微菌落技术用于细菌培养计数初探
作者：杨国武 叶晓莲 张海煊
单位：杨国武 叶晓莲 张海煊 (广东省深圳市产品质量监督检验所，深圳 518029)
关键词：活菌培养计数；微菌落法；琼脂倾注平板法
中国消毒学杂志980405
提 要 对微菌落方法，以聚碳酸酯微孔滤膜作载体，结合显微计数，用于活菌培养计数。该法于37℃培养3.5～5.0 h检测的结果与常规琼脂倾注平板法培养24～48 h的结果无显著性差异。
PRELIMINARY STUDY ON APPLICATION OF MICROCOLONY
TECHNIQUE TO BACTERIA COUNT
, http://www.100md.com
Yang Guowu Ye Xiaolian Zhang Haixuan
( Shenzhen Municipal Institute for Supervision and Examination of Product
Quality,Guangdong Province, Shenzhen 518029 )
Abstract Using polycarbonate millipore filter membrance instead of acid cellulose
ester membrane to serve as carrier and microscopic counting, the microcolony technique was used for bacteria count.The experiment indicated that the results obtained using this method showed good repetitiveness.The bacterial count of the sample taken from the filter membrane cultured at 37℃ for 3.0～5.0 h was not different significantly from the results of 24～48 h culture at 37℃ using conventional agar pour plate method (by paired data statistical analysis, SD=8.94～89.72, t=1.00～1.25, P>0,20).
, 百拇医药
Key words bacteria count microcolony method agar pour plate method
微菌落(bacterial microcolony)是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的仅可藉显微镜查知的微小菌落。已有利用微菌落技术定性检测细菌的报道〔1～3〕。我们对微菌落培养计数方法作了改进，用聚碳酸酯微孔滤膜代替一般细菌滤膜培养所用酸纤维素酯微孔滤膜作载体，于培养3.5～5.0 h，用显微镜油镜观察计数菌落。现将结果报道于下。
1 方法
1.1 器材的准备
用物镜测微尺(上海第三光学仪器厂产)预先测量出显微镜一个油镜视野的直径。将聚碳酸酯微孔滤膜(孔径< 0.45 μm，直径47 mm)置沸水中煮5 min后，以其光面朝上装于过滤器(美国Millipore公司产，用前先经压力蒸汽灭菌)中。连接真空泵(也可用水射流负压法)，待用于抽滤样液。
, http://www.100md.com
1.2 样本的处理
试验菌为大肠杆菌(8099)与金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)。取含试验菌或自然菌的样液300～500 ml，经滤器抽滤。取出滤膜，剪成4块，以其光面朝上贴于普通营养琼脂平板上。于37℃培养至3.5 h，取出1块滤膜置于玻片上，其余继续培养。待玻片上滤膜干后，膜上再盖一玻片压住，在酒精火焰上往返7次，加热固定菌落。然后，滴加染色液(0.5 g碱性复红经20 ml 95%乙醇溶解，加水稀释至100 ml。静置过夜，经微孔滤膜过滤后备用)染色1 min，用水漂去残留染色液，置油镜下观察。若微菌落形态不典型，再取培养4.0 h滤膜1块染色镜检。若仍不典型，以每隔0.5 h取培养样本观察，直至观察到典型微菌落(图1，图2)时，进行计数。
图1 大肠杆菌微菌落形态 (37℃培养3.5 h，×1 000)
, 百拇医药
Fig1 Morphology of microcolony of Escherichia coli
(37℃ culture for 3.5 h，×1 000)
图2 金黄色葡萄球菌微菌落形态
(37℃培养4 h，×1 000)
Fig2 Morphology of microcolony of Staphy- lococcus aureus
(37℃ culture for 4 h，×1 000)
1.3 菌落计数
, http://www.100md.com
在油镜下观察并计数40个视野的微菌
落数，按下式计算样本中菌落总数：
〔 X为样本菌落总数(cfu/ml)；A为40个视野微菌落总数(cfu)；Φ1为滤膜有效过滤直径(mm)；Φ2为油镜视野直径(mm)；V为滤过的样液量(ml)。〕
2 结果
2.1 可重复性
对含大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的同一份菌悬液，用微菌落培养计数法检测5次，重复性良好(表1)。
表1 微菌落培养计数法检测样本中细菌数的重复结果
, http://www.100md.com
Table1 Repetitive results of bacterial count in the sample examined by microcolony culture counting method 样本号
Sample No.
