免疫方法在藻毒素及贝毒素检测中的应用*
作者：郭 皓
单位：国家海洋环境监测中心，大连 116023
关键词：免疫检测技术；藻毒素；贝毒
免疫方法在藻毒素及贝毒素检测中的应用摘要 有害藻类自身或通过食物链在鱼类、贝类等生物体内蓄积，对生物直至人类产生危害。藻类毒素和贝毒的检测方法要求快速、方便、准确，并且在其含量极微时即可检出以起到预警作用。免疫方法使之成为可能。本文介绍了免疫测试技术的基本原理及其在藻毒素和贝毒检测中的应用，总结了该方法的应用前景和不足之处，旨在常规检测中推广和普及免疫方法。
中图分类号 X834.02
The use of immunological methods for the detection of
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phycotoxin and shellfish toxin
Guo Hao
National Marine Environmental monitoring Center, Dalian 116023, China
Harmful algae can do great harm to organisms even to human through food chain by accumulating in shellfish and fish or by themselves. The immunological examination technique is fast, easy and accurate even in trace amount of phycotoxin and shellfish toxin. The theory of immunological diagnosis as well as the prospect and defect of these methods and their application in phycotoxin and shellfish toxin determination are introduced. The method deserves spreading and using in routine monitoring program.
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Key words: immunological examination, phycotoxin, shellfish toxin
海洋中有毒藻类的爆发性增殖或通过食物链的转化可能对海洋生态环境、水产养殖业和人类健康安全产生直接或间接的危害。有毒藻类自身或通过在鱼、虾、贝类等海洋生物体内的蓄积可产生多种毒素，其中危害性较大的几种毒素分别是麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、神经性贝毒(NSP)、西加鱼毒素(CTX)、遗忘症贝毒(ASP)等。贝毒危害具有突然性和广泛性，其特点为防治困难、毒性大、反应快、无适宜解药等。目前世界各国对藻类毒素和贝毒的分析采用了许多先进技术和方法，如层析，高效液相色谱，质谱及X—射线衍射等确定了一些毒素的结构和组成，此外免疫方法也被广泛应用于赤潮毒素检测。该方法具有快速、准确、便利的特点，利用抗原—抗体反应确定毒素类型及含量。在哺乳动物系统中，当某一特定藻毒素的高敏感毒性达到一个合适的抗体效价时，免疫反应变得十分复杂。这种免疫测试的敏感性要比相应的鼠生物测试法或HPLC方法敏感得多——甚至检测毒素的数量在pg级(10-12g)[1]。
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1 免疫与免疫测试技术
免疫(immunity)指机体识别和排除抗原性异物，即机体区分自身与异己的功能，包括防御、自身稳定和免疫监测三个部分[2]。免疫方法包括ELISA(酶联免疫吸附检测)、RIA(放射免疫分析)、EIA(竞争性酶免疫分析)及S-PIA法(固态免疫珠检测)等。免疫检测有许多不同类型的分析方法，如直接和间接配对法(竞争交叉反应)、双抗体“夹心”法检测等。免疫分析检测系统通常采用放射性标记(RIA)、荧光标记(FIA)，免疫电子显微镜法等，也可使用其他检测模式，如化学发光法[1，3]。
用于毒素和贝毒检测的免疫方法为生物体外测试法，以抗原—抗体特异性反应作基础，其中包括凝集反应、沉淀反应、补体参与反应等[3]。其原理是根据将诸如兔子等暴露毒素中，以功能性抗原刺激兔子产生抗体，然后从兔血清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的藻类毒素或匀浆后的贝类组织(如贻贝)暴露于标记物，然后检测抗血清—抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素含量[4]。
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近十年来，用于藻毒素及贝毒检测的免疫方法得到迅速发展，已有多种可靠的免疫诊断试剂盒用于分析不同的藻毒素。但由于缺乏与之相关的提纯毒素，以及难以从相应的小分子毒素如石房蛤毒素(STX)和软骨藻酸(domoic acid)中提取稳定的免疫抗原而限制了该研究的发展。IOC(政府间海洋组织)对免疫测试技术在藻类毒素及贝毒检测中的发展和不足作了较详细的介绍[1]，本文就免疫测试技术在PSP、DSP和NSP检测中的应用进行探讨。
用于藻毒素检测的免疫分析由单克隆抗体或多克隆抗体所制备。通常多克隆抗体比单克隆抗体的生产更加快速而且价廉，对复杂表位具有较高的亲和力，可以得出异源性广谱分析，即与相应抗原更广泛的交叉反应。单克隆抗体产生于一个永久性的细胞谱系，尽管比它们的多谱系副本稳定性略低，但能以较低的变异性连续产生，更加适用于单一表位的检测。
