检测尿微量蛋白和Ⅳ型胶原对糖尿病肾病早期诊断的意义
作者：姚春艳 杨沛 府伟灵
单位：姚春艳(第三军医大学：附属西南医院检验科，重庆400038)；府伟灵(第三军医大学：附属西南医院检验科，重庆400038)；杨沛(第三军医大学：附属大坪医院野战外科研究所检验科，重庆400042)
关键词：糖尿病肾病；视黄醇结合蛋白；转铁蛋白；Ⅳ型胶原
第三军医大学学报000218
提要 目的：探讨尿标本中视黄醇结合蛋白(RBP)、转铁蛋白(TRF)、微量白蛋白(mALB)及Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)检测在 糖尿病肾病早期诊断中的作用。方法：用ELISA法检测 尿中RBP、TRF及Ⅳ-C，免疫比浊法检测尿微量白蛋白 (mALB)，酶偶联法测定尿肌酐。结果：正常对照组中尿 RBP/Cr、TRF/Cr及Ⅳ-C的含量分别为(2.12±0.95)mg/mmol,(1.81± 0.52)mg/mmol,(44.68±17.2)ng/ml。在糖尿病无肾病组中，其微量 白蛋白的含量与正常对照组相近(P>0.05)，而RBP、TRF及 Ⅳ-C的含量与正常对照组相比具有显著差别(P<0.05)。在糖尿病的初期肾病组和临床肾病组，mALB、RBP/Cr、 TRF/C的及Ⅳ-C的含量均明显高于正常对照组(P<0.01)。结论：联合检测尿RBP、TRF及Ⅳ-C是诊断糖尿病肾病早 期损伤灵敏、可靠的实验室指标。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R446.12;R587.104 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0160-03
Clinical significance of detecting urinary microalbumin and type IV collagen in diagnosis of early diabetic nephropathy
YAO Chun-yan, YANG Pei, FU Wei-ling
(Laboratory Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective: To investigate the role of detection of urinary RBP, TRF and IV-C in diagnosis of early diabetic nephropathy. Methods: Urinary RBP, TRF and IV-C were determined with ELISA, urinary microalbumin with immunoturbidimetry and urinary creatinine with enzyme coupled reaction. Results: In the group of microalbuminuria of diabetes, the microalbumin content was close to that of the controls (P>0.05) while the levels of RBP, TRF and IV-C were higher in the patients than in the controls (P<0.05). The levels of RBP, TRF and IV-C were markedly higher in patients with early-stage and clinical-stage diabetic nephropathy than in the controls (P<0.01). Conclusion: This method is sensitive and reliable for diagnosis of early diabetic nephropathy.
, 百拇医药
Key words diabetic nephropathy; retinol-binding protein; transferrin; type-IV collagen
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)为糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的 一种严重慢性并发症，在糖尿病人的死亡原因中占 有较大比例，故早期诊断对糖尿病的防治和预后具 有重要意义。在早期肾活检发现组织学改变时，临 床上常无症状，尿常规与肾功能检查均可正常。目 前肾病的实验室诊断多以尿微量蛋白、肌酐等作为 主要诊断指标，这些指标也难以发现肾脏的早期损 害。我们联合检测尿中视黄醇结合蛋白(R-binding protein,RBP)、转铁蛋白(Transferrin,TRF)等微量蛋白和Ⅳ型胶原 (Type Ⅳ collagen,Ⅳ-C)，以期早期发现肾脏损害，进而有 助于筛选及检出早期糖尿病肾病。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 研究对象
