自由基与铅中毒机制的研究进展
作者：陆新华
单位：200041 上海市化工职业病防治研究所
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志980333刘卓宝 审校
随着检测新技术的发展，自由基理论为铅中毒机制的研究提供了新的思路。归纳起来，铅主要通过抑制抗氧化酶活力，产生过多的自由基而造成组织损伤。
一、铅抑制抗氧化酶系统
实验证实：铅能抑制SOD。Alder[1]采用改良Heikkla法，在以6-羟多巴胺为底物的自氧化系统中测定超氧化物歧化酶(SOD)活力。各组染铅的浓度分别为0.17、0.33、0.67 mg/L。实验结果显示：3种浓度的铅均引起SOD活力显著下降。苏氏等[2]报道：铅染毒后，各剂量组大鼠红细胞SOD活力下降，并呈时间-效应关系。Sugawara等[3]报道：平均血铅浓度为57.1 mg/L的铅作业工人，其红细胞SOD、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力均明显下降；血铅浓度与红细胞GSH含量呈负相关。表明铅中毒可抑制抗氧化酶系统，削弱机体清除氧自由基的能力，使体内自由基积聚。
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二、铅造成氧化应激反应
一般认为:铅主要抑制血红素合成过程中δ-氨基-r-酮戊酸脱水酶(ALAD)和血红素合成酶。ALAD受抑制后，血中δ-氨基酮戊酸(ALA)在体内积聚且随尿排出增加。Monteiro[4]认为：ALA的氧化作用及ALA/氧合血红蛋白电偶自氧化作用(ALA/oxyhemoglobincoupledautoxidation)与自由基相关联，在铅中毒的氧化应激反应和卟啉症之间起着重要作用。所谓“氧化应激”(oxidative stress)是指一系列导致活性氧(如：、H2O2、.OH、′O2、脂过氧基(LOO.))及相关物质产生的细胞内、外状态。Hermes等[5]认为：铅中毒时，过量的ALA是产生氧自由基的根源之一。另外，血红素合成酶受抑制，使原卟啉Ⅳ不能与Fe2+结合，导致红细胞游离原卟啉(FEP)增加，EFP与锌结合为锌卟啉。此卟啉类产物是体内许多物质的光敏剂(photosensitizer)[6]，能引起光敏反应(photosensitization)。即在一定波长的光线照射下，可吸收能量至“激发态”，激发的能量可以传递给邻近的氧分子，使其成单线态氧(′O2)。受到激发的光敏剂本身可以造成其它分子的损伤，这种形式称为Ⅰ型损伤机制；光敏剂使O2激发成′O2，此类为Ⅱ型损伤机制，Ⅱ型损伤产生的′O2可直接诱发脂质过氧化作用，产生更多的自由基。此外，细胞对不溶性铅盐的吞噬过程本身也可诱使“呼吸爆发”，表现为氧消耗增加、磷酸戊糖通路代谢加速和产生、·OH等自由基。1995年Stohs等[7]研究了汞、镍、镉、铅等金属离子的氧化机制，发现它们的毒作用机制均是使GSH和蛋白的巯基耗尽。铅能引起自由基增加是其基本的毒理作用，而活性氧的产生可能包括多种机制。
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三、铅中毒引发脂质过氧化的过程
铅中毒导致体内积聚的·OH是脂质过氧化作用的主要引发剂，其它如LOO.、脂自由基(L.)、脂氧基(RO.)、脂过氧基(ROO.)等都可作为引发剂，在反应过程中，可通过抽取(abstraction)氢引发脂质过氧化作用的链式和链式支链反应(Chain branching reaction)；铅在体内经一系列代谢后与氧反应产生的′O2，可与多不饱和脂肪酸直接形成脂质过氧化物；铅离子粘合到细胞膜上可促进铁依赖型脂质过氧化作用(Iron dependent lipid peroxidation)。而脂质过氧化作用一旦被引发，就可以起一系列的连锁反应：.OH+LH→L·+H2O； L.+O2→LOO.；LOO.+LH→LOOH+L.;由此可见，一个活性氧可能导致大量的过氧化物形成。实验证明：铅接触工人的红细胞脂质过氧化物含量显著升高，其血铅浓度与红细胞膜脂质过氧化物浓度呈正相关[3]。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。
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四、自由基造成的机体损伤
