亚甲蓝光敏消毒法对人血浆部分成分影响的试验观察
作者：张文福 袁庆霞 李成文 刘育京
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
关键词：亚甲蓝光敏法；血浆消毒；血浆成分
中国消毒学杂志990302 提要 向人血浆中加入亚甲蓝染料浓度为1μmol/L，再以10000lux强度的溴钨灯光照射10min，血浆中主要成分的生化指标只有胆红素与尿酸两种代谢产物有明显降低，其余均无明显变化，各种酶活性未发生明显改变。血浆蛋白分子量SDS-PAGE与盘状PAGE电泳未见明显异常。微量免疫电泳与免疫交叉电泳也未见血浆成分免疫原性改变。
EXPERIMENTAL OBSERVATION ON INFLUENCE
OF PHOTOACTIVATED METHYLENE BLUE DISINFECTION
, 百拇医药
ON SOME COMPONENTS OF HUMAN PLASMA
Zhang Wenfu Yuan Qingxia Li Chengwen Liu Yujing
Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071
Abstract
Following the demonstration of inactivating effect of photoactivated methylene blue disinfection on virus, observation on destructive effect of this disinfection method on components of normal human plasma was carried out in the present experiment. The results showed that addition of 1 μmol/L methylene blue to human plasma followed by irradiation with bromine tungsten lamp at intensity of 10 000 lux for 10 min caused only significant decrease in 2 kinds of metabolites, i.e. bilirubin and uric acid, in biochemical indices of the main components of plasma, while the other indices did not change significantly. The activity of various enzymes had no significant change. No significant abnormality in molecular weight SDS-PAGE and disc PAGE electrophoresis of plasma proteins was observed and no change in immunogenicity of plasma components was seen in microimmunoelectrophoresis and crossed immunoelectrophoresis.
, 百拇医药
Key words photoactivated methylene blue method disinfection of serum plasma component
为了进一步保证临床输血和血制品的安全，我们根据国外文献报道〔1〕，采用了亚甲蓝光敏消毒法对临床用冰冻人血浆进行消毒处理。继在试管内证实了其良好的病毒灭活能力〔2〕后，现将其对正常人血浆成分破坏情况的试验结果报道如下。
1方法
1.1血浆消毒处理
临床用冰冻人血浆(解放军中心血站提供)经25℃水浴融化，按0.9ml分装后，加入10μmol/L亚甲蓝染料(Sigma公司产)0.1ml，充分混匀10min，使染料与病毒结合。再经10000Lux光照(光源为溴钨灯，上海申江灯泡厂产)处理不同时间灭活病毒。于消毒处理前、后，分别测定人血浆成分。
, http://www.100md.com
1.2血浆生化指标的测定
用美国产Monarch Plus全自动生化分析仪测定。
1.3血浆蛋白SDS-PAGE电泳分析
按Weber等报告的方法〔3〕，先制作5%和12%的SDS-PAGE胶，将样品以100℃变性处理后，取10μl加样，经12mA电泳6h，考马斯亮蓝R250染色。观察各组分分子量的变化。
1.4盘状PAGE电泳与微量免疫电泳分析
按李成文介绍的方法〔4〕进行。
1.5免疫交叉电泳
按Clarke等报告的方法〔5〕，用巴比妥缓冲液配制1%琼脂，取10ml倾注玻片，在琼脂板阴极处打孔，加样电泳2h。切除样品一侧的凝胶，注入兔抗人血清抗体的琼脂，转90°角进行第二次电泳3h。噻嗪红染色后观察免疫沉淀峰，以判定血浆抗原活性变化。
, 百拇医药
2结果
2.1血浆生化指标测定结果
实验对比测定了光敏消毒前对照与消毒后血浆中总蛋白、白蛋白、血糖、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、胆红素、尿素氮、尿酸等10多项生化指标的含量或活性单位。结果，主要指标，如蛋白质、脂类、糖类含量与各种酶活性均无明显变化(低于10%的可接受水平)，只有胆红素与尿酸两种代谢产物有明显降低(附表)。与对照有显著性差异(P<0.01)。
附表 亚甲蓝光敏法对血浆生化指标的影响
