铝对体外人胚大脑神经细胞毒作用的研究
作者：黄国伟 康静 张文治 刘莉 俞鸣 梅玫 董亚利
单位：黄国伟(300070 天津医科大学营养研究室)；康静(300070 天津医科大学营养研究室)；刘莉(300070 天津医科大学营养研究室)；张文治(天津市环湖医院)；梅玫(天津医科大学实验中心)；董亚利(天津医科大学电镜室)
关键词：铝；脑；神经元；细胞，培养的
中华预防医学杂志000215 摘 要：目的 探讨铝对人胚大脑神经细胞的毒作用及其机制。方法 采用无血清体外细胞培养方法，观察铝对人胚大脑神经细胞的生长发育及功能的影响，同时进行光镜和电镜形态学观察。结果 高铝组的细胞存活数低于对照组，差异有显著性，光镜观察在高铝组可见大量变性坏死细胞；随铝剂量的增加神经细胞的DNA含量、神经细胞特异性烯醇化酶、胆碱酯酶活性也随之下降，呈负相关关系，并且低铝组、高铝组低于对照组，差异有显著性。神经细胞过氧化脂质含量，高铝组高于对照组，差异有显著性，并与铝剂量呈正相关关系。高剂量铝引起大脑神经细胞超微结构的损害表现为各种膜结构的损害及神经微丝微管排列紊乱。结论 铝可抑制大脑神经细胞的分化成熟及功能，并随铝剂量的增加而增强，其毒作用机制可能是通过抑制神经细胞抗氧化能力产生脂质过氧化而导致细胞各种膜结构的损害。
, http://www.100md.com
Toxic effects of aluminum on human embryonic cerebral neurocytes in vitro studies
HUANG Guowei,KANG Jing,ZHANG Wenzhi, et al.
Nutrition Research Unit, College of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Abstract：Objective To study the toxic effect of aluminum on human embryonic cerebral neurocytes in vitro studies. Methods Human embryonic cerebral neurocytes were divided into three groups (control,low Al and high Al groups). The growth, development and morphology of neurocytes were observed by light and electron microscopy. The protein, DNA,lipid peroxide (LPO) contents and the activity of neuron-specific enolase (NSE) and cholinesterase (CHE) of neurocytes were detected. Results The number of viable cells in high Al group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). The number of swelling, degenerated and necrotic cells was significantly increased in high Al group. The DNA content and the activity of NSE and CHE of neurocytes were significantly decreased with the increase of Al concentrations (P<0.05). The LPO content of neurocytes in the high Al group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). There was a positive correlation between the Al dose and LPO content of neurocytes (P<0.05). The electron microscopy study showed that the membrane structure of cell was damaged in the high Al group and the arrangement of microtubules in the processes was disordered. Conclusions The growth, development and function of human embryonic cerebral neurocytes was inhibited in the high Al group. The neurotoxicity of Al may be caused by lipid peroxidation and the damage of cell membrane.
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Key words：Aluminum；Brain；Neurons；Cells cultured
铝在机体内作用的主要靶器官之一是神经系统，流行病学调查认为一些神经系统疾病可能与铝毒性有关，动物实验也证实了铝对神经系统的危害，但铝的毒性及毒作用机制仍不十分清楚[1]。本研究采用无血清体外细胞培养方法，研究铝对人胚大脑神经细胞的毒作用，并探讨其机制。
材料与方法
