间二硝基苯急性中毒一例报告
作者：李树青 叶岩
单位：
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志980203 【摘要】 目的 探讨热应激过程中热应激蛋白(HSP)的合成动力学、组织细胞分布及其功能。方法 通过体内外实验，采用Western blot、免疫组化和Northern dot blot等方法。结果 小鼠巨噬细胞和人淋巴细胞受热后均见以70 kD的HSP合成最多，且与受热强度有关。随着HSP的增多，细胞存活率明显升高，受损伤程度减轻。热应激时受试动物HSP70表达累积量主要在心、肝组织中，且主要位于胞核内，恢复期移出至胞浆。结论 HSP70合成水平与分布对热应激后组织细胞保护作用有关。
Study on the role of HSPs in heat acclimatization and thermotolerance He Hanzhen,Wu Tangchun,Pan Qiuping，et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract The distribution and functions of heat stress proteins (HSPs) in the tissue and cell during heat stress in vivo and in vitro were studied by using HSP70 Western blot,immuno-histochemistry,HSP70cDNA probe and Northern dot blot technique.The results showed:the content of HSP70 synthesis was the most one among the HSPs in mouse macrophages and human lymphocytes which was related to the intensity of heat treatment.Along with the increase of HSP,cellular survival rate obviously rose and heat injury was reduced.The accumulation of HSP70 varied in different organs among which its content in heart and liver was the highest and mainly located in nucleus during heat stress and then transfered to cytoplasmic matrix during recovery.These results suggest that HSP70 may play a critical role in the protection of stressed cells.
, 百拇医药
Key words Heat stress Heat stress protein Heat acclimatization Thermotolerance
从细菌到人类，受热应激后均可发生热应激反应(heat stress response)，此反应的特点是选择性合成一组多肽——热应激蛋白(heat stress proteins,HSPs)，它是一种保护机体的蛋白，故称之为“看家蛋白”[1]。众所周知，人对热可产生适应，热适应后可缓解其热引起的生理紧张，提高耐热能力，但热适应又是有一定限度的，超过限度后可出现热损伤，故在研究热引起机体生理、生化反应的基础上，应进一步探索热应激过程中热应激蛋白的作用。
材料与方法
1.HSPs合成动力学和功能：(1)将体外培养稳定生长的小鼠腹腔巨噬细胞分为热应激组(43℃20分钟)与对照组。用3H-亮氨酸(1.85×105 Bq/ml)掺入试验，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳，凝胶切段，液闪计数法测定3H-亮氨酸掺入量(CPM)。(2)取健康献血人员外周血淋巴细胞分别于39℃、41℃、43℃、45℃受热1小时和经3次39℃30分钟(间隔3小时)预热，再于41℃下受热1小时(共分5组)，收集细胞(1×107细胞/毫升)。分别于受热后1、3、6和16小时加入3H-亮氨酸(1.85×105 Bq/ml)进行1小时细胞渗入实验，随后收集细胞依(1)的方法进行检测。另用0.1%结晶紫染色细胞后立即镜检，计数细胞存活率。同时收集细胞在透射电镜下观察细胞形态。