1.1.1 正常对照组 50例，为健康体检人群，男28例，女 22例，平均年龄(35.2±10.8)岁。
1.1.2 糖尿病组 按WHO标准诊断：空腹血糖≥7.8mmol/L或2h血 糖≥11.1mmol/L纳入本研究。共50例，其中男性26例，女性 24例，平均年龄(54.2±13.5)岁，以上病例均无其它原因引 起的泌尿系统病变及近期服用肾毒性药物史。
根据糖尿病患者尿微量白蛋白排泄率(Urinaryalbumin excretionrate,UAER)将其分为3组。DM1组：UAER<30mg/24h，为无肾 病组共15例。DM2组：UAER在30～300mg/24h，为初期肾病组共 17例。DM3组：UAER>300mg/24h，为临床肾病组共18例。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 免疫比浊法测定尿微量白蛋白 试剂由伊利康生物制品公司提供。同时用Beckman CX7全自动生化分析仪测 量尿肌酐，试剂由美国贝克曼公司提供。结果以 mALB/Cr表示，单位为mg/mmol。
1.2.2 尿RBP、TRF测定 留取除晨尿外的尿液，离心收集上 清液，根据磺基水杨酸尿蛋白定量结果进行不同倍 数的稀释。采用ELISA法，按福建太阳生物技术公司提 供的试剂盒说明书进行测定。结果分别以RBP/Cr、TRF/Cr表 示，单位为mg/mmol。
1.2.3 尿Ⅳ-C测定 由于Ⅳ-C在尿中浓度较低，需对标 本进行浓缩。其操作为在离心后的尿液标本中缓慢 依次加入SigmaChemicalCO.出品的10g/L牛γ-球蛋白0.8ml和5ml的 450g/L的PEG-4000，在4°C孵育5min后，于冷冻离心机离心 ，弃上清液，再用生理盐水充分溶解至1ml，即得到10倍 浓缩尿标本。将浓缩后的尿标本采用ELISA法，按中国 科学院上海细胞生物研究所施高生物技术实业有限 公司生产的Ⅳ-C测定试剂盒说明书进行测定。单位 为ng/ml。
, 百拇医药
1.3 数据统计
实验数据以
±s表示，以单因素方差分析进行数据 处理，部分指标进行相关分析。P<0.05为差异显著。
2 结果
正常对照组与糖尿病各组间尿中mALB、RBP、TRF及Ⅳ-C含 量的比较见表1。在正常对照组、糖尿病无肾病组、 初期肾病组及临床肾病组中其尿中的mALB、RBP、TRF及Ⅳ-C含量均呈递增趋势。其中在无肾病组(DM1)，其微量 白蛋白含量与正常对照组无明显差异(P>0.05)，而RBP、TRF及Ⅳ-C含量均已高于正常对照组(P<0.05)。在初期肾 病组(DM2)，尿中mALB、RBP、TRF及Ⅳ-C4种微量蛋白的含量 与正常对照组相比均有显著升高(P<0.01)，且高于无肾 病组(P<0.05)。在临床肾病组(DM3)，尿中上述4种微量蛋 白的含量与对照组、无肾病组及初期肾病组相比， 均呈显著性升高，其中增加的倍数以mALB为最。
, 百拇医药
表1 正常对照组与糖尿病各组间尿微蛋白检测结果比较
Tab1 Comparison of the detected results among the control group and various DM groups
Group
n
mALB/Cr(mg/mmol)
RBP/Cr(mg/mmol)
TRF/Cr(mg/mmol)
Ⅳ-C(ng/ml)
Control
, 百拇医药 50
1.82±0.36
2.12±0.95
1.81±0.52
44.68±17.2
DM1
15
5.96±2.84
14.83±8.19*
5.94±2.78*
90.82±67.97*
, 百拇医药
DM2
17
27.23±18.34**
28.09±13.69**
19.56±7.58**
146.83±72.8**
DM3
18
52.72±28.60**
43.87±21.56**
, http://www.100md.com
35.86±28.68**
259.46±107.3**
*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
3 讨论