1.人胚大脑神经细胞培养：选择人工流产胚胎。在无菌条件下分离大脑半球，选用无血清的Ham′s F12和DMEM(GIBCO公司)1∶1混合人工合成培养液，机械分离细胞，将细胞悬液接种于培养板中，置于CO2培养箱中培养[2,3]。
2.研究方法及剂量分组：用AlCl3*6H2O(AR)配成溶液，经无菌处理于细胞培养的第4天加入到无血清培养液中(pH值7.2)。将细胞分为3组，第Ⅰ组为空白对照组，在培养液中不加入Al，加入同等量的无菌生理盐水；第Ⅱ组为低铝组，培养液中Al的浓度为1 μmol/L；第Ⅲ组为高铝组，培养液中Al的浓度为10 μmol/L。观察细胞生长发育情况，记录细胞存活数，于细胞培养的第14～15天收集细胞，测定神经细胞蛋白质、DNA、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)[4]、胆碱酯酶(CHE)、过氧化脂质(LPO)[5]，同时进行光镜、电镜病理检查。
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3.形态学观察：光镜采用日本Nikon倒置相差显微镜进行活细胞形态观察；电镜采用JEOL-100CX透射电镜和 JSM-25S扫描电镜进行超微结构观察。
4.统计方法：采用F检验与单相关分析。
结果
1.铝对人胚大脑神经细胞生长发育的影响：经F检验，加Al后细胞存活数第6、12天， Ⅲ组低于Ⅰ组，第16、18、21天，Ⅲ组低于Ⅰ、Ⅱ组，差异有显著性 (P<0.05)。
2.铝对人胚大脑神经细胞生化指标的测定结果：见表1，2。
表1 各组人胚大脑神经细胞蛋白质、DNA含量的比较(
±s，n=6) 组别
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蛋白质(mg)
DNA(μg)
对照组Ⅰ
7.06±2.61
31.40±5.69
低铝组Ⅱ
7.07±1.90
22.70±4.02*
高铝组Ⅲ
5.62±1.63
12.34±4.54**
, 百拇医药 蛋白质为1×106个细胞中的数值，DNA为每孔中数值；* 与对照组比较 P<0.05，**与Ⅰ、Ⅱ组比较P<0.05表2 各组人胚大脑神经细胞NSE、CHE活性和LPO含量的比较(±s，n=6) 组别
NSE(单位)
CHE(单位)
LPO(单位)
对照组Ⅰ
22.21±7.50
3.30±0.87
40.30±18.07
, 百拇医药
低铝组Ⅱ
16.48±3.54*
1.94±0.49*
61.97±21.22
高铝组Ⅲ
12.50±1.93*
1.46±0.32*
84.44±15.46*
均为1×106个细胞中的数值，* 与对照组比较P<0.05
, 百拇医药 3.单相关分析结果：DNA、NSE、CHE与铝剂量呈正相关(P<0.05)；LPO与铝剂量呈负相关(P<0.05)。
4.形态学观察结果：
(1)光镜观察结果：在相差显微镜下观察细胞生长情况，换无血清加铝培养液2周后，Ⅰ、Ⅱ组神经细胞生长较好，胞体呈梭形、锥形，细胞及核膜界限清楚，细胞突起较粗壮且清晰，突起间网络稠密，变性坏死细胞较少；Ⅲ组细胞突起较细疏，突起之间网络稀疏，许多细胞界限不清晰，锥虫蓝染色可见大量变性坏死细胞。
(2)透射电镜观察结果：对照组、低铝组的形态基本相同，胞膜及核膜的双层结构清晰；胞质有丰富细胞器，结构清晰；在细胞内及突起内可见延长轴平行排列的神经微丝微管，并且疏密得当。而高铝组则表现为胞膜、核膜轻度肿胀、双层结构不清晰，胞膜可见局灶性降解，核膜迂曲，局部呈絮状；线粒体的内外膜及嵴结构不清晰，粗面内质网及核糖体数量少；胞质内有大量的次级溶酶体、脂褐素及髓鞘样结构；胞质内和突起内的神经微丝微管排列紊乱。
, 百拇医药
(3)扫描电镜观察结果：对照组、低铝组的形态基本相同，细胞呈双极或多极形，细胞丰满，中央部位微隆凸，是胞核所在处，细胞周围有胞质突起，形成交织的网络，且网络稠密。而高铝组表现为细胞表面皱缩，胞膜局部破损呈蜂窝状，突起短，数量少，部分神经细胞胞质突起有膜融合及降解现象。
讨论
在本研究剂量范围，高铝组的细胞存活数低于对照组(P<0.05)，相差显微镜下显示高铝组可见大量变性坏死细胞，说明高剂量铝可以抑制人胚大脑神经细胞的生长发育。随铝剂量的增加大脑神经细胞的DNA含量、NSE和CHE活性也随之下降，呈负相关关系(P<0.05),并且低铝组、高铝组均低于对照组差异有显著性(P<0.05)，说明低铝、高铝剂量均可抑制大脑神经细胞的分化成熟及功能，随铝剂量的增加而增强，两者呈现明显的剂量反应关系。CHE在神经组织中位于质膜和内质网的膜结构中，CHE 活性的下降与铝造成神经细胞的膜损害有关。
, 百拇医药 神经细胞LPO含量，高铝组高于对照组有显著性差别(P<0.05)，并与铝剂量呈正相关关系(P<0.05)，说明高剂量铝可能通过抑制神经细胞抗氧化能力产生脂质过氧化而导致细胞各种膜结构的损害，及细胞内脂褐素、髓鞘样结构的增多；通过抑制DNA合成及粗面内质网的损害影响神经微丝微管蛋白质的合成而导致神经微丝微管的紊乱。这与我们以前所做的铝的体内实验结果是基本相同的[6]。文献报道也认为没有氧化还原作用的铝，所产生病理变化的一种常见机制可能就是脂质过氧化所导致的膜损害[7]。因此，我们认为铝对大脑神经细胞的毒作用机制主要是通过脂质过氧化所导致膜结构的损害。
基金项目：天津市21世纪青年科学基金项目(953608911)
参考文献
[1]Kawahard M, Muramoto K, Kobayashi K, et al. Functional and morphological changes in cultured neurons of rat cerebral cortex induced by long-term application of aluminum. Biochem Biophys Res Commum, 1992, 189:1317-1322.