Table Influence of photoactivated methylene blue method on plasma biochemical indices 测定项目
Item measured
, 百拇医药
单位
Unit
测定结果(X±S)
Results of measurement
对照Control
消毒10 min
Disinfection for 10 min
消毒30 min
Didinfection for 30 min
总蛋白Total protein
g/L
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51.5±3.8
49.9±0.2
50.3±0.4
白蛋白Albumin
g/L
37.9±1.3
36.6±0.5
36.9±0.2
葡萄糖Glucose
mmol/L
19.41.3
17.9±0.7
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18.7±0.1
甘油三脂Triglyceride
mmol/L
2.7±0.1
2.6±0.1
2.5±0.1
胆固醇Cholesterol
mmol/L
0.83±0.04
0.8±10.01
0.82±0.01
乳酸脱氢酶Lactic dehydrogenase
, http://www.100md.com
IU/L
159.7±8.1
151.7±4.0
140.0±1.7
碱性磷酸酶A lkaline phosphatase
IU/L
90.3±6.1
92.7±2.9
88.3±4.0
天冬氨酸转酶AST
IU/L
30.7±0.6
, http://www.100md.com
29.3±3.1
32.0±1.7
丙氨酸转氨酶ALT
IU/L
19.7±2.1
18.3±0.6
19.3±2.9
胆红素Bilirubin
μmol/L
9.1±0.7
4.0±0.4
2.9±0.2
, 百拇医药
血尿素氨BUN
μmol/L
5.20.2
5.2±0.1
5.4±0.3
肌酐Creatinine
μmol/L
79.6±4.8
77.2±0.9
78.8±0.8
尿酸Uric acid
μmol/L
, 百拇医药
146.7±11.5
123.5±13.4
81.1±4.7
注:表中数据为3次试验的结果。
Note: The figures in the table are results of 3 tests.
2.2 血浆蛋白分子量的变化
在SDS-PAGE电泳图中，经亚甲蓝光敏消毒处理后的血浆与对照血浆相比，蛋白质分子条带基本无变化。说明无蛋白质分子多聚体形成，也无蛋白质分子降解(图1)。在盘状电泳图谱中，同样未观察到病毒灭活处理前后，血浆蛋白分子条带的改变(图2)。
, 百拇医药
图1 SDS-PAGE电泳分析结果
Fig 1 Results of SDS-PAGE electrophoresis
注: A、B、C、D、E、F依次分别是正常人血清对照、正常人血浆对照、单独光照处理、单独亚甲蓝处理、亚甲蓝光敏法处理5min、10min后血浆样品。
Note:A、B、C、D、EandF are normal human serum control, normal human plasma control, plasma sample treated with irradiation only, plasma sample treated with methylene blue only, and plasma sample treated with photoactivated methylene blue for 5 min and 10 min respectively.
, 百拇医药
图2 盘状PAGE电泳分析结果
Fig 2 Results of disc PAGE electrophoresis
注:A、B、C、D、E、F分别是正常人血清对照、正常人血浆对照、单独光照处理、单独MB处理、亚甲蓝光敏法处理5min、亚甲蓝光敏法处理10min后血浆样品。
Note:A、B、C、D、E and F are normal human serum control, normal human plasma control, plasma sample treated with irradiation only, plasma sample treated with methylene blue only, plasma samples treated with photoactivated methylene blue for 5 min and 10 min respectively.
, 百拇医药
2.3血浆抗原活性和聚散程度分析
血浆样品微量免疫电泳结果，与正常血浆相比，在有效灭活病毒处理后的血浆中，IgG抗原抗体沉淀带的形态和面积与之基本相同，说明其抗原活性分子的含量和聚散程度无明显改变(图3)。
图3 火箭免疫微量电泳
Fig 3 Result of rocket microimmunoelectrophoresis
注: 上孔加正常人血浆对照样品，下孔加亚甲蓝光敏法处理10 min后血浆样品。
Note: Normal human plasma control sample was added to the upper well and plasma sample treated with photoactivated methylene blue for 10 min was added to the lower well.