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2.HSP70在组织细胞中的分布：(1)雄性青紫兰健康家兔21只(体重2.7±0.34 kg)，随机分为3组：①非热耐受组:置于人工气候室受热41±2℃，使肛温上升2.2±0.2℃后转入常温6小时，于受热前后及常温6小时后耳中央静脉采血分离淋巴细胞，空气栓塞处死，立即取心、肝、脾、肾和骨骼肌(左右肢大腿内侧)组织进行HSP70分析。②热耐受组:41±2℃连续受热，每次肛温上升1.6±0.5℃，40天后同①组方法处理动物和收集样品。③对照组:17±5℃动物房饲养40天后同①组方法取样，按1.(1)的方法进行检测。(2)取培养的人体乳腺癌细胞2R75分为6组：①37℃30分钟;②43℃30分钟;③44℃30分钟;④45℃30分钟;⑤43℃30分钟后移入37℃恢复3小时;⑥43℃30分钟后移入37℃30分钟。每组处理后收集细胞胞浆和胞核，采用Western blot和免疫组织化学方法检测HSP70。
3.高温环境下大鼠HSP70mRNA表达水平：Wistar雄性健康大鼠18只,体重150±10 g，分别受热42±0.5℃：①5分钟;②15分钟;③30分钟;④45分钟;⑤60分钟;⑥75分钟;⑦120分钟。测量肛温，并取50 mg肝脏，采用HSP70cDNA探针，以Northern dot blot技术，显影结果用图像分析仪(CS-930扫描仪，波长460 nm)定量(积分面积)。
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结 果
1.HSPs合成动力学和功能：用同位素标记掺入试验发现(图1)，与对照组比，热应激组凝胶3、4段出现明显高峰，以50～70 kD蛋白质成分增加，特别以70 kD增加更明显。
图1 3H-亮氨酸掺入巨噬细胞合成在各段凝胶的分布
Fig 1 Distribution of 3H-leucine incorporation into the synthesis of macrophage in different part of gel
人淋巴细胞在不同温度下受热1小时，分子量分别110、90、73、71、68、54、46和22 kD的蛋白合成增加，尤其是70 kD家族(含73.71和68 kD)明显增加。不同温度下合成动力学见图2，其中以41℃条件下HSP70合成量最多且稳定，39℃预热可增强HSP70合成反应。
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细胞存活率见图3。预热组细胞受热1小时内，细胞存活率下降较快，随后趋于稳定，未经预热组细胞存活率持续下降，明显低于预热组。透射电镜发现预热处理的淋巴细胞，细胞浆内仅出现少量空泡，粗面内质网部分脱颗粒；而非预热组细胞出现明显的胞浆空泡，内质网高度肿胀，脱颗粒，线粒体内嵴减少和消失，核周围间隔增宽。
图2 HSP70合成动力学
*经39℃预热处理后，细胞再于41℃条件下受热
Fig 2 The synthesis kineties of HSP70
*After pretreated at 39℃,then exposed to 41℃
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图3 不同温度下人淋巴细胞存活曲线
*本实验结果皆以37℃培养下淋巴细胞存活率为100%作对照，重复4次而获得；△经39℃预热处理后，细胞再于42℃条件下受热
Fig 3 The survival curve of human lymphocytes at different temperature
*The lymphocytes survival rates are expressed as % of control.The data are the means of 4 experiments.△ After pretreated at 39℃,then exposed to 41℃
2.HSPs在各组织细胞中的分布：处于不同状态家兔各组织中HSPs均有合成，但不同脏器存在着一定差异，其中仍以70 kD家族为主，且多存在于心脏和肝脏中，而脾肾和骨骼肌中主要是低分子量(40 kD以下)的多肽。培养的ZR75细胞株在未热应激前，HSP70主要位于胞浆，无论是43℃还是45℃受热30分钟后，均使它们迅速地向核内转移，同时HSP70的含量增加，且依温度升高而递增，在热应激后恢复期第3小时，又回到胞浆(图4)。
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图4 不同热处理期间HSP70在细胞内重新分布的定量分析
1：对照(37℃)； 2：43℃ 30 min； 3：44℃ 30 min； 4：45℃ 30 min； 5：43℃ 30 min+37℃恢复3 h； 6：43℃ 30 min+37℃恢复2.5 h+45℃ 30 min
Fig 4 The quantitative analysis of HSP70 re-distribution in cytoplasma treated with different temperature
1：Control(37℃)； 2：43℃ 30 min； 3：44℃ 30 min； 4：45℃ 30 min； 5：43℃ 30 min+37℃ recovery for 3 h； 6：43℃ 30 min+37℃ recovery 2.5 h+45℃ 30 min
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3.高温环境下大鼠HSP70mRNA表达的情况见图5。
