应用PCR－RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变

http://www.100md.com 《中国防痨杂志》 2000年第1期

     作者：吴雪琼 张俊仙 庄玉辉

    单位：吴雪琼(解放军309医院结核病研究室，北京 100091)；张俊仙(解放军309医院结核病研究室，北京 100091)；庄玉辉 (解放军309医院结核病研究室，北京 100091)

    关键词：分枝杆菌，结核；药物耐受性；聚合酶链反应；限制性片段长度多态性

    中国防痨杂志000103 摘 要：目的 了解结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药基因突变情况，建立快速检测耐药突变株的方法。方法 通过PCR-RFLP分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因突变的部位和性质。结果 以H₃₇R_V标准株为对照，13株敏感株的rpsL基因有MboⅡ酶切位点；37株耐SM分离株中，31株(83.8%)无MboⅡ酶切位点；12株耐其它抗结核药物株中，也有2株无MboⅡ酶切位点。结论 大多数结核分枝杆菌SM耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)第43位密码子有点突变。PCR-RFLP可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法。

    Analyzing the mutations of rpsL gene in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by PCR-RFLP

    WU Xueqiong ZHANG Junxian ZHUANG Yuhui.

    (Tuberculosis Research Laboratory,The 309th Hospital,Beijing 100091.)

    Abstract：Objective To observe the mutations of rpsL gene in M.tuberculosis streptomycin-resistant isolates,and to develop a new method for detecting drug resistance.Method Analyzing the mutations of rpsL gene codon 43 in M.tuberculosis clinical isolates with PCR-RFLP.Results M.tuberculosis strain H₃₇R_V was used as a control.The rpsL gene fragments from 13 drug-sensitive strains could be digested by restriction endonuclease MboⅡ.31(83.8%)of 37 streptomycin resistant strains were not restricted by MboⅡ.2 of 12 non-streptomycin-resistant strains hadn't also sites of MboⅡ.Conclusions Most M.tuberculosis streptomycin-resistant strains could be observed the mutations situated at codon 43 of genes encoding the ribosomal S12 protein (rpsL).PCR-RFLP might become a simple,rapid and reliable means of detecting drug resistance in clinical isolates.

    Key words：M.tuberculosis Drug resistance polymerase chain reaction Restriction fragment length polymorphism▲

    近年来，随着分子生物学技术的发展和结核分枝杆菌基础研究的深入，抗结核药物耐药的分子机制研究也取得了一定的进展，应用分子生物学技术检测结核分枝杆菌耐药基因，很可能成为一种新的结核分枝杆菌耐药性测定方法，它只需2～3天时间，与经典的方法相比大大缩短了时间，从而能够为临床治疗的用药选择提供依据，有利于开展更有效的化疗。

    链霉素(SM)是1945年发明的第一种有效的抗结核氨基环醇糖苷类抗生素，目前仍是结核病治疗的一线药物。最近的研究^[1，2]认为某些菌株SM耐药是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和(或)16S rRNA编码基因(rrs)突变所致。本文应用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)——限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,PFLP)分析结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因突变，研究其临床意义。

    材料与方法

    1.菌株来源和药敏试验：16种分枝杆菌和5种非分枝杆菌标准株来源于中国药品生物制品鉴定所；22株和40株结核分枝杆菌临床分离株分别来源于北京市结核病控制中心和河北省胸科医院，根据“结核病诊断细菌学检验规程”进行菌种鉴定和药敏试验。

    2.DNA制备：采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA，置-20℃保存备用。

    3.PCR扩增：PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25μl反应体系中4×dNTP的终浓度各为0.2mmol/L，引物的终浓度各为0.4μmol/L，DNA模板为10～100ng，Taq DNA聚合酶1～1.5U。置DNA热循环仪扩增后，在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。引物INS1和INS2扩增结核分枝杆菌插入序列IS986产生245bp片段^[3]；根据结核分枝杆菌rpsL基因序列(Genbank accession numble L08011)设计的引物S1和S2可扩增该基因序列产生267bp片段。

    4.RFLP分析：限制性内切酶MboⅡ购自华美生物工程公司，酶切反应按厂家说明进行。rpsL基因扩增片段经该酶消化后，在2%琼脂糖凝胶上电泳溴化乙淀染色分析，或在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳银染色分析结果。结核分枝杆菌rpsL基因若无43位氨基酸密码子突变的菌株可被消化产生两个较小的片段(分别为177bp和90bp)；若有该位点突变的菌株不被消化，电泳仍可见267bp片段。

