听力对噪声的易感性与线粒体DNA7.4kb缺失的初步观察
作者：赵一鸣 张颖 张贵成 杨群勇
单位：赵一鸣 北京医科大学第三医院 100083；张颖 中国科学研究院微生物所；张贵成 杨群勇 河南省新乡市职业病防治研究所
关键词：噪声；个体易感性；线粒体DNA缺失
听力对噪声的易感性与线粒体DNA7 【摘要】 目的 探索线粒体基因突变与个体听力对噪声易感性差异的关系。方法 采用PCR扩增技术检测线粒体DNA(mtDNA)7.4 kb的缺失。结果 在21名听力易感工人和20名非易感工人的mtDNA缺失常发区8637～16073之间共检测到4种不同的缺失，对应缺失长度在3.1～7.4 kb之间。易感组7.4 kb缺失率(10/21)明显高于对照组(3/20)，OR=5，P<0.05。结论 mtDNA 7.4 kb缺失可能是导致听力对噪声易感性的危险因素之一。
Observation on susceptibility of hearing to noise exposure and mitochondrial DNA 7.4kb deletion
, 百拇医药
Zhao Yiming*,Zhang Ying,Zhang Guicheng,et al.*
The Third Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100083
【Abstract】 Objective To explore the relation between susceptibility of hearing to noise exposure and mitochondrial DNA (mtDNA) deletion. Methods The DNA was collected from white blood cells of 41 workers.Twenty one of them were susceptible to noise exposure and the other twenty were not susceptible.An advanced PCR technique was applied to observe the 7.4 kb mtDNA deletion. Results Four kinds of deletion were found from 3.1 kb to 7.4 kb in these workers.The 7.4 kb deletion rate in susceptible group(10/21) was significantly higher than that in control group (3/20),OR=5,P<0.05. Conclusion The 7.4 kb mtDNA deletion is one of the possible risk factors for individual susceptibility of hearing to noise exposure.
, 百拇医药
【Key words】 Noise Individual susceptibility mtDNA deletion
人们在长期实践中已经发现个体听力对噪声暴露的易感性有明显差异，但造成这种差异的原因——遗传因素与噪声性听力损伤的关系尚无系统的研究。根据已有的证据和噪声致聋的理论，我们提出线粒体基因突变可能是决定个体听力对噪声易感性差异物质基础之一的设想，并观察了听力对噪声暴露的易感性与线粒体DNA(mtDNA)7.4 kb缺失的关系。
对象与方法
根据以往体检和噪声暴露资料，在北京和新乡的500余名纺织、机械行业噪声作业工龄1年以上的工人中初步筛选出听力对噪声暴露可能易感和不易感的工人100余人。再次测定其听力(用NTB-40听力计按GB7583-1987测定工人脱离噪声作业16小时后左、右耳125 Hz～8 kHz纯音气导听阈)，进行问卷调查(收集个人资料、职业史、既往个人和父母病史等)和现场噪声测定[用ND-2和HS 5670声级计在现场工人工作位测定噪声的声压级(SPL)，并按等能量原理计算每个工人的累积噪声暴露量(CNE)[1]]。根据这些结果，用自行编制的软件(模型见文献[2])确定每个工人听力对噪声暴露的个体易感性，从中筛选出易感者22人(易感组)、不易感者22人(对照组)作为研究对象(3例标本未能扩增出mtDNA的保守区，删除后实际观察易感组21人、对照组20人)。观察对象工作期间均未使用耳塞或耳罩。易感组21人，其中男7人、女14人，年龄(32.2±4.5)岁，噪声作业工龄(12.0±4.9)年，SPL(91.2±8.2)dB(A)，CNE(100.0±9.9)dB(A)；对照组20人，其中男5人、女15人，年龄(34.0±10.5)岁，噪声作业工龄(10.6±8.8)年，SPL(93.3±6.0)dB(A)，CNE(101.3±8.2)dB(A)，两组间差异无显著性(P>0.05)。取每位研究对象的静脉血6 ml，EDTA-Na2抗凝，-20 ℃冻存。在实验室用常规酚-氯仿法[3]提取白细胞DNA。