, http://www.100md.com
2.4血浆中蛋白抗原活性的变化
在血浆样品的免疫交叉电泳图上，未经消毒处理的对照血浆能见到13个左右的免疫沉淀峰，消毒处理10min后的血浆样品，见到的主要沉淀峰形态和位置无明显变化(图4)。表明消毒处理后血浆中主要蛋白的分子量和抗原活性均无明显的变化。
A.正常对照血浆 B. 亚甲蓝光敏法处理10 min后血浆
A.Normal control plasma B. Plasma treated with photoactivated
methylene blue for 10 min
, 百拇医药
图4 免疫交叉电泳分析结果
Fig 4 Result of crossed immunoelectrophoresis
3结语
亚甲蓝是一种吩噻嗪类染料，临床上主要用于治疗氰化物和亚硝酸盐类中毒，其毒理学特性和人体代谢动力学特性等都已经相当清楚。由于其具有阳离子性质，易与带负电荷的病毒表面脂蛋白和核酸结合，经一定强度的可见光照射，使其受激发产生自由基和单线态氧，达到灭活病毒的作用，并可用于单份人血浆中病毒的灭活处理〔6〕。
本试验在同样证实了其良好的消毒 作用〔2〕后，进一步证实了该方法对血浆中的正常成分活性无明显的破坏作用。消毒处理前后，血浆中的总蛋白、白蛋白、脂类、血糖含量，与各种酶活性，如谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶等均无明显变化(低于10%的可接受水平)，只有胆红素与尿酸两种代谢中间产物有显著降低。SDS-PAGE电泳和盘状电泳图谱分析，经亚甲蓝光敏消毒处理后的血浆与对照血浆相比，蛋白质分子条带基本无变化。说明无蛋白质分子多聚体形成，也无蛋白质分子降解。从血浆样品的微量免疫电泳的结果说明，其抗原活性分子的含量和聚散程度，在处理前后也无明显改变。
, 百拇医药
参考文献
〔1〕Mohr H, Bachmann B, Klein SA, et al. Virus inactivation of blood products by phenothiazine dyes and light. Photochem Photobiol, 1997; 65: 441.
〔2〕张文福, 袁庆霞, 王宏霞, 等. 亚甲蓝光敏法对人血浆中病毒的灭活研究.中国消毒学杂志,1999；16(2):65.
〔3〕Weber K and Osborn M. The reliability of molecular weight determination by dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem, 1969; 244: 4406.
, 百拇医药
〔4〕李成文.现代免疫化学技术.上海科学技术出版社，1992：52～80.
〔5〕Clarke MHG and Freeman T. Quantitative immuno-electophoresis of human serum proteins. Clin Sci, 1968; 35: 403.
〔6〕Bachmann B, Knuver-Hopf J, Lambrecht B, et al. Target structures for HIV-1 inactivation by methylene blue and light. J Med Virol, 1995; 47: 172.
收稿日期：1998-07-02 修回日期：1998-12-28, 百拇医药
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
关键词：亚甲蓝光敏法；血浆消毒；血浆成分
中国消毒学杂志990302 提要 向人血浆中加入亚甲蓝染料浓度为1μmol/L，再以10000lux强度的溴钨灯光照射10min，血浆中主要成分的生化指标只有胆红素与尿酸两种代谢产物有明显降低，其余均无明显变化，各种酶活性未发生明显改变。血浆蛋白分子量SDS-PAGE与盘状PAGE电泳未见明显异常。微量免疫电泳与免疫交叉电泳也未见血浆成分免疫原性改变。
EXPERIMENTAL OBSERVATION ON INFLUENCE
OF PHOTOACTIVATED METHYLENE BLUE DISINFECTION
, 百拇医药
ON SOME COMPONENTS OF HUMAN PLASMA
Zhang Wenfu Yuan Qingxia Li Chengwen Liu Yujing
Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071
Abstract
Following the demonstration of inactivating effect of photoactivated methylene blue disinfection on virus, observation on destructive effect of this disinfection method on components of normal human plasma was carried out in the present experiment. The results showed that addition of 1 μmol/L methylene blue to human plasma followed by irradiation with bromine tungsten lamp at intensity of 10 000 lux for 10 min caused only significant decrease in 2 kinds of metabolites, i.e. bilirubin and uric acid, in biochemical indices of the main components of plasma, while the other indices did not change significantly. The activity of various enzymes had no significant change. No significant abnormality in molecular weight SDS-PAGE and disc PAGE electrophoresis of plasma proteins was observed and no change in immunogenicity of plasma components was seen in microimmunoelectrophoresis and crossed immunoelectrophoresis.