    结 果

    1.结核分枝杆菌临床分离株的药敏试验

    在62株临床分离株中，药物敏感株13株；耐药株49株，其中耐SM分离株37株。结果见表1。

    2.结核分枝杆菌rpsL基因PCR引物的特异性

    取受试菌种DNA 20ng分别与引物S1和S2进行PCR扩增，结果见表2。除结核分枝杆菌和淡黄分枝杆菌可见267bp扩增带外，其余14种受试分枝杆菌和5种非分枝杆菌均未见该片段。

    3.临床分离株的PCR扩增

    以结核分枝杆菌标准株DNA为对照，用引物INS1和INS2扩增上述62株结核分枝杆菌分离株均产生245bp片段，进一步证明这些分离株均为结核分枝杆菌；引物S1和S2扩增上述分离株也均产生267bp片段，说明rpsL基因片段扩增成功。

    表1 结核分枝杆菌临床分离株药敏试验和PCR-RFLP结果 菌 株 编 号

    药敏试验

    PCR-RFLP

    1，2，3，4， 5， 2 4， 33，34，40， 43， 45， 53， 78

    敏感

    酶消化

    41

    耐S

    酶消化

    39，52

    耐S

    不消化

    9，18

    耐SH

    酶消化

    20，21，27，28，30，32

    耐SR

    不消化

    71

    耐SK

    不消化

    8，11，12，13，19，22，31，54，56，67

    耐SHR

    不消化

    68

    耐SHR

    酶消化

    29，74

    耐SRE

    不消化

    23，26，58

    耐SRK

    不消化

    17

    耐SHRP

    不消化

    42

    耐SHRE

    酶消化

    51，60

    耐SHRE

    不消化

    69

    耐SHRK

    酶消化

    76

    耐SHRK

    不消化

    10，15

    耐SHRPE

    不消化

    55

    耐SHRPK

    不消化

    14

    耐H

    酶消化

    16

    耐HR

    酶消化

    73

    耐HK

    酶消化

    6，25

    耐R

    酶消化

    7

    耐R

    不消化

    57

    耐RK

    酶消化

    36，38，59，65，77

    耐K

    酶消化

    注：S：链霉素；H：异烟肼；R：利福平；P：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇；K：卡那霉素

    4.RFLP分析

    以结核分枝杆菌H₃₇R_V标准株rpsL基因扩增产物为对照，62株分离株的rpsL基因扩增产物经RFLP分析发现，13株药物敏感株rpsL基因的267bp片段均可被MboⅡ消化为两个较小片段；37株耐SM分离株中，31株(83.8%)rpsL基因的267bp片段不被MboⅡ消化，6株(16.2%)可被消化为两个较小片段；12株耐其它抗结核药物的分离株中，10株的267bp片段可被MboⅡ消化，2株不被消化。结果见表1。

    5.两种电泳方法的灵敏度

    将结核分枝杆菌rpsL基因MboⅡ消化前后的扩增片段分别进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙淀染色、照相后观察底片；或进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色后肉眼观察凝胶。两种方法的结果一致，但前一种方法加样量大，酶切后的小片段不易观察；后一种方法加样量小，结果清晰可辨。部分结果见图A、B(参见插页4)。表2 结核分枝杆菌rpsL基因PCR扩增的特异性 菌 种 名 称