免疫测试反应中，具有较少内源性抗原活性(半抗原)的低分子量组分在接种前必须与某一载体(通常为蛋白质)相结合。与免疫反应相关的毒素主要来源于单个容易得到的衍生物，其中可产生毒素的浮游植物和被影响的目标生物通常有着必然的联系。在免疫方法的发展过程中，交叉反应十分重要。
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2 免疫测试技术在PSP检测中的应用
麻痹性贝毒(PSP)是一类烷基氢化嘌呤化合物，类似于具有两个胍基的嘌呤核，为非结晶、水溶性、高极性、不挥发的小分子物质，在酸性条件下稳定，碱性条件下发生氧化，毒性消失；毒素遇热稳定，并不被人的消化酶所破坏。目前已分离出18种毒素，依基团的相似性分为3类：石房蛤毒素(saxtoxins, STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝沟藻毒素(gonyautoxins, GTX1—GTX10)及脱氨甲酰基石房蛤毒素(carbamyl-N-sulfo compounds, dcSTX)，其中毒性最强的为STX、neo STX、GTX1、GTX3和dcSTX(>1300Mu.μmol-1)，但其他几种毒素很容易水解成毒性成份。其来源生物均为甲藻，如Gonyaulax catenella, Alexandrium tamarense, Peridinium foliaceum, Pyrodinium bahamense var. Compressa等。
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麻痹性贝毒是一类神经肌肉麻痹剂，其毒理作用为阻断细胞钠离子通道，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。对人体的中毒量为600～5000Mu，致死量为3000～30000Mu，目前尚无对症解毒剂。PSP的毒性为LD503.4×10-9。联合国卫生组织规定，100g贝类可食部分的PSP毒力超过80μg(400Mu)时不得食用[5～8]。
早期生产的STX多克隆抗血清使用小牛血清白蛋白作为蛋白质载体，其稳定性和活性较低。一些文献描述RIA方法(Carlson et al. ,1985)和ELISA方法(Chu and Fan, 1985； Davio et al. ,1985)使用不同的交联剂及STX衍生物产生抗体。上述所有方法都只是使用STX或其化学合成衍生物(如saxitoxinol)产生抗体。在评价与其他PSP毒素的交叉反应能力方面，大多数免疫分析的不足之处关键在于与neoSTX的交叉反应能力较弱(Carlson et al., 1984; Chu and Fan, 1985)。
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根据STX多克隆抗体检测PSP毒素所使用的吸附一抑制ELISA技术，是由STX半抗原与一种多肽聚丙氨酸—赖氨酸(Pal)化学合成载体共价耦联进行制备的(Cembella et al., 1990)。快速诊断免疫检测试剂盒(SAXITOXIN TESTR， Institut Armand-Frappier)已是一个成型的商业产品，该分析是将一定数量的STX固定于聚苯乙烯棒上，在有毒样品—抗体培养混合物中竞争性地联结自由STX抗体。其后该棒在辣根过氧化物酶(HPR)的结合下培养，在装有酶底物溶液的透明容器(如小试管)中反应生成有色产物。这种有色物质的吸光度(OD)可用分光光度法在450nm处测定。显色程度与STX浓度成反比(即：吸光度为0时，表示完全为STX吸附；>STXeq >0.64μg/g贝类组织)。具有较高毒性的样品按AOAC(1984)推荐方法在反应缓冲液中进行系列稀释。
STX多克隆抗体与SAXITOXIN TESTR试剂盒的反应结果显示出相对广泛的抗原特性，并最少与两种膝沟藻毒素(GTX2、GTX3)的交叉反应良好，但与低含量的dcSTX没有交叉反应(Cembella et al., 1990)。与不同纯化程度的氨基甲酸酯毒素(carbamate)5分钟接合的亲和性(相对STX)表示如下：GTX3(87%)，GTX2(74%)，NEO(60%)。这种交叉反应模式提示首先通过胍基与中心核相连发生结合反应，胍环N-1，2，3与N-7，8，9作为抗体结合反应的识别位，dcSTX的N-21位置的SO2-3组分阻断与抗体的联系，这种与dcSTX缺乏交叉反应的情况对总毒素含量(μg, STXeq)的测定不是关键问题，这是因为这些衍生物实际上很少比氨基甲酸酯毒素有效，并且它们可以在分析之前水解成氨基甲酸酯类似物。其它生物毒素包括软骨藻酸、大田软海绵酸(okadaic acid)及staphylococcus内毒素B等在这种免疫分析中不具备交叉反应。
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与使用HPLC-FD法和AOAC常规鼠生物测定法对有毒贝类毒性测试结果相比，SAXITOXIN TE STR试剂盒在毒素含量低于STXeq2μg/g贝类组织时所得出的可比结果没有假阳性反应。这种多克隆抗体对实验室内培养的浮游植物中PSP检测十分有用，包括从温带和亚热带海区分离出来的涡鞭毛藻，其中Alexandrium sp为浮游植物自然种群组成中的优势种(Cembella and Lamoureux, 1993)。
在类型测试实验中，由多克隆抗—STX抗体制备的直接EIA，通过将STX与辣根过氧化物酶结合，以较高的灵敏性检测贝类组织中STX(3～4ng*g-1组织)(Usleber et al., 1991)。更进一步的研究显示，对异质PSP毒素酶(heterologous PSP toxin-enzyme)复合体与提纯毒素的交叉反应结果比较，直接EIA方法通常比不直接的方法更为敏感。在抑制酶联免疫过滤测试(ELIFA)实验中，通过结合使用滤膜改变一下实验方法，就可以对毒素含量进行一个简单而又快速的测定。尽管交叉反应对neo STX不敏感，但可以检测到贝类组织中相当于或低于0.80μg.g-1组织水平时的STX、GTX2、GTX3、dc STX。