糖尿病患者并发糖尿病肾病的死亡率为未并发肾病 者的30倍，一旦发生临床糖尿病肾病，则缺乏有效方 法制止其发展，故早期诊断对糖尿病肾病的防治和 预后尤为重要。由于早期肾脏病有关症状不多，在 少量蛋白尿时也不易被注意，因此大多糖尿病肾病 患者总在有明显蛋白尿时方被察觉。认为尿微量白 蛋白检测对糖尿病肾病的早期诊断具有价值，在糖尿病患者的尿常规检查中，一旦出现持续阳性，糖 尿病肾病的发展将无法逆转[1]。现已有人将视黄醇结合蛋白、转铁蛋白、微量白蛋白及N-乙酰-β-D氨 基葡萄糖苷酶合称为尿系列蛋白[2]，认为他们对糖尿 病肾病的早期诊断有重要价值。
, 百拇医药
RBP是一种分子量为21.2×103u的低分子量蛋白，经肾小 球滤出后，在近端小管几乎完全被重吸收。RBP本身具 有较好的稳定性，产量相对恒定，故其在尿中的排 泄量可作为肾小管功能受损的一个灵敏指标。实验 结果显示，在糖尿病无肾病组中，其尿微量白蛋白 含量与对照组相近，而RBP含量已增高，且与对照组存 在显著差异。这说明糖尿病患者尿中白蛋白含量尚 未增加之前，RBP的含量已明显升高。并可进一步说明 ，在糖尿病的早期尚未发生肾小球功能障碍时，已 存在肾小管的功能损伤[3]。
转铁蛋白分子较白蛋白稍大，但所带负电荷较少。负电荷越少，就越易通过肾小球的负电荷屏障碍。 因此当糖尿病患者的肾小球滤过膜上出现电荷改变 时，转铁蛋白较白蛋白更易从肾小球滤过，尿中转 铁蛋白排泄量的增加较白蛋白排泄量的增加出现更 早。实验的DM1组中，在mALB与对照组相近的情况下，TRF的 含量已呈增高趋势，这说明TRF可作为诊断糖尿病早期肾脏病变的一项敏感指标。
, http://www.100md.com Ⅳ-C为细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的主要成份，是 构成基底膜骨架的主要胶原成份。因其在尿中的含 量很低，故采用PEG-4000沉淀大分子蛋白的方法[4]，对 尿标本进行浓缩后检测，结果显示在DM1组，Ⅳ-C同 样出现增高趋势。这说明在肾小球基底膜功能损害 较轻，尿中mALB含量尚正常时，已出现了Ⅳ-C的增加 。糖尿病患者尿中Ⅳ-C，随肾病加重而增加，说明 其可以作为糖尿病肾病发展的指标。近年来Kotajima等 [5]利用一种高度敏感且无需浓缩尿的方法，并通过加 入Tris-缓冲液除去沉淀等干扰物，对尿中Ⅳ-C进行 测定。其研究表明，当DM患者尿中微量白蛋白尚在正 常范围时，尿中Ⅳ-C含量已有明显升高，同时伴有 糖化血红蛋白水平的升高，这些结果均显示尿Ⅳ-C为 有用的糖尿病肾病早期标志物。
总之，联合检测尿中RBP、TRF等微量蛋白和Ⅳ-C的含 量可监测糖尿病肾病的发生和发展，为发现早期糖 尿病肾病有意义的临床指标。
, http://www.100md.com
作者简介：姚春艳(1976.6)，女，吉林省长春市人，学 士，住院医师，主要从事糖尿病肾病的检测方面的研究，发表论文1篇。电话：(023)68754209
参考文献
[1]Parving H H, Andersen A R, Smibt U M, et al. Effect of antihypertensive treatment on kidney function in diabetic nephropathy[J]. Br Med J,1987,294(6):1443-1447.
[2]陈海英，沈稚舟Ⅱ型糖尿病病人微量白蛋白尿的影响因素[J]中国实验诊断杂志，1998，2(1)：18-21.
[3]Hong C Y, Chia K S. Markers of diabetic nephropathy[J]. J Diabetes Complications,1998,12(1)：43-46.
, 百拇医药
[4]Banu N, Hara H, Katacka S, et al. A novel method for con-centrating urinary type Ⅳ collagen based on precipitation with polyethylene glycol: Application to its measurement by enzyme immunoassay[J]. Ann Clin Biochem,1994,31(Pt 5): 485-491.
[5]Kotajima N, Fukumura Y, Obata S U, et al. The significance of determination of urinary type Ⅳ collagen concentrations from a random urine collection in patients with non-insulin dependent diabetes mellitus[J]. Rinsho Byori,1998,46(3):277-282.