图5 热应激对小鼠肛温和肝脏HSP70mRNA、HSP70累积动力学的影响
Fig 5 The effects of heat stress on rectal temperature and accumulated kinetics of HSP70mRNA and HSP70 in liver of mice
图5可见:热应激后动物平均肛温均升高，其升高值随受热时间的延长而逐渐增加，于45分钟时达最高值(3.3℃)，反映体内严重蓄热。肝脏HSP70mRNA含量亦于受热45分钟后开始增加，60分钟时明显增加。后体温逐渐恢复(仍平均升高1.5℃以上)，但HSP70mRNA迅速增加，其变化与体内蓄热相关。肝脏HSP70亦随受热时间延长而呈升高趋势。
, 百拇医药
讨 论
热应激后，动物肛温随受热时间延长而升高，各组组织细胞受不同热作用后均有新的蛋白质合成，其中以70 kD家族的HSP合成最多，其合成量与受热程度和时间有关。随着HSP的增多，细胞存活率增高、受损轻，特别是热适应后细胞损伤更轻，显示出HSP70对细胞的保护作用[2]。我们曾发现预热组细胞内K+、Na+和Ca2+浓度变化较非预热组小，而非预热组细胞膜过氧化脂质含量明显高于预热组[3]。Carbajal[4]亦发现HSP常分布于核周及浆膜周围，并与质膜结合，起到稳定质膜的作用。
用Western blot和免疫组化方法发现HSP70主要位于胞浆，热应激后核内HSP70明显增加，在恢复期间尽管HSP70不断积累，但在胞浆中HSP70增加明显。当再次热应激时，又见核内HSP70明显增加，且出现两个特征：一是严格的热依赖性，二是十分迅速。HSP70的重新分布对热耐受的产生起到了极重要的作用[5]。关于蛋白质进入核内方式，当分子量大于30 kD时可能涉及两个步骤：一是与核孔核蛋白结合，二是可能通过依赖于ATP的过程转运[6]。亦有人认为：在真核生物中有许多种HSP70相关蛋白，它们在应激条件时才诱导合成，由多个拷贝的基因所编码，根据所在的细胞空间不同，其中一类胞浆HSP70应激时存在于细胞核，在应激后的恢复期又回到胞浆[7]。
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热应激时，整体动物为了适应环境，各脏器组织充分发挥自我生理调节作用，致HSP70、HSP70mRNA在各脏器组织中的表达水平各异。在心、肝、脾、肾和骨骼肌中，HSP70主要在心、肝组织中大量表达，且与动物肛温变化一致。可能是因体温升高，诱发热应激基因开放，增加了HSP70cDNA的转录和RNA的稳定性，进而使HSP70合成增加。
这些现象提示HSP70可保护机体免受高温的损害，亦提示既然HSP70在细胞内累积量与所受应激强度有关，当机体出现热损伤——中暑后，HSP70合成如何，Lindquist等[8]曾提出HSP70的合成是“自我控制”(selflimiting)的，故需进一步研究中暑患者HSP70合成动力学，为防暑保健措施提供理论依据。
参 考 文 献
1 Getting MJ,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33～45.
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2 Barbara JW,Kingston RE,Morimoto RI.Human HSP70 promoter contains at least two distinct regulatory damains.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:629～633.
3 龚小亮，张国高，贺涵贞.高温诱导淋巴细胞多肽合成与热耐受关系的探讨.同济医科大学学报，1990，19(增刊)：8～10.
4 Carbajal ME,Valet JP.Charest PM,et al.Purification of drosophila HSP83 and immunoelection microscopic location.Eur J Cell Biol,1990,52:147～156.
5 Arrigo AP.The monovalent ionophore moneron maintains the nuclear localization of the human stress proteins HSP28 during heat shock recovery.J Cell Science,1990,96:419～427.
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6 Lee YJ,Lindali C,Peter MC.Heat-induced preferential synthesis and redistribution of HSP70 and HSP28 families in Chinese hamster ovary cells.Biochem Biophy Res Comm,1990,172:119～126.