1.对红细胞功能及寿命的影响：血液中红细胞是对脂质过氧化作用最敏感的生物组织之一。铅被吸收后最先与红细胞接触。铅可以抑制胞内抗氧化酶系，产生更多的自由基。另一方面，铅可以通过对富含不饱和脂肪酸的红细胞膜作用造成红细胞的损伤：(1)膜通透性改变：stocks等[8]的实验证实，脂质过氧化作用可破坏红细胞膜结构，使之产生许多小洞，造成红细胞内容物包括血红蛋白溢出。受氧化损伤后，红细胞丢失钾离子，对水的通透性增加，最终发生溶血。Deuticke等[9]的叔丁基氢过氧化物实验也得到相同的结果。(2)膜流动性改变：脂质过氧化作用可明显增加膜磷脂双层硬度，这与脂质过氧化中间产物丙二醛(MDA)有关。有文章报道[10]：由于脂质过氧化作用增强，铅作业工人红细胞MDA含量显著高于正常人群。MDA能使膜的氨基组分发生交联，即使在很低浓度(μmol/L)，仍然能显著降低红细胞膜的流动性[11]。(3)膜抗原性改变：有证据表明，红细胞经过氧化作用后，其表面抗原有改变。Jain[12]发现脂质过氧化可使红细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻，从而增进单核细胞对红细胞的吞噬。磷脂酰丝氨酸异常地暴露于红细胞表面还能促进补体激活，使红细胞破溶。上述过程可能是临床上出现铅性贫血的重要机制之一。
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2.对机体免疫功能的影响：众所周知，正常的免疫应答主要依赖于各种免疫细胞，特别是T细胞亚群之间的相互促进或相互制约，使之既能清除抗原性异物，又不损伤机体自身组织。代表辅助性T细胞的CD4细胞和代表抑制性T细胞的CD8细胞，是免疫调节的中心枢纽。很多实验已证实：铅中毒能影响人体免疫功能，主要是通过对CD3细胞(代表总T淋巴细胞)和CD4细胞的损害，而且细胞免疫损害程度与铅吸收的程度有关。铅对T细胞亚群的损害也可能是引发自由基增多的重要原因之一。有报道，用的酶性生存系统黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶与人外周血单核细胞(PBMNC)共同温育，实验组与对照组相比，玫瑰花结形成数量下降；植物血凝素(PHA)诱导的淋巴细胞转化时间延长。CAT可以保护淋巴细胞免受活性氧自由基的损伤。同时的研究还揭示：活性氧自由基的选择作用与H2O2浓度有关，但对膜表面免疫球蛋白阳性的细胞(SmIg B细胞)却无影响。T细胞对活性氧自由基的敏感性较高，与其GSH和维生素E含量较低及多不饱和脂肪酸含量较高有关。
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3.对神经系统的作用：铅对中枢和外周神经系统皆有影响，但其毒作用机制至今未阐明。随着自由基研究的发展，目前认为：神经系统有丰富的脂质，脂质过氧化损害尤为突出。有实验观察到:染铅后脂质过氧化作用增强，与染铅量呈正相关(r=0.75，P<0.05)；以抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px为标志的神经元抗氧化能力下降，膜上乙酰胆碱脂酶活力明显下降，与染铅量呈负相关(r=-0.83，P<0.05)。据此推断，铅是通过神经细胞的氧化损伤而发挥神经毒作用的[13]。据文献报道：醋酸铅(PbAC)对大鼠脑细胞膜SOD和Na+泵活力有抑制作用并有促进脂质过氧化作用。提示：小剂量PbAC能抑制脑细胞膜Na+泵和SOD活力，使抗氧化能力减弱，导致脑细胞的损伤[14]。故一般认为:铅对神经系统的毒作用与自由基的存在有着密切关系。
4.对遗传物质的作用：铅对遗传物质的损伤表现为致裂作用，自由基可能是该致裂效应的重要媒介。人群监测表明：血铅浓度与外周血细胞染色体损伤有明显关系。有实验证实：当血铅在250 μg/L水平时，染色体有受损的危险；血铅值达350～910 μg/L时，可引起铅接触者外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换率明显增高[15],其类型多为染色单体裂隙、断裂及出现断片。甄氏[16]对大量职业铅接触者外周血淋巴细胞微核形态分析表明：平均微核率及其中大微核、多微核的检出率，均远远高出苯的职业接触者及对照组工人，说明铅对人体染色体的致裂作用非常明显。而DNA在自由基的作用下，可造成多种形式的损伤，如单链的断裂、蛋白的内交联，DNA-蛋白质交联等。许多实验表明：自由基具有一定的致突性，如过氧化钾导致中国仓鼠卵细胞突变，SOD可以抑制这种作用[17]。自由基，特别是活性氧除了能损伤DNA、造成突变的基因表达外，还损伤其它生物分子蛋白质、脂类等。
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参 考 文 献
1 Adler AJ.Lead can effect the metabalish of oxygen free radicals-inhibit superoxide dismutase activity.Trace Elem Med,1993,10:93～96.