, 百拇医药
[2]庞智玲，张文治，李兰英. 人胚大脑神经细胞在无血清培养液中的生长特性. 细胞生物学杂志，1987,9:171-176.
[3]韩晓滨，陈学存，张文治，等. 牛黄酸对人胚大脑神经细胞14-3-2蛋白的影响. 卫生研究，1993,22:25-28.
[4]赵崇，曹德晨，宋学文，等. 大鼠神经元特异性烯醇化酶的纯化. 天津医科大学学报，1994,18:8-11.
[5]余嘉丽，奚为乎，蔡蕾，等. 血清过氧化脂质硫代巴比妥酸荧光微量测定法的标化. 中华医学检验杂志，1987,10:23-25.
[6]张万起，徐格晟，黄国伟，等. 铝对兔神经系统的亚慢性毒作用研究.中华预防医学杂志，1994,28: 158-161.
[7]Oteiza PI, Fraga CG, Keen CL. Aluminum has both oxidant and antioxidant effect in mouse brain membranes. Arch Biochem Biophys, 1993,300:517-521.
收稿日期：1999-01-04, http://www.100md.com
单位：黄国伟(300070 天津医科大学营养研究室)；康静(300070 天津医科大学营养研究室)；刘莉(300070 天津医科大学营养研究室)；张文治(天津市环湖医院)；梅玫(天津医科大学实验中心)；董亚利(天津医科大学电镜室)
关键词：铝；脑；神经元；细胞，培养的
中华预防医学杂志000215 摘 要：目的 探讨铝对人胚大脑神经细胞的毒作用及其机制。方法 采用无血清体外细胞培养方法，观察铝对人胚大脑神经细胞的生长发育及功能的影响，同时进行光镜和电镜形态学观察。结果 高铝组的细胞存活数低于对照组，差异有显著性，光镜观察在高铝组可见大量变性坏死细胞；随铝剂量的增加神经细胞的DNA含量、神经细胞特异性烯醇化酶、胆碱酯酶活性也随之下降，呈负相关关系，并且低铝组、高铝组低于对照组，差异有显著性。神经细胞过氧化脂质含量，高铝组高于对照组，差异有显著性，并与铝剂量呈正相关关系。高剂量铝引起大脑神经细胞超微结构的损害表现为各种膜结构的损害及神经微丝微管排列紊乱。结论 铝可抑制大脑神经细胞的分化成熟及功能，并随铝剂量的增加而增强，其毒作用机制可能是通过抑制神经细胞抗氧化能力产生脂质过氧化而导致细胞各种膜结构的损害。
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Toxic effects of aluminum on human embryonic cerebral neurocytes in vitro studies
HUANG Guowei,KANG Jing,ZHANG Wenzhi, et al.