7 Craig EA,Gross CA.Is HSP70 the cellular thermometer?Trends Biochem Sci,1991,16:135～140.
8 Lindgust S,Craig IA.The heat shock proteins.Annu Rev Genet,1988,22:631～677.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药
单位：
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志980203 【摘要】 目的 探讨热应激过程中热应激蛋白(HSP)的合成动力学、组织细胞分布及其功能。方法 通过体内外实验，采用Western blot、免疫组化和Northern dot blot等方法。结果 小鼠巨噬细胞和人淋巴细胞受热后均见以70 kD的HSP合成最多，且与受热强度有关。随着HSP的增多，细胞存活率明显升高，受损伤程度减轻。热应激时受试动物HSP70表达累积量主要在心、肝组织中，且主要位于胞核内，恢复期移出至胞浆。结论 HSP70合成水平与分布对热应激后组织细胞保护作用有关。
Study on the role of HSPs in heat acclimatization and thermotolerance He Hanzhen,Wu Tangchun,Pan Qiuping，et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030
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Abstract The distribution and functions of heat stress proteins (HSPs) in the tissue and cell during heat stress in vivo and in vitro were studied by using HSP70 Western blot,immuno-histochemistry,HSP70cDNA probe and Northern dot blot technique.The results showed:the content of HSP70 synthesis was the most one among the HSPs in mouse macrophages and human lymphocytes which was related to the intensity of heat treatment.Along with the increase of HSP,cellular survival rate obviously rose and heat injury was reduced.The accumulation of HSP70 varied in different organs among which its content in heart and liver was the highest and mainly located in nucleus during heat stress and then transfered to cytoplasmic matrix during recovery.These results suggest that HSP70 may play a critical role in the protection of stressed cells.
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Key words Heat stress Heat stress protein Heat acclimatization Thermotolerance
从细菌到人类，受热应激后均可发生热应激反应(heat stress response)，此反应的特点是选择性合成一组多肽——热应激蛋白(heat stress proteins,HSPs)，它是一种保护机体的蛋白，故称之为“看家蛋白”[1]。众所周知，人对热可产生适应，热适应后可缓解其热引起的生理紧张，提高耐热能力，但热适应又是有一定限度的，超过限度后可出现热损伤，故在研究热引起机体生理、生化反应的基础上，应进一步探索热应激过程中热应激蛋白的作用。
材料与方法
1.HSPs合成动力学和功能：(1)将体外培养稳定生长的小鼠腹腔巨噬细胞分为热应激组(43℃20分钟)与对照组。用3H-亮氨酸(1.85×105 Bq/ml)掺入试验，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳，凝胶切段，液闪计数法测定3H-亮氨酸掺入量(CPM)。(2)取健康献血人员外周血淋巴细胞分别于39℃、41℃、43℃、45℃受热1小时和经3次39℃30分钟(间隔3小时)预热，再于41℃下受热1小时(共分5组)，收集细胞(1×107细胞/毫升)。分别于受热后1、3、6和16小时加入3H-亮氨酸(1.85×105 Bq/ml)进行1小时细胞渗入实验，随后收集细胞依(1)的方法进行检测。另用0.1%结晶紫染色细胞后立即镜检，计数细胞存活率。同时收集细胞在透射电镜下观察细胞形态。