检测菌落数
No.of colonies detected(cfu/ml)
大肠杆菌
Escherichia coli
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
1
, 百拇医药
251
504
2
245
500
3
251
497
4
250
491
5
240
505
, http://www.100md.com
2.2 与常规琼脂倾注活菌培养计数法比较
制备5份含大肠杆菌悬液，分别用微菌落培养计数法与常规琼脂倾注活菌培养计数法(即取稀释后的菌悬液接种平皿，倾注普通营养琼脂并混匀)检测。所得结果(表2)经配对资料统计学分析，SD=8.94，t=1.00，0.50>P>0.20，两种方法的结果无显著性差异。表2 两种细菌培养计数法检测样本中大肠杆菌数结果的比较
Table2 Comparison of results of count of Escherichia coli Hin the sample examined by two bacteria culture counting methods 样本号
Sample No.
检测菌落数
No.of colonies detected(cfu/ml)
, 百拇医药
微菌落法
Microcolony method
琼脂倾注平板法
Agar pour plate method
1
170
180
2
150
160
3
200
, http://www.100md.com 190
4
250
250
5
110
120
注: 滤膜培养时间为3.5～5.0 h，平板培养时间为24～48 h。
Note: The culture time of filter membrane was 3.5～5.0 h and that of agar plate was 24～48 h.
取5瓶纯净水，分别用两法检测其中细菌总数。两种方法检测的结果(表3)亦无显著性差异(SD=89.72，t=1.25，0.50>P>0.20)。
, 百拇医药
表3 两种细菌培养计数法检测水中细菌总数结果的比较
Table3 Comparison of results of measuring total bacterial count of water by two bacteria culture counting methods 样本号
Sample No.
检测菌落数
No.of colonies detected(cfu/ml)
微菌落法
Microcolony method
琼脂倾注平板法
, 百拇医药
Agar pour plate method
1
0
0
2
120
130
3
1 100
1 300
4
1 000
990
, 百拇医药
5
320
320
注: 滤膜培养时间为3.5～5.0 h，平板培养时间为24～48 h。
Note: The culture time of filter membrane was 3.5～5.0 h and that of agar plate was 24～48 h.
3 讨论
3.1 本方法采用聚碳酸酯微孔滤膜，较酸纤维素酯膜有下列优点：① 聚碳酸酯膜是透明的，不需再作透明处理；② 该膜使用中始终保持透明，酸纤维素酯膜经透明处理后在使用中可变为不透明，影响显微观察；③ 加热固定时，聚碳酸酯膜易与菌体结合，固定效果较好。
, 百拇医药
3.2 本方法中不宜用针头式过滤器，以免液体呈湍流式通过滤膜，造成细菌在膜上分布不均匀。采用Millipore公司产真空负压抽滤装置，可使滤膜各点负压相同，细菌在膜上分布较均匀，使从40个视野所得的微菌落数较准确。
3.3 为保证滤膜上微菌落分布均匀，样液过滤量不宜少于300 ml。但一个视野中观察到的菌落最好不超过5个，否则因菌落拥挤，加以固定不好，易混长在一起，影响计数的准确。为此，当样液中含菌量较多时，应先用无菌生理盐水作适当稀释。
3.4 本法中，一般培养3.5 h即可。经杀菌作用后的样本，应考虑残存受伤菌的复苏时间，培养时间宜略延长。
参考文献
〔1〕 Hadzieva NC, Hadziev ST. Bacterial microcolony - a possible approach for a rapid differentiation of bacteria. J Hyg Epidem Microbiol Immunnol 1997; 31 (2) : 189.
〔2〕 裴晓芳，叶梅君，张朝武，等. 细菌微菌落及其初步应用. 华西医科大学学报 1992; 23 (4) : 403.
〔3〕 叶梅君，裴晓芳，许欣，等. 微菌落免疫技术实验研究. 现代预防医学 1991; 18 (3) : 132.