, http://www.100md.com
自行设计扩增线粒体DNA保守区片段的PCR引物P1/P2，用于检测线粒体DNA的总含量。引物P3/P4参照文献[4]，位于缺失常发区8637～16073两侧，用于扩增发生缺失后的线粒体DNA片段。P1～P4由中国科学研究院微生物所合成[P1(3108～3127，5’primer)TTC AAA TTC CTC CCT GTA CG，P2(3731～3712，3’primer)TGA GAT TGT TTG GGC TAC TG，P3(8150～8166，5’primer)CCG GGG GTA TAC TAC GG，P4(16159～16142，3’primer)GAA CTG GTG GAC ATC ATG]。PCR反应体系含15 mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μl，5'和3'端引物(12.5 μmol/L)各1 μl，Taq酶1 U，去离子水15 μl，DNA模板(50 ng/μl)3 μl，总反应体系25 μl。用Omn-E DNA热循环仪，94 ℃预变性3分钟，然后94 ℃变性50秒，51 ℃(54 ℃)退火60秒，72 ℃延伸60秒扩增35个循环，最后72 ℃延伸10分钟。扩增产物经体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后经紫外透射仪观察，并做紫外照相记录。
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将结果输入IBM微机，经逻辑检错及自检无误后用SPSS PC+V3.0软件包计算两组的
、s，计量资料做t检验；计算例数、OR值，计数资料做χ2检验。
结 果
图1显示：易感组工人左、右耳平均听阈在高频段(3～8 kHz)明显升高，6 kHz处达峰值，呈典型的噪声听力损伤改变；除右耳125 Hz听阈均值在两组间尚未达到显著性界值外，其余各频段易感组的听阈均明显高于对照组，P<0.05或P<0.01。易感组语频段平均听阈高于20 dB，已接近轻度损伤水平，而对照组在10 dB左右。两组工人在年龄、性别和噪声暴露相似的条件下听阈水平存在明显差异，表明本研究收集的观察对象符合研究设计的要求。
, 百拇医药
SL:易感组左耳；SR:易感组右耳；
CL:对照组左耳；CR:对照组右耳
SL：left ear of susceptible group respectively;SR：right ear of susceptible group respectively;CL：left ear of control group respectively;CR：right ear of control group respectively
图1 听力对噪声暴露易感组与对照组工人
平均听阈水平的比较
Fig 1 Comparison of hearing thresholds between susceptible
, http://www.100md.com
group and control group
以P1/P2为引物扩增3108～3730位非缺失区片段作为总mtDNA的标准(图2)。41例(易感组21例、对照组20例)样本扩增出明亮条带，长度为622 bp，表明其中含有mtDNA，故将这41例定为研究对象。
MK2:PBR322 DNA/Mspl Markers
1～3:对照组；4～6:易感组
1～3：control workers；4～6：susceptile workers
图2 总mtDNA PCR扩增结果
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Fig 2 PCR product of total mitochondrial DNA
图3为mtDNA缺失突变检测结果，以相距8 kb的P3/P4为引物在多数易感者和少数不易感者中扩增出4种长度不同的DNA片段：4.90 kb、1.37 kb、831 bp和594 bp，由此计算出该区间存在4种线粒体DNA缺失的片段：3.10 kb、7.63 kb、7.17 kb和7.41 kb。以扩增出594 bp片段为判定标准，易感组7.4 kb缺失的比例(10/21)明显高于对照组(3/20)，OR=5，χ2=4.91，P<0.05。提示mtDNA7.4 kb缺失将增加噪声性耳聋发病的危险性。
MK1:λDNA/HindⅢ+EcoRI Markers;
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MK2:PBR322 DNA/Mspl Markers
图3 7.4 kb mtDNA缺失检测结果
Fig 3 Detecting result of deletion of 7.4 kb mtDNA