收稿日期：1999-10-18；修回日期：1999-12-28, 百拇医药
单位：姚春艳(第三军医大学：附属西南医院检验科，重庆400038)；府伟灵(第三军医大学：附属西南医院检验科，重庆400038)；杨沛(第三军医大学：附属大坪医院野战外科研究所检验科，重庆400042)
关键词：糖尿病肾病；视黄醇结合蛋白；转铁蛋白；Ⅳ型胶原
第三军医大学学报000218
提要 目的：探讨尿标本中视黄醇结合蛋白(RBP)、转铁蛋白(TRF)、微量白蛋白(mALB)及Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)检测在 糖尿病肾病早期诊断中的作用。方法：用ELISA法检测 尿中RBP、TRF及Ⅳ-C，免疫比浊法检测尿微量白蛋白 (mALB)，酶偶联法测定尿肌酐。结果：正常对照组中尿 RBP/Cr、TRF/Cr及Ⅳ-C的含量分别为(2.12±0.95)mg/mmol,(1.81± 0.52)mg/mmol,(44.68±17.2)ng/ml。在糖尿病无肾病组中，其微量 白蛋白的含量与正常对照组相近(P>0.05)，而RBP、TRF及 Ⅳ-C的含量与正常对照组相比具有显著差别(P<0.05)。在糖尿病的初期肾病组和临床肾病组，mALB、RBP/Cr、 TRF/C的及Ⅳ-C的含量均明显高于正常对照组(P<0.01)。结论：联合检测尿RBP、TRF及Ⅳ-C是诊断糖尿病肾病早 期损伤灵敏、可靠的实验室指标。
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中图法分类号 R446.12;R587.104 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0160-03
Clinical significance of detecting urinary microalbumin and type IV collagen in diagnosis of early diabetic nephropathy
YAO Chun-yan, YANG Pei, FU Wei-ling
(Laboratory Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective: To investigate the role of detection of urinary RBP, TRF and IV-C in diagnosis of early diabetic nephropathy. Methods: Urinary RBP, TRF and IV-C were determined with ELISA, urinary microalbumin with immunoturbidimetry and urinary creatinine with enzyme coupled reaction. Results: In the group of microalbuminuria of diabetes, the microalbumin content was close to that of the controls (P>0.05) while the levels of RBP, TRF and IV-C were higher in the patients than in the controls (P<0.05). The levels of RBP, TRF and IV-C were markedly higher in patients with early-stage and clinical-stage diabetic nephropathy than in the controls (P<0.01). Conclusion: This method is sensitive and reliable for diagnosis of early diabetic nephropathy.
, 百拇医药
Key words diabetic nephropathy; retinol-binding protein; transferrin; type-IV collagen
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)为糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的 一种严重慢性并发症，在糖尿病人的死亡原因中占 有较大比例，故早期诊断对糖尿病的防治和预后具 有重要意义。在早期肾活检发现组织学改变时，临 床上常无症状，尿常规与肾功能检查均可正常。目 前肾病的实验室诊断多以尿微量蛋白、肌酐等作为 主要诊断指标，这些指标也难以发现肾脏的早期损 害。我们联合检测尿中视黄醇结合蛋白(R-binding protein,RBP)、转铁蛋白(Transferrin,TRF)等微量蛋白和Ⅳ型胶原 (Type Ⅳ collagen,Ⅳ-C)，以期早期发现肾脏损害，进而有 助于筛选及检出早期糖尿病肾病。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 研究对象