, 百拇医药
Key words photoactivated methylene blue method disinfection of serum plasma component
为了进一步保证临床输血和血制品的安全，我们根据国外文献报道〔1〕，采用了亚甲蓝光敏消毒法对临床用冰冻人血浆进行消毒处理。继在试管内证实了其良好的病毒灭活能力〔2〕后，现将其对正常人血浆成分破坏情况的试验结果报道如下。
1方法
1.1血浆消毒处理
临床用冰冻人血浆(解放军中心血站提供)经25℃水浴融化，按0.9ml分装后，加入10μmol/L亚甲蓝染料(Sigma公司产)0.1ml，充分混匀10min，使染料与病毒结合。再经10000Lux光照(光源为溴钨灯，上海申江灯泡厂产)处理不同时间灭活病毒。于消毒处理前、后，分别测定人血浆成分。
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1.2血浆生化指标的测定
用美国产Monarch Plus全自动生化分析仪测定。
1.3血浆蛋白SDS-PAGE电泳分析
按Weber等报告的方法〔3〕，先制作5%和12%的SDS-PAGE胶，将样品以100℃变性处理后，取10μl加样，经12mA电泳6h，考马斯亮蓝R250染色。观察各组分分子量的变化。
1.4盘状PAGE电泳与微量免疫电泳分析
按李成文介绍的方法〔4〕进行。
1.5免疫交叉电泳
按Clarke等报告的方法〔5〕，用巴比妥缓冲液配制1%琼脂，取10ml倾注玻片，在琼脂板阴极处打孔，加样电泳2h。切除样品一侧的凝胶，注入兔抗人血清抗体的琼脂，转90°角进行第二次电泳3h。噻嗪红染色后观察免疫沉淀峰，以判定血浆抗原活性变化。
, 百拇医药
2结果
2.1血浆生化指标测定结果
实验对比测定了光敏消毒前对照与消毒后血浆中总蛋白、白蛋白、血糖、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、胆红素、尿素氮、尿酸等10多项生化指标的含量或活性单位。结果，主要指标，如蛋白质、脂类、糖类含量与各种酶活性均无明显变化(低于10%的可接受水平)，只有胆红素与尿酸两种代谢产物有明显降低(附表)。与对照有显著性差异(P<0.01)。
附表 亚甲蓝光敏法对血浆生化指标的影响
Table Influence of photoactivated methylene blue method on plasma biochemical indices 测定项目
Item measured
, 百拇医药
单位
Unit
测定结果(X±S)
Results of measurement
对照Control
消毒10 min
Disinfection for 10 min
消毒30 min
Didinfection for 30 min
总蛋白Total protein
g/L
, http://www.100md.com
51.5±3.8
49.9±0.2
50.3±0.4
白蛋白Albumin
g/L
37.9±1.3
36.6±0.5
36.9±0.2
葡萄糖Glucose
mmol/L
19.41.3
17.9±0.7
, http://www.100md.com
18.7±0.1
甘油三脂Triglyceride
mmol/L
2.7±0.1
2.6±0.1
2.5±0.1
胆固醇Cholesterol
mmol/L
0.83±0.04
0.8±10.01
0.82±0.01
乳酸脱氢酶Lactic dehydrogenase
, http://www.100md.com
IU/L
159.7±8.1
151.7±4.0
140.0±1.7
碱性磷酸酶A lkaline phosphatase
IU/L
90.3±6.1
92.7±2.9
88.3±4.0
天冬氨酸转酶AST
IU/L
30.7±0.6
, http://www.100md.com
29.3±3.1
32.0±1.7
丙氨酸转氨酶ALT
IU/L
19.7±2.1
18.3±0.6
19.3±2.9
胆红素Bilirubin
μmol/L
9.1±0.7
4.0±0.4
2.9±0.2
, 百拇医药
血尿素氨BUN
μmol/L
5.20.2
5.2±0.1
5.4±0.3
肌酐Creatinine
μmol/L
79.6±4.8
77.2±0.9
78.8±0.8
尿酸Uric acid
μmol/L
, 百拇医药
146.7±11.5
123.5±13.4
81.1±4.7
注:表中数据为3次试验的结果。
Note: The figures in the table are results of 3 tests.
2.2 血浆蛋白分子量的变化
在SDS-PAGE电泳图中，经亚甲蓝光敏消毒处理后的血浆与对照血浆相比，蛋白质分子条带基本无变化。说明无蛋白质分子多聚体形成，也无蛋白质分子降解(图1)。在盘状电泳图谱中，同样未观察到病毒灭活处理前后，血浆蛋白分子条带的改变(图2)。
, 百拇医药
图1 SDS-PAGE电泳分析结果
Fig 1 Results of SDS-PAGE electrophoresis
注: A、B、C、D、E、F依次分别是正常人血清对照、正常人血浆对照、单独光照处理、单独亚甲蓝处理、亚甲蓝光敏法处理5min、10min后血浆样品。
Note:A、B、C、D、EandF are normal human serum control, normal human plasma control, plasma sample treated with irradiation only, plasma sample treated with methylene blue only, and plasma sample treated with photoactivated methylene blue for 5 min and 10 min respectively.