讨 论
从理论上讲，个体易感性差异的物质基础最终可以归结为不同个体的DNA结构存在差异，但寻找这种差异目前在技术上仍存在许多困难。1995年Hyde等[5]报道用氯霉素阻断鸡线粒体蛋白合成后使其接触120 dB强纯音(120 Hz)14小时，内耳毛细胞出现明显损伤；而单纯氯霉素处理组和单纯声暴露组内耳毛细胞的损伤都非常轻微。这一现象表明：线粒体蛋白合成与毛细胞对噪声损伤的反应有关。线粒体的功能是氧化-磷酸化，为细胞维持生存和发挥正常功能提供能量。阻断线粒体蛋白合成暂时不会影响细胞维持低负荷时的能量需求，但不能为细胞提供更多的能量。因此，当内耳毛细胞暴露于强噪声时线粒体不能提供足够的能量，从而导致毛细胞损伤甚至死亡。已知强噪声暴露后耳蜗外淋巴氧分压明显降低，表明强噪声暴露增加了内耳的能量负荷，使氧供应相对不足；而氧吸入可以明显改善噪声引起的听阈下降，即增加氧(氧化-磷酸化底物)的供应可以改善毛细胞的功能状态[6]。这些实事都说明能量代谢学说在噪声性耳聋的发病中占据重要的地位。已知mtDNA是人体细胞内唯一的核外遗传物质，其碱基长度为16 659 bp，编码了2个tRNAs、22个rRNAs和13条与氧化-磷酸化有关的多肽链[2]。mtDNA如果发生突变，将直接改变氧化-磷酸化系统中某些酶的结构并影响其功能。已知mtDNA突变与多种疾病有关，其中缺失突变多与衰老和退行性疾病有关。由于噪声性耳聋也与衰老和退行性改变有关，观察已知的mtDNA缺失突变就成为寻找噪声性耳聋相关基因较为合理的突破口。
, 百拇医药
本研究在噪声作业工人中筛查出听力对噪声暴露非常敏感的工人作为易感组，非常不敏感的工人作为对照组，观察到两组工人mtDNA 7.4 kb缺失发生频率存在明显差异，初步证实了mtDNA缺失与噪声聋有关的假说。本研究采用病例-对照的研究方法具有较好的可行性，研究直接以工人为观察对象，不存在动物试验外推的缺陷。在人群中研究噪声聋的发病机制最困难的问题是难以得到人的内耳组织。已知人体不同组织的体细胞中DNA是相同的，用白细胞的DNA可以反映内耳组织DNA的情况，因而用白细胞的DNA进行本研究是合理的。
本研究易感组有11例未检测到7.4 kb缺失，而对照组有3例存在7.4 kb缺失，提示个体易感性除与mtDNA 7.4 kb缺失有关外，还可能与其它因素相关。由于mtDNA与核DNA(nDNA)共同编码了氧化-磷酸化系统的5种酶复合物，而mtDNA的复制、转录和翻译过程中所需的几十种酶均由nDNA编码[7]，所以线粒体在遗传上的自主性在一定程度上受到核基因的制约，编码这些酶的nDNA突变也可产生类似于线粒体疾病的症状。因此，以能量代谢学说为基础研究噪声聋发病机制时不但要考虑mtDNA的突变，还应考虑nDNA的影响。另外，噪声聋的致病还可能存在其它机制，如血管学说等。在今后的研究中，这些问题都值得注意和考虑。
, http://www.100md.com
本课题受国家自然科学基金资助(基金号：39870696)
参考文献
1 Bandy B,Davison AJ.Mitochondrial mutations may increase oxidative stress:implications for carcinogenesis and aging Free Radic Biol Med,1990，8:523-539.
2 Anderson S,Bankler AT，Barrell BG，et al.Sequence and organization of the human mitochondrial genome.Nature,1981，290:457-465.
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.19-21.
, http://www.100md.com
4 Corral-Debrinski M,Stepien G,Shoffner JM,et al.Hypoxemia is associations with mitochondrial DNA damage and gene induction implications for cardiac disease.J Am Med Assoc,1991，266:1812-1816.
5 Hyde GE,Rubel EW.Mitochondrial role in hair cell survival after injury.Otolaryhyol Head Neck Surg,1995，113:530-540.
6 杨志华，尹嘉才.噪声和吸氧对耳蜗外淋巴氧张力的影响.中华劳动卫生职业病杂志，1995，13：198-199.
7 Wallece DC,Lott MT,Torroni A,et al.Report of the committee on human mitochondrial DNA.Cytogenet Cell Genet,1991，58:1103-1123.