2 苏雅，张玉敏，崔金山.铅对大鼠红细胞与SOD影响.卫生毒理学杂志，1994，8：50。
3 Sugawara E,Nakamura K,Miyake T,et al.Lipid peroxidation and concentration of glutethione in erythrocytes from workers exposed to lead.Bri J Ind Med,1991,48:239～243.
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4 Monteiro HP,Bechara EJH,Abldalla DSP.Free radicals involvement in neurological porphyrias and lead poisoning.Mole Cell Bioch,1991,103:73～83.
5 Hermes LM,Pereira B,Bechara EJH.Are free radicals in lead poisoning?anobiotica,1991,21:1085～1090.
6 陈瑗，周玫.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991.26～27.
7 Stohs SJ,Bagchi D.Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions.Free Radical Bio Ind Med,1995,18:321～336.
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8 Stocks J,Dormandy TL.The autoxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide.Br J Haematol,1971,20:95～111.
9 Deuticke B,Heller RB,Haest CW.Progressive oxidative membrane damage in erythrocytes after pulse treatment with t-butylhydroperoxide.Biochem Biophys Acta,1987,899:113～124.
10 陆新华，沈国芳，金惜雯.铅作业工人自由基改变的分析和探讨.放射免疫杂志，1997，10：242～243.
11 景浩，刘世杰.铅中毒贫血机制的研究进展.中华内科杂志，1993，32：840～841.
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12 Jain SK.In externalization of phosphatidyl-serine and phosphatidyle thanolamine in the membrane bilayer and hypercoagulability by the lipid peroxidation of erythrocytes in rats.J Clin Invest,1985,76~281.
13 陆巍.铅的神经毒作用机制.国外医学卫生学分册，1995，22：341～343.
14 王桂芝，刘双年，候玉春，等.铅对大鼠脑细胞脂质过氧化及超氧物歧化酶活性的影响.卫生毒理学杂志，1995,9:175.
15 WHO.EnvironmentalHealth Criteria 3. Lead.Geneva:WHO,1977.12.
16 甄秋婵，郑清兰，庄碧嘉，等.外周血淋巴细胞微核形态与铅、苯的遗传效应关系.中华劳动卫生职业病杂志，1990，8：284～285.
17 陈瑗，周玫.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991，258～290.