, 百拇医药
图2 盘状PAGE电泳分析结果
Fig 2 Results of disc PAGE electrophoresis
注:A、B、C、D、E、F分别是正常人血清对照、正常人血浆对照、单独光照处理、单独MB处理、亚甲蓝光敏法处理5min、亚甲蓝光敏法处理10min后血浆样品。
Note:A、B、C、D、E and F are normal human serum control, normal human plasma control, plasma sample treated with irradiation only, plasma sample treated with methylene blue only, plasma samples treated with photoactivated methylene blue for 5 min and 10 min respectively.
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2.3血浆抗原活性和聚散程度分析
血浆样品微量免疫电泳结果，与正常血浆相比，在有效灭活病毒处理后的血浆中，IgG抗原抗体沉淀带的形态和面积与之基本相同，说明其抗原活性分子的含量和聚散程度无明显改变(图3)。
图3 火箭免疫微量电泳
Fig 3 Result of rocket microimmunoelectrophoresis
注: 上孔加正常人血浆对照样品，下孔加亚甲蓝光敏法处理10 min后血浆样品。
Note: Normal human plasma control sample was added to the upper well and plasma sample treated with photoactivated methylene blue for 10 min was added to the lower well.
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2.4血浆中蛋白抗原活性的变化
在血浆样品的免疫交叉电泳图上，未经消毒处理的对照血浆能见到13个左右的免疫沉淀峰，消毒处理10min后的血浆样品，见到的主要沉淀峰形态和位置无明显变化(图4)。表明消毒处理后血浆中主要蛋白的分子量和抗原活性均无明显的变化。
A.正常对照血浆 B. 亚甲蓝光敏法处理10 min后血浆
A.Normal control plasma B. Plasma treated with photoactivated
methylene blue for 10 min
, 百拇医药
图4 免疫交叉电泳分析结果
Fig 4 Result of crossed immunoelectrophoresis
3结语
亚甲蓝是一种吩噻嗪类染料，临床上主要用于治疗氰化物和亚硝酸盐类中毒，其毒理学特性和人体代谢动力学特性等都已经相当清楚。由于其具有阳离子性质，易与带负电荷的病毒表面脂蛋白和核酸结合，经一定强度的可见光照射，使其受激发产生自由基和单线态氧，达到灭活病毒的作用，并可用于单份人血浆中病毒的灭活处理〔6〕。
本试验在同样证实了其良好的消毒 作用〔2〕后，进一步证实了该方法对血浆中的正常成分活性无明显的破坏作用。消毒处理前后，血浆中的总蛋白、白蛋白、脂类、血糖含量，与各种酶活性，如谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶等均无明显变化(低于10%的可接受水平)，只有胆红素与尿酸两种代谢中间产物有显著降低。SDS-PAGE电泳和盘状电泳图谱分析，经亚甲蓝光敏消毒处理后的血浆与对照血浆相比，蛋白质分子条带基本无变化。说明无蛋白质分子多聚体形成，也无蛋白质分子降解。从血浆样品的微量免疫电泳的结果说明，其抗原活性分子的含量和聚散程度，在处理前后也无明显改变。
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参考文献
〔1〕Mohr H, Bachmann B, Klein SA, et al. Virus inactivation of blood products by phenothiazine dyes and light. Photochem Photobiol, 1997; 65: 441.
〔2〕张文福, 袁庆霞, 王宏霞, 等. 亚甲蓝光敏法对人血浆中病毒的灭活研究.中国消毒学杂志,1999；16(2):65.
〔3〕Weber K and Osborn M. The reliability of molecular weight determination by dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem, 1969; 244: 4406.
, 百拇医药
〔4〕李成文.现代免疫化学技术.上海科学技术出版社，1992：52～80.
〔5〕Clarke MHG and Freeman T. Quantitative immuno-electophoresis of human serum proteins. Clin Sci, 1968; 35: 403.
〔6〕Bachmann B, Knuver-Hopf J, Lambrecht B, et al. Target structures for HIV-1 inactivation by methylene blue and light. J Med Virol, 1995; 47: 172.
收稿日期：1998-07-02 修回日期：1998-12-28, 百拇医药