(1998-05-31收稿 1998-09-05修回), 百拇医药
单位：杨国武 叶晓莲 张海煊 (广东省深圳市产品质量监督检验所，深圳 518029)
关键词：活菌培养计数；微菌落法；琼脂倾注平板法
中国消毒学杂志980405
提 要 对微菌落方法，以聚碳酸酯微孔滤膜作载体，结合显微计数，用于活菌培养计数。该法于37℃培养3.5～5.0 h检测的结果与常规琼脂倾注平板法培养24～48 h的结果无显著性差异。
PRELIMINARY STUDY ON APPLICATION OF MICROCOLONY
TECHNIQUE TO BACTERIA COUNT
, http://www.100md.com
Yang Guowu Ye Xiaolian Zhang Haixuan
( Shenzhen Municipal Institute for Supervision and Examination of Product
Quality,Guangdong Province, Shenzhen 518029 )
Abstract Using polycarbonate millipore filter membrance instead of acid cellulose
ester membrane to serve as carrier and microscopic counting, the microcolony technique was used for bacteria count.The experiment indicated that the results obtained using this method showed good repetitiveness.The bacterial count of the sample taken from the filter membrane cultured at 37℃ for 3.0～5.0 h was not different significantly from the results of 24～48 h culture at 37℃ using conventional agar pour plate method (by paired data statistical analysis, SD=8.94～89.72, t=1.00～1.25, P>0,20).
, 百拇医药
Key words bacteria count microcolony method agar pour plate method
微菌落(bacterial microcolony)是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的仅可藉显微镜查知的微小菌落。已有利用微菌落技术定性检测细菌的报道〔1～3〕。我们对微菌落培养计数方法作了改进，用聚碳酸酯微孔滤膜代替一般细菌滤膜培养所用酸纤维素酯微孔滤膜作载体，于培养3.5～5.0 h，用显微镜油镜观察计数菌落。现将结果报道于下。
1 方法
1.1 器材的准备
用物镜测微尺(上海第三光学仪器厂产)预先测量出显微镜一个油镜视野的直径。将聚碳酸酯微孔滤膜(孔径< 0.45 μm，直径47 mm)置沸水中煮5 min后，以其光面朝上装于过滤器(美国Millipore公司产，用前先经压力蒸汽灭菌)中。连接真空泵(也可用水射流负压法)，待用于抽滤样液。
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1.2 样本的处理
试验菌为大肠杆菌(8099)与金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)。取含试验菌或自然菌的样液300～500 ml，经滤器抽滤。取出滤膜，剪成4块，以其光面朝上贴于普通营养琼脂平板上。于37℃培养至3.5 h，取出1块滤膜置于玻片上，其余继续培养。待玻片上滤膜干后，膜上再盖一玻片压住，在酒精火焰上往返7次，加热固定菌落。然后，滴加染色液(0.5 g碱性复红经20 ml 95%乙醇溶解，加水稀释至100 ml。静置过夜，经微孔滤膜过滤后备用)染色1 min，用水漂去残留染色液，置油镜下观察。若微菌落形态不典型，再取培养4.0 h滤膜1块染色镜检。若仍不典型，以每隔0.5 h取培养样本观察，直至观察到典型微菌落(图1，图2)时，进行计数。
图1 大肠杆菌微菌落形态 (37℃培养3.5 h，×1 000)
, 百拇医药
Fig1 Morphology of microcolony of Escherichia coli
(37℃ culture for 3.5 h，×1 000)
图2 金黄色葡萄球菌微菌落形态
(37℃培养4 h，×1 000)
Fig2 Morphology of microcolony of Staphy- lococcus aureus
(37℃ culture for 4 h，×1 000)
1.3 菌落计数
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在油镜下观察并计数40个视野的微菌
落数，按下式计算样本中菌落总数：
〔 X为样本菌落总数(cfu/ml)；A为40个视野微菌落总数(cfu)；Φ1为滤膜有效过滤直径(mm)；Φ2为油镜视野直径(mm)；V为滤过的样液量(ml)。〕
2 结果
2.1 可重复性
对含大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的同一份菌悬液，用微菌落培养计数法检测5次，重复性良好(表1)。
表1 微菌落培养计数法检测样本中细菌数的重复结果
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Table1 Repetitive results of bacterial count in the sample examined by microcolony culture counting method 样本号
Sample No.
