胞核溶解、溶酶体增多；细胞器模糊较低剂量组明显且糖原颗粒消失。
, http://www.100md.com 表3 受热或暴露烟碱(6.5 mg/kg)大鼠不同时相
肝细胞胞浆、核HSP70的变化
Table 3 Changes of HSP70 in liver cytoplasm and
nuclei of rats exposed to heat or nicotine (6.5 mg/kg)
in different periods (±s)
立即处死
Immediatly
after killing
恢复6小时后
, http://www.100md.com
6 h after
recovery
t值
t value
P值
P value
高温 42℃
胞浆
Cytoplasm
76.0±3.7
85.1±4.9
2.732
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<0.05
胞核
Nuclei
108.2±9.0
105.8±4.7
0.327
>0.05
烟碱 Nicotine
胞浆
Cytoplasm
106.6±12.4
69.4±6.0
, 百拇医药
6.963
<0.01
胞核
Nuclei
96.3±4.1
111.4±6.0
2.920
<0.01
n=3～5;HSP70 μg/mg prot.
讨 论
热应激反应是一种普遍存在而且高度保守的生理性防御反应。越来越多的资料表明：当组织、细胞受到损伤时，伴随HSP含量的增加，因而普遍认为HSP的功能主要在于稳定细胞的结构，维持正常的生理功能。烟碱和高温均可导致肝微粒体脂质过氧化，抑制SOD的活力,但是否影响肝HSP70合成与核浆分布，是否具有联合作用，阐明这些问题对于防治措施的提出，丰富HSP70生物学功能的知识具有十分重要的意义。
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实验表明：烟碱可以诱导肝HSP70表达、分布在肝细胞胞浆、胞核。但其诱导的作用不如高温明显，两者同时作用并不能增加高温或烟碱单独作用下肝HSP70合成水平，而且表现对高温诱导作用呈明显抑制效应。虽然核浆比值提高，但烟碱与高温联合作用组动物肝细胞胞核HSP70含量并不增多,而且胞浆HSP70含量较低。因此，也不能用核内转移来解释联合作用组胞浆HSP70含量较低。表达HSP70的细胞数和细胞荧光强度分析也表明烟碱对高温的诱导作用具有抑制效应。
进一步分析烟碱染毒剂量-效应关系发现:肝细胞胞浆HSP70含量有剂量依存关系。表现为低剂量烟碱染毒(2.2 mg*kg-1*d-1,8 天)高于高剂量(6.5 mg*kg-1*d-1，8 天)，而胞核HSP70水平在两种剂量作用下未见差异；低剂量烟碱染毒与高温联合作用与单纯热应激动物肝细胞胞浆HSP70合成水平相近且明显高于高剂量烟碱与高温联合作用组动物。表明：当烟碱染毒剂量(1/24 LD50)达到一定强度后，再增加剂量并不能提高HSP70的合成，相反对高温诱导HSP70合成作用有抑制效应，其机制是由于烟碱的直接损害细胞结构还是影响信号传导与转录调控元件，有待进一步研究。
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结合超微结构改变的分析，烟碱对肝细胞核损伤明显，表现为肝细胞核固缩、核溶解、细胞结构模糊、糖原消失、溶酶体增多，细胞损伤程度有剂量依存关系。提示：高剂量烟碱肝细胞损伤较严重，一方面应激诱导HSP70合成同时也因结构破坏加重而使其合成受抑制。
对热应激后热应激蛋白细胞核转移现象的研究表明：热应激(42℃1 小时)恢复6小时后胞浆HSP70明显高于未经恢复的动物，而胞核HSP70无明显变化。提示：热应激过程中细胞内有限的热应激蛋白优先进入胞核。有人认为在急性应激后，HSP首先稳定或溶解核、核仁和(或)染色体损伤蛋白[9]，而恢复一定时间后，HSP70并没有立即返回胞浆，胞核内HSP70含量无明显变化，其核浆比值的下降是胞浆HSP在离开应激环境后继续合成使其含量增多所致。这可能与细胞内氧自由基、脂质过氧化产物诱导合成的因素继续存在有关[10]，HSP可防止溶酶体破坏，提高细胞膜稳定性。因此，HSP70对细胞的抗损伤和恢复起到极其重要的作用。与热应激不同的是，烟碱染毒胞浆HSP70迅速升高，恢复6小时后则迅速下降。这可能与恢复过程HSP70动物肝细胞胞核转移和细胞损伤导致HSP70合成障碍有关。
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(本实验在同济医科大学完成，在实验中得到王瑞波、吴广林、孙振林实习生，左道富、穆雅生、鲁翠荣、刘藏、邬堂春老师，艾宝民、牛玉杰、李震中博士，吴少平硕士的大力帮助，志谢)
参 考 文 献
1 Schlesinger MJ.Heat shock proteins.J Biol Chem,1990,265:12111～12114.
2 Kampinga HH,Brunsting JF,Stege GJ,et al.Thermal protein denaturation and protein aggregation in cells made thermotolerant by various chemicls:role of heat shock proteins.Exp Cell Res,1995,219:536～546.
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3 Kelly E,Morgan N,Woo ES,et al.Metallothionein and HSP72 are induced in the liver by hemorrhagic shock and resuscitation but not by shock alone.Surgery,1996,120:403～410.
4 Hotchkiss R,Nunnally I,Lindquist,et al.Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin.Am J Physol,1993,265 (6Pt2):1447～1457.
5 Pannen BH,Maeda K,Ayuse T,et al.Hepatic heat shock and acute phase gene expresion are induced simultaneously after celiotomy in the anesthetized pig.Anesthesiology,1995,83:850～859.
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6 吴扬，张伟，徐代根，等.热应激蛋白的诱导、定位与再分布研究.同济医科大学学报，1995，24：419～421.
7 汤平涛，王翔朴，卢迪生.磷、砷、四氯化碳肝损伤线粒体微粒体乳酸脱氢酶的改变.中国药理学与毒理学杂志，1992，6：292～296.
8 何骁生，潘秋萍，邬堂春，等.Western斑点印迹法检测主要热应激蛋白.中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：376～377.
9 Currie RW,Tanguay RM,Kingma Jr JG.Heat shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit heart.Circulation,1993,87:963.
10汤平涛，吴广林，王瑞波，等.烟碱、高温及其联合作用对大鼠肝GST、Cp和脂质过氧化反应的影响.中华劳动卫生职业病杂志，1997，15：160～162.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药