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2.HSP70在组织细胞中的分布：(1)雄性青紫兰健康家兔21只(体重2.7±0.34 kg)，随机分为3组：①非热耐受组:置于人工气候室受热41±2℃，使肛温上升2.2±0.2℃后转入常温6小时，于受热前后及常温6小时后耳中央静脉采血分离淋巴细胞，空气栓塞处死，立即取心、肝、脾、肾和骨骼肌(左右肢大腿内侧)组织进行HSP70分析。②热耐受组:41±2℃连续受热，每次肛温上升1.6±0.5℃，40天后同①组方法处理动物和收集样品。③对照组:17±5℃动物房饲养40天后同①组方法取样，按1.(1)的方法进行检测。(2)取培养的人体乳腺癌细胞2R75分为6组：①37℃30分钟;②43℃30分钟;③44℃30分钟;④45℃30分钟;⑤43℃30分钟后移入37℃恢复3小时;⑥43℃30分钟后移入37℃30分钟。每组处理后收集细胞胞浆和胞核，采用Western blot和免疫组织化学方法检测HSP70。
3.高温环境下大鼠HSP70mRNA表达水平：Wistar雄性健康大鼠18只,体重150±10 g，分别受热42±0.5℃：①5分钟;②15分钟;③30分钟;④45分钟;⑤60分钟;⑥75分钟;⑦120分钟。测量肛温，并取50 mg肝脏，采用HSP70cDNA探针，以Northern dot blot技术，显影结果用图像分析仪(CS-930扫描仪，波长460 nm)定量(积分面积)。
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结 果
1.HSPs合成动力学和功能：用同位素标记掺入试验发现(图1)，与对照组比，热应激组凝胶3、4段出现明显高峰，以50～70 kD蛋白质成分增加，特别以70 kD增加更明显。
图1 3H-亮氨酸掺入巨噬细胞合成在各段凝胶的分布
Fig 1 Distribution of 3H-leucine incorporation into the synthesis of macrophage in different part of gel
人淋巴细胞在不同温度下受热1小时，分子量分别110、90、73、71、68、54、46和22 kD的蛋白合成增加，尤其是70 kD家族(含73.71和68 kD)明显增加。不同温度下合成动力学见图2，其中以41℃条件下HSP70合成量最多且稳定，39℃预热可增强HSP70合成反应。
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细胞存活率见图3。预热组细胞受热1小时内，细胞存活率下降较快，随后趋于稳定，未经预热组细胞存活率持续下降，明显低于预热组。透射电镜发现预热处理的淋巴细胞，细胞浆内仅出现少量空泡，粗面内质网部分脱颗粒；而非预热组细胞出现明显的胞浆空泡，内质网高度肿胀，脱颗粒，线粒体内嵴减少和消失，核周围间隔增宽。
图2 HSP70合成动力学
*经39℃预热处理后，细胞再于41℃条件下受热
Fig 2 The synthesis kineties of HSP70
*After pretreated at 39℃,then exposed to 41℃
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图3 不同温度下人淋巴细胞存活曲线
*本实验结果皆以37℃培养下淋巴细胞存活率为100%作对照，重复4次而获得；△经39℃预热处理后，细胞再于42℃条件下受热
Fig 3 The survival curve of human lymphocytes at different temperature
*The lymphocytes survival rates are expressed as % of control.The data are the means of 4 experiments.△ After pretreated at 39℃,then exposed to 41℃
2.HSPs在各组织细胞中的分布：处于不同状态家兔各组织中HSPs均有合成，但不同脏器存在着一定差异，其中仍以70 kD家族为主，且多存在于心脏和肝脏中，而脾肾和骨骼肌中主要是低分子量(40 kD以下)的多肽。培养的ZR75细胞株在未热应激前，HSP70主要位于胞浆，无论是43℃还是45℃受热30分钟后，均使它们迅速地向核内转移，同时HSP70的含量增加，且依温度升高而递增，在热应激后恢复期第3小时，又回到胞浆(图4)。
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图4 不同热处理期间HSP70在细胞内重新分布的定量分析
1：对照(37℃)； 2：43℃ 30 min； 3：44℃ 30 min； 4：45℃ 30 min； 5：43℃ 30 min+37℃恢复3 h； 6：43℃ 30 min+37℃恢复2.5 h+45℃ 30 min
Fig 4 The quantitative analysis of HSP70 re-distribution in cytoplasma treated with different temperature
1：Control(37℃)； 2：43℃ 30 min； 3：44℃ 30 min； 4：45℃ 30 min； 5：43℃ 30 min+37℃ recovery for 3 h； 6：43℃ 30 min+37℃ recovery 2.5 h+45℃ 30 min
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3.高温环境下大鼠HSP70mRNA表达的情况见图5。
图5 热应激对小鼠肛温和肝脏HSP70mRNA、HSP70累积动力学的影响