检测菌落数
No.of colonies detected(cfu/ml)
大肠杆菌
Escherichia coli
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
1
, 百拇医药
251
504
2
245
500
3
251
497
4
250
491
5
240
505
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2.2 与常规琼脂倾注活菌培养计数法比较
制备5份含大肠杆菌悬液，分别用微菌落培养计数法与常规琼脂倾注活菌培养计数法(即取稀释后的菌悬液接种平皿，倾注普通营养琼脂并混匀)检测。所得结果(表2)经配对资料统计学分析，SD=8.94，t=1.00，0.50>P>0.20，两种方法的结果无显著性差异。表2 两种细菌培养计数法检测样本中大肠杆菌数结果的比较
Table2 Comparison of results of count of Escherichia coli Hin the sample examined by two bacteria culture counting methods 样本号
Sample No.
检测菌落数
No.of colonies detected(cfu/ml)
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微菌落法
Microcolony method
琼脂倾注平板法
Agar pour plate method
1
170
180
2
150
160
3
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, http://www.100md.com 190
4
250
250
5
110
120
注: 滤膜培养时间为3.5～5.0 h，平板培养时间为24～48 h。
Note: The culture time of filter membrane was 3.5～5.0 h and that of agar plate was 24～48 h.
取5瓶纯净水，分别用两法检测其中细菌总数。两种方法检测的结果(表3)亦无显著性差异(SD=89.72，t=1.25，0.50>P>0.20)。
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表3 两种细菌培养计数法检测水中细菌总数结果的比较
Table3 Comparison of results of measuring total bacterial count of water by two bacteria culture counting methods 样本号
Sample No.
检测菌落数
No.of colonies detected(cfu/ml)
微菌落法
Microcolony method
琼脂倾注平板法
, 百拇医药
Agar pour plate method
1
0
0
2
120
130
3
1 100
1 300
4
1 000
990
, 百拇医药
5
320
320
注: 滤膜培养时间为3.5～5.0 h，平板培养时间为24～48 h。
Note: The culture time of filter membrane was 3.5～5.0 h and that of agar plate was 24～48 h.
3 讨论
3.1 本方法采用聚碳酸酯微孔滤膜，较酸纤维素酯膜有下列优点：① 聚碳酸酯膜是透明的，不需再作透明处理；② 该膜使用中始终保持透明，酸纤维素酯膜经透明处理后在使用中可变为不透明，影响显微观察；③ 加热固定时，聚碳酸酯膜易与菌体结合，固定效果较好。
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3.2 本方法中不宜用针头式过滤器，以免液体呈湍流式通过滤膜，造成细菌在膜上分布不均匀。采用Millipore公司产真空负压抽滤装置，可使滤膜各点负压相同，细菌在膜上分布较均匀，使从40个视野所得的微菌落数较准确。
3.3 为保证滤膜上微菌落分布均匀，样液过滤量不宜少于300 ml。但一个视野中观察到的菌落最好不超过5个，否则因菌落拥挤，加以固定不好，易混长在一起，影响计数的准确。为此，当样液中含菌量较多时，应先用无菌生理盐水作适当稀释。
3.4 本法中，一般培养3.5 h即可。经杀菌作用后的样本，应考虑残存受伤菌的复苏时间，培养时间宜略延长。
参考文献
〔1〕 Hadzieva NC, Hadziev ST. Bacterial microcolony - a possible approach for a rapid differentiation of bacteria. J Hyg Epidem Microbiol Immunnol 1997; 31 (2) : 189.
〔2〕 裴晓芳，叶梅君，张朝武，等. 细菌微菌落及其初步应用. 华西医科大学学报 1992; 23 (4) : 403.
〔3〕 叶梅君，裴晓芳，许欣，等. 微菌落免疫技术实验研究. 现代预防医学 1991; 18 (3) : 132.
(1998-05-31收稿 1998-09-05修回), 百拇医药