1.1.1 正常对照组 50例，为健康体检人群，男28例，女 22例，平均年龄(35.2±10.8)岁。
1.1.2 糖尿病组 按WHO标准诊断：空腹血糖≥7.8mmol/L或2h血 糖≥11.1mmol/L纳入本研究。共50例，其中男性26例，女性 24例，平均年龄(54.2±13.5)岁，以上病例均无其它原因引 起的泌尿系统病变及近期服用肾毒性药物史。
根据糖尿病患者尿微量白蛋白排泄率(Urinaryalbumin excretionrate,UAER)将其分为3组。DM1组：UAER<30mg/24h，为无肾 病组共15例。DM2组：UAER在30～300mg/24h，为初期肾病组共 17例。DM3组：UAER>300mg/24h，为临床肾病组共18例。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 免疫比浊法测定尿微量白蛋白 试剂由伊利康生物制品公司提供。同时用Beckman CX7全自动生化分析仪测 量尿肌酐，试剂由美国贝克曼公司提供。结果以 mALB/Cr表示，单位为mg/mmol。
1.2.2 尿RBP、TRF测定 留取除晨尿外的尿液，离心收集上 清液，根据磺基水杨酸尿蛋白定量结果进行不同倍 数的稀释。采用ELISA法，按福建太阳生物技术公司提 供的试剂盒说明书进行测定。结果分别以RBP/Cr、TRF/Cr表 示，单位为mg/mmol。
1.2.3 尿Ⅳ-C测定 由于Ⅳ-C在尿中浓度较低，需对标 本进行浓缩。其操作为在离心后的尿液标本中缓慢 依次加入SigmaChemicalCO.出品的10g/L牛γ-球蛋白0.8ml和5ml的 450g/L的PEG-4000，在4°C孵育5min后，于冷冻离心机离心 ，弃上清液，再用生理盐水充分溶解至1ml，即得到10倍 浓缩尿标本。将浓缩后的尿标本采用ELISA法，按中国 科学院上海细胞生物研究所施高生物技术实业有限 公司生产的Ⅳ-C测定试剂盒说明书进行测定。单位 为ng/ml。
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1.3 数据统计
实验数据以
±s表示，以单因素方差分析进行数据 处理，部分指标进行相关分析。P<0.05为差异显著。2 结果
正常对照组与糖尿病各组间尿中mALB、RBP、TRF及Ⅳ-C含 量的比较见表1。在正常对照组、糖尿病无肾病组、 初期肾病组及临床肾病组中其尿中的mALB、RBP、TRF及Ⅳ-C含量均呈递增趋势。其中在无肾病组(DM1)，其微量 白蛋白含量与正常对照组无明显差异(P>0.05)，而RBP、TRF及Ⅳ-C含量均已高于正常对照组(P<0.05)。在初期肾 病组(DM2)，尿中mALB、RBP、TRF及Ⅳ-C4种微量蛋白的含量 与正常对照组相比均有显著升高(P<0.01)，且高于无肾 病组(P<0.05)。在临床肾病组(DM3)，尿中上述4种微量蛋 白的含量与对照组、无肾病组及初期肾病组相比， 均呈显著性升高，其中增加的倍数以mALB为最。
, 百拇医药
表1 正常对照组与糖尿病各组间尿微蛋白检测结果比较
Tab1 Comparison of the detected results among the control group and various DM groups
Group
n
mALB/Cr(mg/mmol)
RBP/Cr(mg/mmol)
TRF/Cr(mg/mmol)
Ⅳ-C(ng/ml)
Control
, 百拇医药 50
1.82±0.36
2.12±0.95
1.81±0.52
44.68±17.2
DM1
15
5.96±2.84
14.83±8.19*
5.94±2.78*
90.82±67.97*
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DM2
17
27.23±18.34**
28.09±13.69**
19.56±7.58**
146.83±72.8**
DM3
18
52.72±28.60**
43.87±21.56**
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35.86±28.68**
259.46±107.3**
*:P<0.05,**:P<0.01 vs control
3 讨论