Fig 5 The effects of heat stress on rectal temperature and accumulated kinetics of HSP70mRNA and HSP70 in liver of mice
图5可见:热应激后动物平均肛温均升高，其升高值随受热时间的延长而逐渐增加，于45分钟时达最高值(3.3℃)，反映体内严重蓄热。肝脏HSP70mRNA含量亦于受热45分钟后开始增加，60分钟时明显增加。后体温逐渐恢复(仍平均升高1.5℃以上)，但HSP70mRNA迅速增加，其变化与体内蓄热相关。肝脏HSP70亦随受热时间延长而呈升高趋势。
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讨 论
热应激后，动物肛温随受热时间延长而升高，各组组织细胞受不同热作用后均有新的蛋白质合成，其中以70 kD家族的HSP合成最多，其合成量与受热程度和时间有关。随着HSP的增多，细胞存活率增高、受损轻，特别是热适应后细胞损伤更轻，显示出HSP70对细胞的保护作用[2]。我们曾发现预热组细胞内K+、Na+和Ca2+浓度变化较非预热组小，而非预热组细胞膜过氧化脂质含量明显高于预热组[3]。Carbajal[4]亦发现HSP常分布于核周及浆膜周围，并与质膜结合，起到稳定质膜的作用。
用Western blot和免疫组化方法发现HSP70主要位于胞浆，热应激后核内HSP70明显增加，在恢复期间尽管HSP70不断积累，但在胞浆中HSP70增加明显。当再次热应激时，又见核内HSP70明显增加，且出现两个特征：一是严格的热依赖性，二是十分迅速。HSP70的重新分布对热耐受的产生起到了极重要的作用[5]。关于蛋白质进入核内方式，当分子量大于30 kD时可能涉及两个步骤：一是与核孔核蛋白结合，二是可能通过依赖于ATP的过程转运[6]。亦有人认为：在真核生物中有许多种HSP70相关蛋白，它们在应激条件时才诱导合成，由多个拷贝的基因所编码，根据所在的细胞空间不同，其中一类胞浆HSP70应激时存在于细胞核，在应激后的恢复期又回到胞浆[7]。
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热应激时，整体动物为了适应环境，各脏器组织充分发挥自我生理调节作用，致HSP70、HSP70mRNA在各脏器组织中的表达水平各异。在心、肝、脾、肾和骨骼肌中，HSP70主要在心、肝组织中大量表达，且与动物肛温变化一致。可能是因体温升高，诱发热应激基因开放，增加了HSP70cDNA的转录和RNA的稳定性，进而使HSP70合成增加。
这些现象提示HSP70可保护机体免受高温的损害，亦提示既然HSP70在细胞内累积量与所受应激强度有关，当机体出现热损伤——中暑后，HSP70合成如何，Lindquist等[8]曾提出HSP70的合成是“自我控制”(selflimiting)的，故需进一步研究中暑患者HSP70合成动力学，为防暑保健措施提供理论依据。
参 考 文 献
1 Getting MJ,Sambrook J.Protein folding in the cell.Nature,1992,355:33～45.
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2 Barbara JW,Kingston RE,Morimoto RI.Human HSP70 promoter contains at least two distinct regulatory damains.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:629～633.
3 龚小亮，张国高，贺涵贞.高温诱导淋巴细胞多肽合成与热耐受关系的探讨.同济医科大学学报，1990，19(增刊)：8～10.
4 Carbajal ME,Valet JP.Charest PM,et al.Purification of drosophila HSP83 and immunoelection microscopic location.Eur J Cell Biol,1990,52:147～156.
5 Arrigo AP.The monovalent ionophore moneron maintains the nuclear localization of the human stress proteins HSP28 during heat shock recovery.J Cell Science,1990,96:419～427.
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6 Lee YJ,Lindali C,Peter MC.Heat-induced preferential synthesis and redistribution of HSP70 and HSP28 families in Chinese hamster ovary cells.Biochem Biophy Res Comm,1990,172:119～126.
7 Craig EA,Gross CA.Is HSP70 the cellular thermometer?Trends Biochem Sci,1991,16:135～140.
8 Lindgust S,Craig IA.The heat shock proteins.Annu Rev Genet,1988,22:631～677.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药