(收稿：1998-09-04 修回：1999-05-07), http://www.100md.com
单位：赵一鸣 北京医科大学第三医院 100083；张颖 中国科学研究院微生物所；张贵成 杨群勇 河南省新乡市职业病防治研究所
关键词：噪声；个体易感性；线粒体DNA缺失
听力对噪声的易感性与线粒体DNA7 【摘要】 目的 探索线粒体基因突变与个体听力对噪声易感性差异的关系。方法 采用PCR扩增技术检测线粒体DNA(mtDNA)7.4 kb的缺失。结果 在21名听力易感工人和20名非易感工人的mtDNA缺失常发区8637～16073之间共检测到4种不同的缺失，对应缺失长度在3.1～7.4 kb之间。易感组7.4 kb缺失率(10/21)明显高于对照组(3/20)，OR=5，P<0.05。结论 mtDNA 7.4 kb缺失可能是导致听力对噪声易感性的危险因素之一。
Observation on susceptibility of hearing to noise exposure and mitochondrial DNA 7.4kb deletion
, 百拇医药
Zhao Yiming*,Zhang Ying,Zhang Guicheng,et al.*
The Third Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100083
【Abstract】 Objective To explore the relation between susceptibility of hearing to noise exposure and mitochondrial DNA (mtDNA) deletion. Methods The DNA was collected from white blood cells of 41 workers.Twenty one of them were susceptible to noise exposure and the other twenty were not susceptible.An advanced PCR technique was applied to observe the 7.4 kb mtDNA deletion. Results Four kinds of deletion were found from 3.1 kb to 7.4 kb in these workers.The 7.4 kb deletion rate in susceptible group(10/21) was significantly higher than that in control group (3/20),OR=5,P<0.05. Conclusion The 7.4 kb mtDNA deletion is one of the possible risk factors for individual susceptibility of hearing to noise exposure.
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【Key words】 Noise Individual susceptibility mtDNA deletion
人们在长期实践中已经发现个体听力对噪声暴露的易感性有明显差异，但造成这种差异的原因——遗传因素与噪声性听力损伤的关系尚无系统的研究。根据已有的证据和噪声致聋的理论，我们提出线粒体基因突变可能是决定个体听力对噪声易感性差异物质基础之一的设想，并观察了听力对噪声暴露的易感性与线粒体DNA(mtDNA)7.4 kb缺失的关系。
对象与方法
根据以往体检和噪声暴露资料，在北京和新乡的500余名纺织、机械行业噪声作业工龄1年以上的工人中初步筛选出听力对噪声暴露可能易感和不易感的工人100余人。再次测定其听力(用NTB-40听力计按GB7583-1987测定工人脱离噪声作业16小时后左、右耳125 Hz～8 kHz纯音气导听阈)，进行问卷调查(收集个人资料、职业史、既往个人和父母病史等)和现场噪声测定[用ND-2和HS 5670声级计在现场工人工作位测定噪声的声压级(SPL)，并按等能量原理计算每个工人的累积噪声暴露量(CNE)[1]]。根据这些结果，用自行编制的软件(模型见文献[2])确定每个工人听力对噪声暴露的个体易感性，从中筛选出易感者22人(易感组)、不易感者22人(对照组)作为研究对象(3例标本未能扩增出mtDNA的保守区，删除后实际观察易感组21人、对照组20人)。观察对象工作期间均未使用耳塞或耳罩。易感组21人，其中男7人、女14人，年龄(32.2±4.5)岁，噪声作业工龄(12.0±4.9)年，SPL(91.2±8.2)dB(A)，CNE(100.0±9.9)dB(A)；对照组20人，其中男5人、女15人，年龄(34.0±10.5)岁，噪声作业工龄(10.6±8.8)年，SPL(93.3±6.0)dB(A)，CNE(101.3±8.2)dB(A)，两组间差异无显著性(P>0.05)。取每位研究对象的静脉血6 ml，EDTA-Na2抗凝，-20 ℃冻存。在实验室用常规酚-氯仿法[3]提取白细胞DNA。