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目前已经生产出用于检测贝类组织中STX的商用试剂盒(RIDASCREENR R-Biopharm)。这种免疫测试隶属于联合实验，并与欧洲测试委员会及测试计划(BCR)的其他测定方法相对应(Van Egmond et al., 1994)。毫无疑问，对于未确定的交叉反应来说，在贝类组织细胞间质中存在其它PSP毒素时，ELISA方法过高估计了结合于其中的STX。这种方法对分析贝类提取物中STX或许是十分有用的，但仅被用于半定量分析。
3 免疫测试技术在DSP检测中的应用
腹泻性贝毒(DSP)为具有多个环状醚的脂肪酸衍生物，不溶于水，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿和乙醚等有机溶剂，属脂溶性物质，紫外线不吸收，对一般加热较为稳定。目前已发现的腹泻性贝毒至少有12种，其中9种结构已经确定，分为3类：大田软海绵酸(okadaic acid, OA)及其衍生物鳍藻毒素-1(dinophytoxins, DTX-1)、鳍藻毒素-3(DTX-3)；大环内酯—贝毒素-1(PTX-1)、扇贝毒素-2(PTX-2)、扇贝毒素-3(PTX-3)、扇贝毒素-6(PTX-6)；磺化毒物，虾夷扇贝毒素(Yessotoxin, YTX)及其衍生物45—OH YTX。
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腹泻性贝毒主要作用于酶系统，为肿瘤促进剂。可引起人类多种不适反应，对人的最小中毒量为12～18Mu(1Mu相当于3.2μgDTX-1)，DSP的毒性为LD50192×10-9。日本厚生省规定，贝类可食部分的毒力不得超过0.05Mu*g-1。其来源生物多为甲藻，如Dinophysis fortii, D. acuminota, Prorocentrum lima等[8,9]。
一些免疫诊断方法用于DSP毒性测定，如RIA(Levine et al., 1988)及ELISA(Chin et al., 1995)。所有混合抗体的制备都与单一腹泻源大田软海绵酸(OA)有关。用于OA测定的RIA〔3H〕标记竞争结合过程具有高度敏感性(检出限：0.2pmol OA)。相对水生生物毒素的变化，包括maitotoxin、aplysiatoxin、palytoxin、brevetoxin B及lyngbyatoxin A等，该反应显示非竞争抑制。但作为常规检测而言，该方法过于复杂和繁琐。
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用于OA定量分析的典型方法为ELISA法，该方法显示测定DSP毒性特别是DTX-1的交叉反应情况。尽管对其他衍生物的亲和性明显不同，DSP-check ELISA试剂盒(UBE Industries, Tokyo, Japan)已经被广泛用于检测DSP毒素(OA及DTX-1)。但在要求的检测限20ng*g-1，许多研究报告显示无论浮游植物或贝类样品都出现过包括假阳性反应的不一致性结果。DSP-check的单克隆抗体与DTX-1的交叉反应相当于OA水平，但PTX和YTX不发生反应(Usagawa et al., 1989)。 Riugier Bio-Rech ELISA试剂盒使用抗OA单克隆抗体及抗个体基因型抗体(anti-idiotypic antibody)在抗OA抗体的结合位上与OA相对应(Shestowsky et al., 1993)。DTX-1或DTX-2，以及OA的甲基、甲二醇和乙醇衍生物都可以与这种试剂盒中抗体相结合，但该抗体显示出对OA有较高灵敏性，而与DTX-3和短裸甲藻毒素-1(brevetoxin-1)根本不具备交叉反应。后一种测试试剂盒经过与DSP毒素其他测试方法(如HPLC和LC-MS)的广泛比较，被认为对贻贝组织提取液或是对浮游植物样品中OA含量的检测同样具有较高可信度(Chin et al., 1995)。
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4 免疫测试技术在NSP检测中的应用
神经性贝毒(NSP)主要因贝类摄食短裸甲藻(Gymnodinium breve, 1979年改称Ptychodiscus brevis)后在体内蓄积，被人食用后产生以麻痹为主要特征的食物中毒。从有毒藻类细胞中分离出9种神经性毒素成份，并已确定其中7种成份的化学结构，分别命名为短裸甲藻毒素B(BTXB)、短裸甲藻毒素C(BTXC)、GB3-6、PB-1。短裸甲藻毒素(Brevetoxin, BTX或PbTx)由11个反式相连的醚环形成的长链组成梯形结构，不含氮，为低熔点耐热固体，具高度脂溶性，难溶于中性和酸性水溶液中，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等有机溶剂和1%NaOH溶液中[8]。
短裸甲藻毒素可以引起鱼类的大量死亡，当在赤潮区周围吸入含有有毒藻类的气雾时，也会引起气喘、咳嗽和呼吸困难等中毒症状。其作用机理是在相当负电位时选择性地开放钠通道，并且抑制快速钠离子的失活而使细胞膜去极化。BTXB对小鼠的半致死量为5×10-7，BTXC对小鼠的半致死量为2.5×10-7。