Nutrition Research Unit, College of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Abstract：Objective To study the toxic effect of aluminum on human embryonic cerebral neurocytes in vitro studies. Methods Human embryonic cerebral neurocytes were divided into three groups (control,low Al and high Al groups). The growth, development and morphology of neurocytes were observed by light and electron microscopy. The protein, DNA,lipid peroxide (LPO) contents and the activity of neuron-specific enolase (NSE) and cholinesterase (CHE) of neurocytes were detected. Results The number of viable cells in high Al group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). The number of swelling, degenerated and necrotic cells was significantly increased in high Al group. The DNA content and the activity of NSE and CHE of neurocytes were significantly decreased with the increase of Al concentrations (P<0.05). The LPO content of neurocytes in the high Al group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). There was a positive correlation between the Al dose and LPO content of neurocytes (P<0.05). The electron microscopy study showed that the membrane structure of cell was damaged in the high Al group and the arrangement of microtubules in the processes was disordered. Conclusions The growth, development and function of human embryonic cerebral neurocytes was inhibited in the high Al group. The neurotoxicity of Al may be caused by lipid peroxidation and the damage of cell membrane.
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Key words：Aluminum；Brain；Neurons；Cells cultured
铝在机体内作用的主要靶器官之一是神经系统，流行病学调查认为一些神经系统疾病可能与铝毒性有关，动物实验也证实了铝对神经系统的危害，但铝的毒性及毒作用机制仍不十分清楚[1]。本研究采用无血清体外细胞培养方法，研究铝对人胚大脑神经细胞的毒作用，并探讨其机制。
材料与方法
1.人胚大脑神经细胞培养：选择人工流产胚胎。在无菌条件下分离大脑半球，选用无血清的Ham′s F12和DMEM(GIBCO公司)1∶1混合人工合成培养液，机械分离细胞，将细胞悬液接种于培养板中，置于CO2培养箱中培养[2,3]。
2.研究方法及剂量分组：用AlCl3*6H2O(AR)配成溶液，经无菌处理于细胞培养的第4天加入到无血清培养液中(pH值7.2)。将细胞分为3组，第Ⅰ组为空白对照组，在培养液中不加入Al，加入同等量的无菌生理盐水；第Ⅱ组为低铝组，培养液中Al的浓度为1 μmol/L；第Ⅲ组为高铝组，培养液中Al的浓度为10 μmol/L。观察细胞生长发育情况，记录细胞存活数，于细胞培养的第14～15天收集细胞，测定神经细胞蛋白质、DNA、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)[4]、胆碱酯酶(CHE)、过氧化脂质(LPO)[5]，同时进行光镜、电镜病理检查。
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3.形态学观察：光镜采用日本Nikon倒置相差显微镜进行活细胞形态观察；电镜采用JEOL-100CX透射电镜和 JSM-25S扫描电镜进行超微结构观察。
4.统计方法：采用F检验与单相关分析。
结果
1.铝对人胚大脑神经细胞生长发育的影响：经F检验，加Al后细胞存活数第6、12天， Ⅲ组低于Ⅰ组，第16、18、21天，Ⅲ组低于Ⅰ、Ⅱ组，差异有显著性 (P<0.05)。