(收稿：1996-12-03 修回：1997-06-16), http://www.100md.com
单位：200041 上海市化工职业病防治研究所
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志980333刘卓宝 审校
随着检测新技术的发展，自由基理论为铅中毒机制的研究提供了新的思路。归纳起来，铅主要通过抑制抗氧化酶活力，产生过多的自由基而造成组织损伤。
一、铅抑制抗氧化酶系统
实验证实：铅能抑制SOD。Alder[1]采用改良Heikkla法，在以6-羟多巴胺为底物的自氧化系统中测定超氧化物歧化酶(SOD)活力。各组染铅的浓度分别为0.17、0.33、0.67 mg/L。实验结果显示：3种浓度的铅均引起SOD活力显著下降。苏氏等[2]报道：铅染毒后，各剂量组大鼠红细胞SOD活力下降，并呈时间-效应关系。Sugawara等[3]报道：平均血铅浓度为57.1 mg/L的铅作业工人，其红细胞SOD、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力均明显下降；血铅浓度与红细胞GSH含量呈负相关。表明铅中毒可抑制抗氧化酶系统，削弱机体清除氧自由基的能力，使体内自由基积聚。
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二、铅造成氧化应激反应
一般认为:铅主要抑制血红素合成过程中δ-氨基-r-酮戊酸脱水酶(ALAD)和血红素合成酶。ALAD受抑制后，血中δ-氨基酮戊酸(ALA)在体内积聚且随尿排出增加。Monteiro[4]认为：ALA的氧化作用及ALA/氧合血红蛋白电偶自氧化作用(ALA/oxyhemoglobincoupledautoxidation)与自由基相关联，在铅中毒的氧化应激反应和卟啉症之间起着重要作用。所谓“氧化应激”(oxidative stress)是指一系列导致活性氧(如：
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三、铅中毒引发脂质过氧化的过程
铅中毒导致体内积聚的·OH是脂质过氧化作用的主要引发剂，其它如LOO.、脂自由基(L.)、脂氧基(RO.)、脂过氧基(ROO.)等都可作为引发剂，在反应过程中，可通过抽取(abstraction)氢引发脂质过氧化作用的链式和链式支链反应(Chain branching reaction)；铅在体内经一系列代谢后与氧反应产生的′O2，可与多不饱和脂肪酸直接形成脂质过氧化物；铅离子粘合到细胞膜上可促进铁依赖型脂质过氧化作用(Iron dependent lipid peroxidation)。而脂质过氧化作用一旦被引发，就可以起一系列的连锁反应：.OH+LH→L·+H2O； L.+O2→LOO.；LOO.+LH→LOOH+L.;由此可见，一个活性氧可能导致大量的过氧化物形成。实验证明：铅接触工人的红细胞脂质过氧化物含量显著升高，其血铅浓度与红细胞膜脂质过氧化物浓度呈正相关[3]。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。
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四、自由基造成的机体损伤
1.对红细胞功能及寿命的影响：血液中红细胞是对脂质过氧化作用最敏感的生物组织之一。铅被吸收后最先与红细胞接触。铅可以抑制胞内抗氧化酶系，产生更多的自由基。另一方面，铅可以通过对富含不饱和脂肪酸的红细胞膜作用造成红细胞的损伤：(1)膜通透性改变：stocks等[8]的实验证实，脂质过氧化作用可破坏红细胞膜结构，使之产生许多小洞，造成红细胞内容物包括血红蛋白溢出。受氧化损伤后，红细胞丢失钾离子，对水的通透性增加，最终发生溶血。Deuticke等[9]的叔丁基氢过氧化物实验也得到相同的结果。(2)膜流动性改变：脂质过氧化作用可明显增加膜磷脂双层硬度，这与脂质过氧化中间产物丙二醛(MDA)有关。有文章报道[10]：由于脂质过氧化作用增强，铅作业工人红细胞MDA含量显著高于正常人群。MDA能使膜的氨基组分发生交联，即使在很低浓度(μmol/L)，仍然能显著降低红细胞膜的流动性[11]。(3)膜抗原性改变：有证据表明，红细胞经过氧化作用后，其表面抗原有改变。Jain[12]发现脂质过氧化可使红细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻，从而增进单核细胞对红细胞的吞噬。磷脂酰丝氨酸异常地暴露于红细胞表面还能促进补体激活，使红细胞破溶。上述过程可能是临床上出现铅性贫血的重要机制之一。
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2.对机体免疫功能的影响：众所周知，正常的免疫应答主要依赖于各种免疫细胞，特别是T细胞亚群之间的相互促进或相互制约，使之既能清除抗原性异物，又不损伤机体自身组织。代表辅助性T细胞的CD4细胞和代表抑制性T细胞的CD8细胞，是免疫调节的中心枢纽。很多实验已证实：铅中毒能影响人体免疫功能，主要是通过对CD3细胞(代表总T淋巴细胞)和CD4细胞的损害，而且细胞免疫损害程度与铅吸收的程度有关。铅对T细胞亚群的损害也可能是引发自由基增多的重要原因之一。有报道，用
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3.对神经系统的作用：铅对中枢和外周神经系统皆有影响，但其毒作用机制至今未阐明。随着自由基研究的发展，目前认为：神经系统有丰富的脂质，脂质过氧化损害尤为突出。有实验观察到:染铅后脂质过氧化作用增强，与染铅量呈正相关(r=0.75，P<0.05)；以抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px为标志的神经元抗氧化能力下降，膜上乙酰胆碱脂酶活力明显下降，与染铅量呈负相关(r=-0.83，P<0.05)。据此推断，铅是通过神经细胞的氧化损伤而发挥神经毒作用的[13]。据文献报道：醋酸铅(PbAC)对大鼠脑细胞膜SOD和Na+泵活力有抑制作用并有促进脂质过氧化作用。提示：小剂量PbAC能抑制脑细胞膜Na+泵和SOD活力，使抗氧化能力减弱，导致脑细胞的损伤[14]。故一般认为:铅对神经系统的毒作用与自由基的存在有着密切关系。