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目前应用RIA方法检测与NSP相关的裸甲藻毒素(Baden et al., 1984； Levine and Shimizu, 1992)。现已制备出可靠的用于测试NSP组分的ELISA单克隆抗体(Trainer and Baden, 1991)。把这种单克隆分子与短裸甲藻毒素(PbTx)相联，由于它们表现出与CTX的一些交叉反应，可被用于非定量地检测毒素的归属。检测PbTx的RIA技术(Baden et al., 1995)是根据从复杂组分竞争替换〔3H〕-PbTx-3的抗体。在ELISA方法中，同样的抗-短裸甲藻毒素抗体在第一抗体与毒素结合后与兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶(rabbit anti-goat IgG-horseradish-peroxidase)联接。
Baden在最初实验时用牛血清蛋白(BSA)与PbTx-3相联形成抗原，并且发现这种血清与PbTx-2和PbTx-3出现竞争结合(Baden et al., 1984)，抗体也与无毒性的PbTx衍生物相联并具有同样的联结亲和性，因此测试结构比功能更加重要。当用KLH(钥孔碱血蓝素)作为BSA的替代品时，相对每fmol KLH约75～100fmol蛋白质比率的较高毒性可以产生出更为有效的抗体。
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研究认为根据两种不同抗—PbTx血清，无论使用自然产生或人工合成的短裸甲藻毒素衍生物对抗原表位识别的方法均显示单一抗体分析不适用于检测毒素的代谢情况(Poly et al., 1995)。目前已发展到使用多个特殊设计的抗体以确定不同范围聚醚阶层(polyether ladder)(Melinek et al., 1994)。
免疫方法除用于传染性疾病的诊断外，在变态反应性疾病、肿瘤、组织移植、免疫缺陷等诊断以及微量蛋白、微量激素、微量药物半抗原测定等诸多领域得到了广泛应用。具有特异性强、灵敏高度、方法简便等特点。针对当前有害藻华(Harmful Algal Bloom)发生频繁，藻类毒素和贝毒危害性大、检测困难、不易预防等特点，尤其对商检和卫生防疫部门来说，更需要有一个简便、快速、灵敏的方法对贝类及其他海洋生物进行检测，对其潜在危害作出判断，以促进经济发展，保障人类健康。免疫方法的应用和普及，无疑有着良好的应用前景。
* 国家“九五”重点科技攻关项目(96922010204)
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作者简介：郭皓，男，硕士，助理研究员
参考文献
[1] Hallegraeff G M. Manual on Harmful Marine Microalgae. UNESCO, France: IOC Manuals and Guides No. 33.1995.182—199
[2] 赵武述，陈仁，卞志强.现代临床免疫学.北京：人民军医出版社,1994.1—13
[3] 陈仁主编.免疫学基础.北京：人民卫生出版社，1982. 115—132
[4] Andersen P. Design and implementation of some harmful algal monitoring systems. UNESCO, France: IOC Technical Series, 1996.22
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[5] 王燕芳，周维善.石房蛤毒素.海洋科学，1994，(5)：55—58
[6] 华泽爱.赤潮毒素的成分及其危害.海洋与海岸带开发，1992，(9)2：52—59
[7] 丘建文.麻痹性贝毒研究概况.海洋环境科学，1991，(10)2：65—68
[8] 华泽爱.赤潮毒素的成分及其危害.海洋与海岸带开发，1992，(9)2：52—59
[9] 王菊英，关道明，韩庚晨.腹泻性贝毒素的分析方法研究.海洋环境科学，1996，(15)4：62—67
(1998-09-11收稿), 百拇医药
单位：国家海洋环境监测中心，大连 116023
关键词：免疫检测技术；藻毒素；贝毒
免疫方法在藻毒素及贝毒素检测中的应用摘要 有害藻类自身或通过食物链在鱼类、贝类等生物体内蓄积，对生物直至人类产生危害。藻类毒素和贝毒的检测方法要求快速、方便、准确，并且在其含量极微时即可检出以起到预警作用。免疫方法使之成为可能。本文介绍了免疫测试技术的基本原理及其在藻毒素和贝毒检测中的应用，总结了该方法的应用前景和不足之处，旨在常规检测中推广和普及免疫方法。
中图分类号 X834.02
The use of immunological methods for the detection of
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phycotoxin and shellfish toxin
Guo Hao
National Marine Environmental monitoring Center, Dalian 116023, China
Harmful algae can do great harm to organisms even to human through food chain by accumulating in shellfish and fish or by themselves. The immunological examination technique is fast, easy and accurate even in trace amount of phycotoxin and shellfish toxin. The theory of immunological diagnosis as well as the prospect and defect of these methods and their application in phycotoxin and shellfish toxin determination are introduced. The method deserves spreading and using in routine monitoring program.