    rpsL基因

    1.结核分枝杆菌

    +

    2.牛分枝杆菌

    -

    3.鸟分枝杆菌

    -

    4.胞内分枝杆菌

    -

    5.瘰疬分枝杆菌

    -

    6.堪萨斯分枝杆菌

    -

    7.次要分枝杆菌

    -

    8.胃分枝杆菌

    -

    9.偶然分枝杆菌

    -

    10.母牛分枝杆菌

    -

    11.浅黄分枝杆菌

    +

    12.戈登分枝杆菌

    -

    13.龟分枝杆菌龟亚种

    -

    14.耻垢分枝杆菌

    -

    15.迪氏分枝杆菌

    -

    16.猿猴分枝杆菌

    -

    17.绿脓杆菌

    -

    18.红球菌

    -

    19.甲型链球菌

    -

    20.诺卡氏菌

    -

    21.金黄色葡萄球菌

    -

    注：+：PCR扩增阳性；-：PCR扩增阴性。讨 论

    细菌耐药的分子机理受到广泛地研究，目前已较清楚地了解了结核分枝杆菌SM的作用机制和耐药的分子机理。SM主要作用于结核分枝杆菌的核糖体，诱导遗传密码的错读，抑制mRNA转译的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合成。核糖体蛋白S12的正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准确性，rpsL基因突变就会导致S12蛋白改变，而严格要求核糖体只使用与每一密码对应的氨酰-tRNA，更准确地表达mRNA上的每一个密码，抑制了SM诱导的遗传密码错读而产生耐药性。虽然近来研究^[4]表明16S rRNA基因(rrs)突变也会导致部分结核分枝杆菌产生SM耐药，但rpsL基因突变是耐SM主要的分子机制。rpsL基因突变主要发生在两个部位：43位和88位的赖氨酸(Lys)密码子(AAG)突变成精氨酸(Arg)密码子(AGG)。根据国外文献^{[1，2，4，5，6，7]}报道的数据统计，结核分枝杆菌SM耐药分离株有rpsL基因点突变的占48.6%，有rrs基因点突变的占29.0%，这两个基因双重突变的占1%，未发现基因突变的占21.5%。而rpsL基因突变82.7%发生在第43位氨基酸密码子，17.3%发生在第88位氨基酸密码子。由此可见，约1/2的结核分枝杆菌分离株SM耐药产生是由于rpsL基因突变所致，而最常见的突变位点是第43位密码子。结核分枝杆菌SM敏感株在该位点的Lys密码子(AAG)有限制性内切酶MboⅡ的识别序列[GAAGGA(8/7)]，该基因经PCR扩增、酶切和电泳后可出现两条较小的条带；若耐SM突变株在43位的氨基酸密码子发生突变，该酶切位点消失，经PCR扩增、酶切和电泳后仍只显示一条PCR带。

    从表1可看出，本文13株SM敏感株均有MboⅡ的酶切位点，说明其rpsL基因43位密码子未发生突变；37株SM耐药株中83.8%无MboⅡ酶切位点，表明其43位密码子发生突变，酶切位点消失。这与国外的报道一致，如Morris等^[1]分析的耐SM rpsL基因突变中，88%(22/25)发生于该位点；Finken等^[4]分析的rpsL基因突变株中，70%(14/20)也发生于该位点。本文6株耐SM分离株的rpsL基因可被MboⅡ消化，说明其43位密码子无突变，我们将进一步分析其其它可能与耐SM有关的基因部位。1株单耐RFP和1株单耐卡那霉素的分离株也不被MboⅡ消化，我们将重新做药敏试验以证实其是否也耐SM。

    PCR-RFLP琼脂糖凝胶电泳、EB染色法和聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色法应用起来各有优缺点：前一种方法EB可直接加于凝胶中，省去了染色时间，电泳后即可直接观察结果；但加样量大，较费原材料；EB是强致癌物，需要安全防护和进行污物处理；而且需紫外检测仪；小片段肉眼观察困难；对眼睛及面部皮肤有害；一般通过照相、冲洗底片观察结果，分子生物学实验室通常采用。后一种方法加样量小，可节省原材料；银染色无毒无害，不需要特殊的设备，条带清晰肉眼可观察结果，适合临床实验室或检验科应用，但染色过程较EB染色烦琐费时。

    PCR-RFLP是一种分析特定基因位点点突变的基因检测技术，可确定突变的部位和性质，具有高度的特异性。本实验设计的结核分枝杆菌rpsL基因扩增引物仅扩增结核分枝杆菌和淡黄分枝杆菌，具有较高的特异性，可用于直接检测临床标本，而更具有实用价值。虽然rpsL基因作为SM耐药的遗传标记，灵敏度只有81.6%，特异度91.7%，但从本文资料中可看出它仍不失为一种快速检测SM耐药基因型的良好方法，可弥补常规药敏试验的不足，指导临床治疗。■

    参考文献：

    [1]Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of mycobacterium tuberculosis.JID,1995,171:954-957.

    [2]Nair J,Rouse DA,Bai GH,et al.The rpsL gene and streptomycin resistance in single and multiple drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.Mol.Microbiol,1993,10:521-524.

    [3]吴雪琼,庄玉辉,张晓刚,等.PCR和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究.中华结核和呼吸杂志，1996，19：37-39.

    [4]Finken M,Kirschner P,Meier A,et al.Molecular basis of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis:alterations of the ribosomal S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot.Mol.Microbiol.1993,9:1239.

    [5]Meier A,Kirschner P,Bange FC,et al.Genetic alterations in streptomycin resistant Mycobacterium tuberculosis:mapping of mutations conferring resistance.Antimicrob.Agents Chemother,1994,38:238-230.

    [6]Honore N,Cole ST.Streptomycin resistance in mycobacteria.Antimicrob.Agents Chemother,1994,38:238-241.

    [7]Douglass J,Steyn LM.A ribosomal gene mutation in streptomycin-resistant M.tuberculosis isolates.JID,1993,167:1505.

    收稿日期：1997-06-17

    修改日期：1997-11-10

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/28/60/510.htm