糖尿病患者并发糖尿病肾病的死亡率为未并发肾病 者的30倍，一旦发生临床糖尿病肾病，则缺乏有效方 法制止其发展，故早期诊断对糖尿病肾病的防治和 预后尤为重要。由于早期肾脏病有关症状不多，在 少量蛋白尿时也不易被注意，因此大多糖尿病肾病 患者总在有明显蛋白尿时方被察觉。认为尿微量白 蛋白检测对糖尿病肾病的早期诊断具有价值，在糖尿病患者的尿常规检查中，一旦出现持续阳性，糖 尿病肾病的发展将无法逆转[1]。现已有人将视黄醇结合蛋白、转铁蛋白、微量白蛋白及N-乙酰-β-D氨 基葡萄糖苷酶合称为尿系列蛋白[2]，认为他们对糖尿 病肾病的早期诊断有重要价值。
, 百拇医药
RBP是一种分子量为21.2×103u的低分子量蛋白，经肾小 球滤出后，在近端小管几乎完全被重吸收。RBP本身具 有较好的稳定性，产量相对恒定，故其在尿中的排 泄量可作为肾小管功能受损的一个灵敏指标。实验 结果显示，在糖尿病无肾病组中，其尿微量白蛋白 含量与对照组相近，而RBP含量已增高，且与对照组存 在显著差异。这说明糖尿病患者尿中白蛋白含量尚 未增加之前，RBP的含量已明显升高。并可进一步说明 ，在糖尿病的早期尚未发生肾小球功能障碍时，已 存在肾小管的功能损伤[3]。
转铁蛋白分子较白蛋白稍大，但所带负电荷较少。负电荷越少，就越易通过肾小球的负电荷屏障碍。 因此当糖尿病患者的肾小球滤过膜上出现电荷改变 时，转铁蛋白较白蛋白更易从肾小球滤过，尿中转 铁蛋白排泄量的增加较白蛋白排泄量的增加出现更 早。实验的DM1组中，在mALB与对照组相近的情况下，TRF的 含量已呈增高趋势，这说明TRF可作为诊断糖尿病早期肾脏病变的一项敏感指标。
, http://www.100md.com Ⅳ-C为细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的主要成份，是 构成基底膜骨架的主要胶原成份。因其在尿中的含 量很低，故采用PEG-4000沉淀大分子蛋白的方法[4]，对 尿标本进行浓缩后检测，结果显示在DM1组，Ⅳ-C同 样出现增高趋势。这说明在肾小球基底膜功能损害 较轻，尿中mALB含量尚正常时，已出现了Ⅳ-C的增加 。糖尿病患者尿中Ⅳ-C，随肾病加重而增加，说明 其可以作为糖尿病肾病发展的指标。近年来Kotajima等 [5]利用一种高度敏感且无需浓缩尿的方法，并通过加 入Tris-缓冲液除去沉淀等干扰物，对尿中Ⅳ-C进行 测定。其研究表明，当DM患者尿中微量白蛋白尚在正 常范围时，尿中Ⅳ-C含量已有明显升高，同时伴有 糖化血红蛋白水平的升高，这些结果均显示尿Ⅳ-C为 有用的糖尿病肾病早期标志物。
总之，联合检测尿中RBP、TRF等微量蛋白和Ⅳ-C的含 量可监测糖尿病肾病的发生和发展，为发现早期糖 尿病肾病有意义的临床指标。
, http://www.100md.com
作者简介：姚春艳(1976.6)，女，吉林省长春市人，学 士，住院医师，主要从事糖尿病肾病的检测方面的研究，发表论文1篇。电话：(023)68754209
参考文献
[1]Parving H H, Andersen A R, Smibt U M, et al. Effect of antihypertensive treatment on kidney function in diabetic nephropathy[J]. Br Med J,1987,294(6):1443-1447.
[2]陈海英，沈稚舟Ⅱ型糖尿病病人微量白蛋白尿的影响因素[J]中国实验诊断杂志，1998，2(1)：18-21.
[3]Hong C Y, Chia K S. Markers of diabetic nephropathy[J]. J Diabetes Complications,1998,12(1)：43-46.
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[4]Banu N, Hara H, Katacka S, et al. A novel method for con-centrating urinary type Ⅳ collagen based on precipitation with polyethylene glycol: Application to its measurement by enzyme immunoassay[J]. Ann Clin Biochem,1994,31(Pt 5): 485-491.
[5]Kotajima N, Fukumura Y, Obata S U, et al. The significance of determination of urinary type Ⅳ collagen concentrations from a random urine collection in patients with non-insulin dependent diabetes mellitus[J]. Rinsho Byori,1998,46(3):277-282.
收稿日期：1999-10-18；修回日期：1999-12-28, 百拇医药