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Key words: immunological examination, phycotoxin, shellfish toxin
海洋中有毒藻类的爆发性增殖或通过食物链的转化可能对海洋生态环境、水产养殖业和人类健康安全产生直接或间接的危害。有毒藻类自身或通过在鱼、虾、贝类等海洋生物体内的蓄积可产生多种毒素，其中危害性较大的几种毒素分别是麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、神经性贝毒(NSP)、西加鱼毒素(CTX)、遗忘症贝毒(ASP)等。贝毒危害具有突然性和广泛性，其特点为防治困难、毒性大、反应快、无适宜解药等。目前世界各国对藻类毒素和贝毒的分析采用了许多先进技术和方法，如层析，高效液相色谱，质谱及X—射线衍射等确定了一些毒素的结构和组成，此外免疫方法也被广泛应用于赤潮毒素检测。该方法具有快速、准确、便利的特点，利用抗原—抗体反应确定毒素类型及含量。在哺乳动物系统中，当某一特定藻毒素的高敏感毒性达到一个合适的抗体效价时，免疫反应变得十分复杂。这种免疫测试的敏感性要比相应的鼠生物测试法或HPLC方法敏感得多——甚至检测毒素的数量在pg级(10-12g)[1]。
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1 免疫与免疫测试技术
免疫(immunity)指机体识别和排除抗原性异物，即机体区分自身与异己的功能，包括防御、自身稳定和免疫监测三个部分[2]。免疫方法包括ELISA(酶联免疫吸附检测)、RIA(放射免疫分析)、EIA(竞争性酶免疫分析)及S-PIA法(固态免疫珠检测)等。免疫检测有许多不同类型的分析方法，如直接和间接配对法(竞争交叉反应)、双抗体“夹心”法检测等。免疫分析检测系统通常采用放射性标记(RIA)、荧光标记(FIA)，免疫电子显微镜法等，也可使用其他检测模式，如化学发光法[1，3]。
用于毒素和贝毒检测的免疫方法为生物体外测试法，以抗原—抗体特异性反应作基础，其中包括凝集反应、沉淀反应、补体参与反应等[3]。其原理是根据将诸如兔子等暴露毒素中，以功能性抗原刺激兔子产生抗体，然后从兔血清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的藻类毒素或匀浆后的贝类组织(如贻贝)暴露于标记物，然后检测抗血清—抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素含量[4]。
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近十年来，用于藻毒素及贝毒检测的免疫方法得到迅速发展，已有多种可靠的免疫诊断试剂盒用于分析不同的藻毒素。但由于缺乏与之相关的提纯毒素，以及难以从相应的小分子毒素如石房蛤毒素(STX)和软骨藻酸(domoic acid)中提取稳定的免疫抗原而限制了该研究的发展。IOC(政府间海洋组织)对免疫测试技术在藻类毒素及贝毒检测中的发展和不足作了较详细的介绍[1]，本文就免疫测试技术在PSP、DSP和NSP检测中的应用进行探讨。
用于藻毒素检测的免疫分析由单克隆抗体或多克隆抗体所制备。通常多克隆抗体比单克隆抗体的生产更加快速而且价廉，对复杂表位具有较高的亲和力，可以得出异源性广谱分析，即与相应抗原更广泛的交叉反应。单克隆抗体产生于一个永久性的细胞谱系，尽管比它们的多谱系副本稳定性略低，但能以较低的变异性连续产生，更加适用于单一表位的检测。
免疫测试反应中，具有较少内源性抗原活性(半抗原)的低分子量组分在接种前必须与某一载体(通常为蛋白质)相结合。与免疫反应相关的毒素主要来源于单个容易得到的衍生物，其中可产生毒素的浮游植物和被影响的目标生物通常有着必然的联系。在免疫方法的发展过程中，交叉反应十分重要。
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2 免疫测试技术在PSP检测中的应用
麻痹性贝毒(PSP)是一类烷基氢化嘌呤化合物，类似于具有两个胍基的嘌呤核，为非结晶、水溶性、高极性、不挥发的小分子物质，在酸性条件下稳定，碱性条件下发生氧化，毒性消失；毒素遇热稳定，并不被人的消化酶所破坏。目前已分离出18种毒素，依基团的相似性分为3类：石房蛤毒素(saxtoxins, STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝沟藻毒素(gonyautoxins, GTX1—GTX10)及脱氨甲酰基石房蛤毒素(carbamyl-N-sulfo compounds, dcSTX)，其中毒性最强的为STX、neo STX、GTX1、GTX3和dcSTX(>1300Mu.μmol-1)，但其他几种毒素很容易水解成毒性成份。其来源生物均为甲藻，如Gonyaulax catenella, Alexandrium tamarense, Peridinium foliaceum, Pyrodinium bahamense var. Compressa等。