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自行设计扩增线粒体DNA保守区片段的PCR引物P1/P2，用于检测线粒体DNA的总含量。引物P3/P4参照文献[4]，位于缺失常发区8637～16073两侧，用于扩增发生缺失后的线粒体DNA片段。P1～P4由中国科学研究院微生物所合成[P1(3108～3127，5’primer)TTC AAA TTC CTC CCT GTA CG，P2(3731～3712，3’primer)TGA GAT TGT TTG GGC TAC TG，P3(8150～8166，5’primer)CCG GGG GTA TAC TAC GG，P4(16159～16142，3’primer)GAA CTG GTG GAC ATC ATG]。PCR反应体系含15 mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5 μl，4×dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μl，5'和3'端引物(12.5 μmol/L)各1 μl，Taq酶1 U，去离子水15 μl，DNA模板(50 ng/μl)3 μl，总反应体系25 μl。用Omn-E DNA热循环仪，94 ℃预变性3分钟，然后94 ℃变性50秒，51 ℃(54 ℃)退火60秒，72 ℃延伸60秒扩增35个循环，最后72 ℃延伸10分钟。扩增产物经体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后经紫外透射仪观察，并做紫外照相记录。
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将结果输入IBM微机，经逻辑检错及自检无误后用SPSS PC+V3.0软件包计算两组的
、s，计量资料做t检验；计算例数、OR值，计数资料做χ2检验。结 果
图1显示：易感组工人左、右耳平均听阈在高频段(3～8 kHz)明显升高，6 kHz处达峰值，呈典型的噪声听力损伤改变；除右耳125 Hz听阈均值在两组间尚未达到显著性界值外，其余各频段易感组的听阈均明显高于对照组，P<0.05或P<0.01。易感组语频段平均听阈高于20 dB，已接近轻度损伤水平，而对照组在10 dB左右。两组工人在年龄、性别和噪声暴露相似的条件下听阈水平存在明显差异，表明本研究收集的观察对象符合研究设计的要求。
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SL:易感组左耳；SR:易感组右耳；
CL:对照组左耳；CR:对照组右耳
SL：left ear of susceptible group respectively;SR：right ear of susceptible group respectively;CL：left ear of control group respectively;CR：right ear of control group respectively
图1 听力对噪声暴露易感组与对照组工人
平均听阈水平的比较
Fig 1 Comparison of hearing thresholds between susceptible
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group and control group
以P1/P2为引物扩增3108～3730位非缺失区片段作为总mtDNA的标准(图2)。41例(易感组21例、对照组20例)样本扩增出明亮条带，长度为622 bp，表明其中含有mtDNA，故将这41例定为研究对象。
MK2:PBR322 DNA/Mspl Markers
1～3:对照组；4～6:易感组
1～3：control workers；4～6：susceptile workers
图2 总mtDNA PCR扩增结果
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Fig 2 PCR product of total mitochondrial DNA
图3为mtDNA缺失突变检测结果，以相距8 kb的P3/P4为引物在多数易感者和少数不易感者中扩增出4种长度不同的DNA片段：4.90 kb、1.37 kb、831 bp和594 bp，由此计算出该区间存在4种线粒体DNA缺失的片段：3.10 kb、7.63 kb、7.17 kb和7.41 kb。以扩增出594 bp片段为判定标准，易感组7.4 kb缺失的比例(10/21)明显高于对照组(3/20)，OR=5，χ2=4.91，P<0.05。提示mtDNA7.4 kb缺失将增加噪声性耳聋发病的危险性。
MK1:λDNA/HindⅢ+EcoRI Markers;
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MK2:PBR322 DNA/Mspl Markers
图3 7.4 kb mtDNA缺失检测结果
Fig 3 Detecting result of deletion of 7.4 kb mtDNA
讨 论