4.对遗传物质的作用：铅对遗传物质的损伤表现为致裂作用，自由基可能是该致裂效应的重要媒介。人群监测表明：血铅浓度与外周血细胞染色体损伤有明显关系。有实验证实：当血铅在250 μg/L水平时，染色体有受损的危险；血铅值达350～910 μg/L时，可引起铅接触者外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换率明显增高[15],其类型多为染色单体裂隙、断裂及出现断片。甄氏[16]对大量职业铅接触者外周血淋巴细胞微核形态分析表明：平均微核率及其中大微核、多微核的检出率，均远远高出苯的职业接触者及对照组工人，说明铅对人体染色体的致裂作用非常明显。而DNA在自由基的作用下，可造成多种形式的损伤，如单链的断裂、蛋白的内交联，DNA-蛋白质交联等。许多实验表明：自由基具有一定的致突性，如过氧化钾导致中国仓鼠卵细胞突变，SOD可以抑制这种作用[17]。自由基，特别是活性氧除了能损伤DNA、造成突变的基因表达外，还损伤其它生物分子蛋白质、脂类等。
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参 考 文 献
1 Adler AJ.Lead can effect the metabalish of oxygen free radicals-inhibit superoxide dismutase activity.Trace Elem Med,1993,10:93～96.
2 苏雅，张玉敏，崔金山.铅对大鼠红细胞与SOD影响.卫生毒理学杂志，1994，8：50。
3 Sugawara E,Nakamura K,Miyake T,et al.Lipid peroxidation and concentration of glutethione in erythrocytes from workers exposed to lead.Bri J Ind Med,1991,48:239～243.
, 百拇医药
4 Monteiro HP,Bechara EJH,Abldalla DSP.Free radicals involvement in neurological porphyrias and lead poisoning.Mole Cell Bioch,1991,103:73～83.
5 Hermes LM,Pereira B,Bechara EJH.Are free radicals in lead poisoning?anobiotica,1991,21:1085～1090.
6 陈瑗，周玫.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991.26～27.
7 Stohs SJ,Bagchi D.Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions.Free Radical Bio Ind Med,1995,18:321～336.
, 百拇医药
8 Stocks J,Dormandy TL.The autoxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide.Br J Haematol,1971,20:95～111.
9 Deuticke B,Heller RB,Haest CW.Progressive oxidative membrane damage in erythrocytes after pulse treatment with t-butylhydroperoxide.Biochem Biophys Acta,1987,899:113～124.
10 陆新华，沈国芳，金惜雯.铅作业工人自由基改变的分析和探讨.放射免疫杂志，1997，10：242～243.
11 景浩，刘世杰.铅中毒贫血机制的研究进展.中华内科杂志，1993，32：840～841.
, 百拇医药
12 Jain SK.In externalization of phosphatidyl-serine and phosphatidyle thanolamine in the membrane bilayer and hypercoagulability by the lipid peroxidation of erythrocytes in rats.J Clin Invest,1985,76~281.
13 陆巍.铅的神经毒作用机制.国外医学卫生学分册，1995，22：341～343.
14 王桂芝，刘双年，候玉春，等.铅对大鼠脑细胞脂质过氧化及超氧物歧化酶活性的影响.卫生毒理学杂志，1995,9:175.
15 WHO.EnvironmentalHealth Criteria 3. Lead.Geneva:WHO,1977.12.
16 甄秋婵，郑清兰，庄碧嘉，等.外周血淋巴细胞微核形态与铅、苯的遗传效应关系.中华劳动卫生职业病杂志，1990，8：284～285.
17 陈瑗，周玫.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991，258～290.
(收稿：1996-12-03 修回：1997-06-16), http://www.100md.com
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