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麻痹性贝毒是一类神经肌肉麻痹剂，其毒理作用为阻断细胞钠离子通道，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。对人体的中毒量为600～5000Mu，致死量为3000～30000Mu，目前尚无对症解毒剂。PSP的毒性为LD503.4×10-9。联合国卫生组织规定，100g贝类可食部分的PSP毒力超过80μg(400Mu)时不得食用[5～8]。
早期生产的STX多克隆抗血清使用小牛血清白蛋白作为蛋白质载体，其稳定性和活性较低。一些文献描述RIA方法(Carlson et al. ,1985)和ELISA方法(Chu and Fan, 1985； Davio et al. ,1985)使用不同的交联剂及STX衍生物产生抗体。上述所有方法都只是使用STX或其化学合成衍生物(如saxitoxinol)产生抗体。在评价与其他PSP毒素的交叉反应能力方面，大多数免疫分析的不足之处关键在于与neoSTX的交叉反应能力较弱(Carlson et al., 1984; Chu and Fan, 1985)。
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根据STX多克隆抗体检测PSP毒素所使用的吸附一抑制ELISA技术，是由STX半抗原与一种多肽聚丙氨酸—赖氨酸(Pal)化学合成载体共价耦联进行制备的(Cembella et al., 1990)。快速诊断免疫检测试剂盒(SAXITOXIN TESTR， Institut Armand-Frappier)已是一个成型的商业产品，该分析是将一定数量的STX固定于聚苯乙烯棒上，在有毒样品—抗体培养混合物中竞争性地联结自由STX抗体。其后该棒在辣根过氧化物酶(HPR)的结合下培养，在装有酶底物溶液的透明容器(如小试管)中反应生成有色产物。这种有色物质的吸光度(OD)可用分光光度法在450nm处测定。显色程度与STX浓度成反比(即：吸光度为0时，表示完全为STX吸附；>STXeq >0.64μg/g贝类组织)。具有较高毒性的样品按AOAC(1984)推荐方法在反应缓冲液中进行系列稀释。
STX多克隆抗体与SAXITOXIN TESTR试剂盒的反应结果显示出相对广泛的抗原特性，并最少与两种膝沟藻毒素(GTX2、GTX3)的交叉反应良好，但与低含量的dcSTX没有交叉反应(Cembella et al., 1990)。与不同纯化程度的氨基甲酸酯毒素(carbamate)5分钟接合的亲和性(相对STX)表示如下：GTX3(87%)，GTX2(74%)，NEO(60%)。这种交叉反应模式提示首先通过胍基与中心核相连发生结合反应，胍环N-1，2，3与N-7，8，9作为抗体结合反应的识别位，dcSTX的N-21位置的SO2-3组分阻断与抗体的联系，这种与dcSTX缺乏交叉反应的情况对总毒素含量(μg, STXeq)的测定不是关键问题，这是因为这些衍生物实际上很少比氨基甲酸酯毒素有效，并且它们可以在分析之前水解成氨基甲酸酯类似物。其它生物毒素包括软骨藻酸、大田软海绵酸(okadaic acid)及staphylococcus内毒素B等在这种免疫分析中不具备交叉反应。
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与使用HPLC-FD法和AOAC常规鼠生物测定法对有毒贝类毒性测试结果相比，SAXITOXIN TE STR试剂盒在毒素含量低于STXeq2μg/g贝类组织时所得出的可比结果没有假阳性反应。这种多克隆抗体对实验室内培养的浮游植物中PSP检测十分有用，包括从温带和亚热带海区分离出来的涡鞭毛藻，其中Alexandrium sp为浮游植物自然种群组成中的优势种(Cembella and Lamoureux, 1993)。
在类型测试实验中，由多克隆抗—STX抗体制备的直接EIA，通过将STX与辣根过氧化物酶结合，以较高的灵敏性检测贝类组织中STX(3～4ng*g-1组织)(Usleber et al., 1991)。更进一步的研究显示，对异质PSP毒素酶(heterologous PSP toxin-enzyme)复合体与提纯毒素的交叉反应结果比较，直接EIA方法通常比不直接的方法更为敏感。在抑制酶联免疫过滤测试(ELIFA)实验中，通过结合使用滤膜改变一下实验方法，就可以对毒素含量进行一个简单而又快速的测定。尽管交叉反应对neo STX不敏感，但可以检测到贝类组织中相当于或低于0.80μg.g-1组织水平时的STX、GTX2、GTX3、dc STX。