从理论上讲，个体易感性差异的物质基础最终可以归结为不同个体的DNA结构存在差异，但寻找这种差异目前在技术上仍存在许多困难。1995年Hyde等[5]报道用氯霉素阻断鸡线粒体蛋白合成后使其接触120 dB强纯音(120 Hz)14小时，内耳毛细胞出现明显损伤；而单纯氯霉素处理组和单纯声暴露组内耳毛细胞的损伤都非常轻微。这一现象表明：线粒体蛋白合成与毛细胞对噪声损伤的反应有关。线粒体的功能是氧化-磷酸化，为细胞维持生存和发挥正常功能提供能量。阻断线粒体蛋白合成暂时不会影响细胞维持低负荷时的能量需求，但不能为细胞提供更多的能量。因此，当内耳毛细胞暴露于强噪声时线粒体不能提供足够的能量，从而导致毛细胞损伤甚至死亡。已知强噪声暴露后耳蜗外淋巴氧分压明显降低，表明强噪声暴露增加了内耳的能量负荷，使氧供应相对不足；而氧吸入可以明显改善噪声引起的听阈下降，即增加氧(氧化-磷酸化底物)的供应可以改善毛细胞的功能状态[6]。这些实事都说明能量代谢学说在噪声性耳聋的发病中占据重要的地位。已知mtDNA是人体细胞内唯一的核外遗传物质，其碱基长度为16 659 bp，编码了2个tRNAs、22个rRNAs和13条与氧化-磷酸化有关的多肽链[2]。mtDNA如果发生突变，将直接改变氧化-磷酸化系统中某些酶的结构并影响其功能。已知mtDNA突变与多种疾病有关，其中缺失突变多与衰老和退行性疾病有关。由于噪声性耳聋也与衰老和退行性改变有关，观察已知的mtDNA缺失突变就成为寻找噪声性耳聋相关基因较为合理的突破口。
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本研究在噪声作业工人中筛查出听力对噪声暴露非常敏感的工人作为易感组，非常不敏感的工人作为对照组，观察到两组工人mtDNA 7.4 kb缺失发生频率存在明显差异，初步证实了mtDNA缺失与噪声聋有关的假说。本研究采用病例-对照的研究方法具有较好的可行性，研究直接以工人为观察对象，不存在动物试验外推的缺陷。在人群中研究噪声聋的发病机制最困难的问题是难以得到人的内耳组织。已知人体不同组织的体细胞中DNA是相同的，用白细胞的DNA可以反映内耳组织DNA的情况，因而用白细胞的DNA进行本研究是合理的。
本研究易感组有11例未检测到7.4 kb缺失，而对照组有3例存在7.4 kb缺失，提示个体易感性除与mtDNA 7.4 kb缺失有关外，还可能与其它因素相关。由于mtDNA与核DNA(nDNA)共同编码了氧化-磷酸化系统的5种酶复合物，而mtDNA的复制、转录和翻译过程中所需的几十种酶均由nDNA编码[7]，所以线粒体在遗传上的自主性在一定程度上受到核基因的制约，编码这些酶的nDNA突变也可产生类似于线粒体疾病的症状。因此，以能量代谢学说为基础研究噪声聋发病机制时不但要考虑mtDNA的突变，还应考虑nDNA的影响。另外，噪声聋的致病还可能存在其它机制，如血管学说等。在今后的研究中，这些问题都值得注意和考虑。
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本课题受国家自然科学基金资助(基金号：39870696)
参考文献
1 Bandy B,Davison AJ.Mitochondrial mutations may increase oxidative stress:implications for carcinogenesis and aging Free Radic Biol Med,1990，8:523-539.
2 Anderson S,Bankler AT，Barrell BG，et al.Sequence and organization of the human mitochondrial genome.Nature,1981，290:457-465.
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.19-21.
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4 Corral-Debrinski M,Stepien G,Shoffner JM,et al.Hypoxemia is associations with mitochondrial DNA damage and gene induction implications for cardiac disease.J Am Med Assoc,1991，266:1812-1816.
5 Hyde GE,Rubel EW.Mitochondrial role in hair cell survival after injury.Otolaryhyol Head Neck Surg,1995，113:530-540.
6 杨志华，尹嘉才.噪声和吸氧对耳蜗外淋巴氧张力的影响.中华劳动卫生职业病杂志，1995，13：198-199.
7 Wallece DC,Lott MT,Torroni A,et al.Report of the committee on human mitochondrial DNA.Cytogenet Cell Genet,1991，58:1103-1123.
(收稿：1998-09-04 修回：1999-05-07), http://www.100md.com