2.铝对人胚大脑神经细胞生化指标的测定结果：见表1，2。
表1 各组人胚大脑神经细胞蛋白质、DNA含量的比较(
±s，n=6) 组别, http://www.100md.com
蛋白质(mg)
DNA(μg)
对照组Ⅰ
7.06±2.61
31.40±5.69
低铝组Ⅱ
7.07±1.90
22.70±4.02*
高铝组Ⅲ
5.62±1.63
12.34±4.54**
, 百拇医药 蛋白质为1×106个细胞中的数值，DNA为每孔中数值；* 与对照组比较 P<0.05，**与Ⅰ、Ⅱ组比较P<0.05表2 各组人胚大脑神经细胞NSE、CHE活性和LPO含量的比较(
±s，n=6) 组别NSE(单位)
CHE(单位)
LPO(单位)
对照组Ⅰ
22.21±7.50
3.30±0.87
40.30±18.07
, 百拇医药
低铝组Ⅱ
16.48±3.54*
1.94±0.49*
61.97±21.22
高铝组Ⅲ
12.50±1.93*
1.46±0.32*
84.44±15.46*
均为1×106个细胞中的数值，* 与对照组比较P<0.05
, 百拇医药 3.单相关分析结果：DNA、NSE、CHE与铝剂量呈正相关(P<0.05)；LPO与铝剂量呈负相关(P<0.05)。
4.形态学观察结果：
(1)光镜观察结果：在相差显微镜下观察细胞生长情况，换无血清加铝培养液2周后，Ⅰ、Ⅱ组神经细胞生长较好，胞体呈梭形、锥形，细胞及核膜界限清楚，细胞突起较粗壮且清晰，突起间网络稠密，变性坏死细胞较少；Ⅲ组细胞突起较细疏，突起之间网络稀疏，许多细胞界限不清晰，锥虫蓝染色可见大量变性坏死细胞。
(2)透射电镜观察结果：对照组、低铝组的形态基本相同，胞膜及核膜的双层结构清晰；胞质有丰富细胞器，结构清晰；在细胞内及突起内可见延长轴平行排列的神经微丝微管，并且疏密得当。而高铝组则表现为胞膜、核膜轻度肿胀、双层结构不清晰，胞膜可见局灶性降解，核膜迂曲，局部呈絮状；线粒体的内外膜及嵴结构不清晰，粗面内质网及核糖体数量少；胞质内有大量的次级溶酶体、脂褐素及髓鞘样结构；胞质内和突起内的神经微丝微管排列紊乱。
, 百拇医药
(3)扫描电镜观察结果：对照组、低铝组的形态基本相同，细胞呈双极或多极形，细胞丰满，中央部位微隆凸，是胞核所在处，细胞周围有胞质突起，形成交织的网络，且网络稠密。而高铝组表现为细胞表面皱缩，胞膜局部破损呈蜂窝状，突起短，数量少，部分神经细胞胞质突起有膜融合及降解现象。
讨论
在本研究剂量范围，高铝组的细胞存活数低于对照组(P<0.05)，相差显微镜下显示高铝组可见大量变性坏死细胞，说明高剂量铝可以抑制人胚大脑神经细胞的生长发育。随铝剂量的增加大脑神经细胞的DNA含量、NSE和CHE活性也随之下降，呈负相关关系(P<0.05),并且低铝组、高铝组均低于对照组差异有显著性(P<0.05)，说明低铝、高铝剂量均可抑制大脑神经细胞的分化成熟及功能，随铝剂量的增加而增强，两者呈现明显的剂量反应关系。CHE在神经组织中位于质膜和内质网的膜结构中，CHE 活性的下降与铝造成神经细胞的膜损害有关。
, 百拇医药 神经细胞LPO含量，高铝组高于对照组有显著性差别(P<0.05)，并与铝剂量呈正相关关系(P<0.05)，说明高剂量铝可能通过抑制神经细胞抗氧化能力产生脂质过氧化而导致细胞各种膜结构的损害，及细胞内脂褐素、髓鞘样结构的增多；通过抑制DNA合成及粗面内质网的损害影响神经微丝微管蛋白质的合成而导致神经微丝微管的紊乱。这与我们以前所做的铝的体内实验结果是基本相同的[6]。文献报道也认为没有氧化还原作用的铝，所产生病理变化的一种常见机制可能就是脂质过氧化所导致的膜损害[7]。因此，我们认为铝对大脑神经细胞的毒作用机制主要是通过脂质过氧化所导致膜结构的损害。
基金项目：天津市21世纪青年科学基金项目(953608911)
参考文献
[1]Kawahard M, Muramoto K, Kobayashi K, et al. Functional and morphological changes in cultured neurons of rat cerebral cortex induced by long-term application of aluminum. Biochem Biophys Res Commum, 1992, 189:1317-1322.
, 百拇医药
[2]庞智玲，张文治，李兰英. 人胚大脑神经细胞在无血清培养液中的生长特性. 细胞生物学杂志，1987,9:171-176.
[3]韩晓滨，陈学存，张文治，等. 牛黄酸对人胚大脑神经细胞14-3-2蛋白的影响. 卫生研究，1993,22:25-28.
[4]赵崇，曹德晨，宋学文，等. 大鼠神经元特异性烯醇化酶的纯化. 天津医科大学学报，1994,18:8-11.
[5]余嘉丽，奚为乎，蔡蕾，等. 血清过氧化脂质硫代巴比妥酸荧光微量测定法的标化. 中华医学检验杂志，1987,10:23-25.
[6]张万起，徐格晟，黄国伟，等. 铝对兔神经系统的亚慢性毒作用研究.中华预防医学杂志，1994,28: 158-161.
[7]Oteiza PI, Fraga CG, Keen CL. Aluminum has both oxidant and antioxidant effect in mouse brain membranes. Arch Biochem Biophys, 1993,300:517-521.
收稿日期：1999-01-04, http://www.100md.com