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目前已经生产出用于检测贝类组织中STX的商用试剂盒(RIDASCREENR R-Biopharm)。这种免疫测试隶属于联合实验，并与欧洲测试委员会及测试计划(BCR)的其他测定方法相对应(Van Egmond et al., 1994)。毫无疑问，对于未确定的交叉反应来说，在贝类组织细胞间质中存在其它PSP毒素时，ELISA方法过高估计了结合于其中的STX。这种方法对分析贝类提取物中STX或许是十分有用的，但仅被用于半定量分析。
3 免疫测试技术在DSP检测中的应用
腹泻性贝毒(DSP)为具有多个环状醚的脂肪酸衍生物，不溶于水，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿和乙醚等有机溶剂，属脂溶性物质，紫外线不吸收，对一般加热较为稳定。目前已发现的腹泻性贝毒至少有12种，其中9种结构已经确定，分为3类：大田软海绵酸(okadaic acid, OA)及其衍生物鳍藻毒素-1(dinophytoxins, DTX-1)、鳍藻毒素-3(DTX-3)；大环内酯—贝毒素-1(PTX-1)、扇贝毒素-2(PTX-2)、扇贝毒素-3(PTX-3)、扇贝毒素-6(PTX-6)；磺化毒物，虾夷扇贝毒素(Yessotoxin, YTX)及其衍生物45—OH YTX。
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腹泻性贝毒主要作用于酶系统，为肿瘤促进剂。可引起人类多种不适反应，对人的最小中毒量为12～18Mu(1Mu相当于3.2μgDTX-1)，DSP的毒性为LD50192×10-9。日本厚生省规定，贝类可食部分的毒力不得超过0.05Mu*g-1。其来源生物多为甲藻，如Dinophysis fortii, D. acuminota, Prorocentrum lima等[8,9]。
一些免疫诊断方法用于DSP毒性测定，如RIA(Levine et al., 1988)及ELISA(Chin et al., 1995)。所有混合抗体的制备都与单一腹泻源大田软海绵酸(OA)有关。用于OA测定的RIA〔3H〕标记竞争结合过程具有高度敏感性(检出限：0.2pmol OA)。相对水生生物毒素的变化，包括maitotoxin、aplysiatoxin、palytoxin、brevetoxin B及lyngbyatoxin A等，该反应显示非竞争抑制。但作为常规检测而言，该方法过于复杂和繁琐。
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用于OA定量分析的典型方法为ELISA法，该方法显示测定DSP毒性特别是DTX-1的交叉反应情况。尽管对其他衍生物的亲和性明显不同，DSP-check ELISA试剂盒(UBE Industries, Tokyo, Japan)已经被广泛用于检测DSP毒素(OA及DTX-1)。但在要求的检测限20ng*g-1，许多研究报告显示无论浮游植物或贝类样品都出现过包括假阳性反应的不一致性结果。DSP-check的单克隆抗体与DTX-1的交叉反应相当于OA水平，但PTX和YTX不发生反应(Usagawa et al., 1989)。 Riugier Bio-Rech ELISA试剂盒使用抗OA单克隆抗体及抗个体基因型抗体(anti-idiotypic antibody)在抗OA抗体的结合位上与OA相对应(Shestowsky et al., 1993)。DTX-1或DTX-2，以及OA的甲基、甲二醇和乙醇衍生物都可以与这种试剂盒中抗体相结合，但该抗体显示出对OA有较高灵敏性，而与DTX-3和短裸甲藻毒素-1(brevetoxin-1)根本不具备交叉反应。后一种测试试剂盒经过与DSP毒素其他测试方法(如HPLC和LC-MS)的广泛比较，被认为对贻贝组织提取液或是对浮游植物样品中OA含量的检测同样具有较高可信度(Chin et al., 1995)。
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4 免疫测试技术在NSP检测中的应用
神经性贝毒(NSP)主要因贝类摄食短裸甲藻(Gymnodinium breve, 1979年改称Ptychodiscus brevis)后在体内蓄积，被人食用后产生以麻痹为主要特征的食物中毒。从有毒藻类细胞中分离出9种神经性毒素成份，并已确定其中7种成份的化学结构，分别命名为短裸甲藻毒素B(BTXB)、短裸甲藻毒素C(BTXC)、GB3-6、PB-1。短裸甲藻毒素(Brevetoxin, BTX或PbTx)由11个反式相连的醚环形成的长链组成梯形结构，不含氮，为低熔点耐热固体，具高度脂溶性，难溶于中性和酸性水溶液中，能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯、二硫化碳等有机溶剂和1%NaOH溶液中[8]。
短裸甲藻毒素可以引起鱼类的大量死亡，当在赤潮区周围吸入含有有毒藻类的气雾时，也会引起气喘、咳嗽和呼吸困难等中毒症状。其作用机理是在相当负电位时选择性地开放钠通道，并且抑制快速钠离子的失活而使细胞膜去极化。BTXB对小鼠的半致死量为5×10-7，BTXC对小鼠的半致死量为2.5×10-7。
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目前应用RIA方法检测与NSP相关的裸甲藻毒素(Baden et al., 1984； Levine and Shimizu, 1992)。现已制备出可靠的用于测试NSP组分的ELISA单克隆抗体(Trainer and Baden, 1991)。把这种单克隆分子与短裸甲藻毒素(PbTx)相联，由于它们表现出与CTX的一些交叉反应，可被用于非定量地检测毒素的归属。检测PbTx的RIA技术(Baden et al., 1995)是根据从复杂组分竞争替换〔3H〕-PbTx-3的抗体。在ELISA方法中，同样的抗-短裸甲藻毒素抗体在第一抗体与毒素结合后与兔抗羊IgG-辣根过氧化物酶(rabbit anti-goat IgG-horseradish-peroxidase)联接。
Baden在最初实验时用牛血清蛋白(BSA)与PbTx-3相联形成抗原，并且发现这种血清与PbTx-2和PbTx-3出现竞争结合(Baden et al., 1984)，抗体也与无毒性的PbTx衍生物相联并具有同样的联结亲和性，因此测试结构比功能更加重要。当用KLH(钥孔碱血蓝素)作为BSA的替代品时，相对每fmol KLH约75～100fmol蛋白质比率的较高毒性可以产生出更为有效的抗体。
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研究认为根据两种不同抗—PbTx血清，无论使用自然产生或人工合成的短裸甲藻毒素衍生物对抗原表位识别的方法均显示单一抗体分析不适用于检测毒素的代谢情况(Poly et al., 1995)。目前已发展到使用多个特殊设计的抗体以确定不同范围聚醚阶层(polyether ladder)(Melinek et al., 1994)。
免疫方法除用于传染性疾病的诊断外，在变态反应性疾病、肿瘤、组织移植、免疫缺陷等诊断以及微量蛋白、微量激素、微量药物半抗原测定等诸多领域得到了广泛应用。具有特异性强、灵敏高度、方法简便等特点。针对当前有害藻华(Harmful Algal Bloom)发生频繁，藻类毒素和贝毒危害性大、检测困难、不易预防等特点，尤其对商检和卫生防疫部门来说，更需要有一个简便、快速、灵敏的方法对贝类及其他海洋生物进行检测，对其潜在危害作出判断，以促进经济发展，保障人类健康。免疫方法的应用和普及，无疑有着良好的应用前景。
* 国家“九五”重点科技攻关项目(96922010204)
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作者简介：郭皓，男，硕士，助理研究员
参考文献
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[3] 陈仁主编.免疫学基础.北京：人民卫生出版社，1982. 115—132
[4] Andersen P. Design and implementation of some harmful algal monitoring systems. UNESCO, France: IOC Technical Series, 1996.22
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[5] 王燕芳，周维善.石房蛤毒素.海洋科学，1994，(5)：55—58
[6] 华泽爱.赤潮毒素的成分及其危害.海洋与海岸带开发，1992，(9)2：52—59
[7] 丘建文.麻痹性贝毒研究概况.海洋环境科学，1991，(10)2：65—68
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[9] 王菊英，关道明，韩庚晨.腹泻性贝毒素的分析方法研究.海洋环境科学，1996，(15)4：62—67
(1998-09-11收稿), 百拇医药