c－fos基因在乐果中毒后肌无力大鼠肌组织中的表达*
作者：杨东仁 牛 勇 何凤生
单位：中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050
关键词：骨骼肌；即刻早期基因；聚合酶链式反应；乐果
卫生研究/990203
摘要 采用RT-PCR、Western Blot技术，检测了有机磷农药乐果对大鼠骨骼肌细胞中即刻早期反应基因c-fos表达的影响。结果表明，在乐果作用下，骨骼肌细胞c-fos基因表达在mRNA以及蛋白质水平均明显增高。然而骨骼肌细胞c-fos的表达是否与毒物刺激有关，其在农药中毒机制上的生物学意义有待深入研究。
中图分类号 Q593.9 R595.4
Effect of dimethoate on the expression of c-fos gene in skeletal muscle
, http://www.100md.com
Yang Dongren,Niu Yong,He Fengsheng
Institute of Occupational Medicine,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China
To elucidate the effect of organophosphate pesticides on the expression of immediate early gene in skeletal muscle,the concentrations of c-fos mRNA and protein were measured by RT-PCR and western dot blot techniques.The result showed that c-fos mRNA and protein were significantly increased in skeletal muscle of rat after dosing with dimethoate.These results indicated that c-fos might act as transcription factor and regulate other gene expression during the early period of organophosphate intoxication.
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Key words:immediate early gene, skeletal muscle, polymerase, chain reaction, dimethoate
即刻早期反应基因(IEG)是原核及真核细胞中的一类进化上高度保守的基因。在生理状态下，基因的开放与正常的生理需要有关，控制着细胞生长或分化信号；而在应激状态下，这些基因表达的蛋白在生物体耐受性及应激能力的提高上具有重要的作用[1]。c-fos作为细胞早期快速反应基因家族的重要成员，在受到外界刺激后，其产物c-fos蛋白作为第三信使，调控着下游基因即慢速反应基因的表达，从而产生细胞效应。有机磷农药是世界上广泛使用的一类农药，关于其毒作用机制已有较多研究。为研究在农药作用下，骨骼肌即刻早期反应基因c-fos表达的改变，本研究采用RT-PCR、Western Blot技术，在整体水平上观察了农药对这类基因表达的影响。
1 材料与方法
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1.1 动物与分组
健康、雄性Wistar大鼠，体重200～250g，由中国医学科学院实验动物中心提供。常规饲养一周，以适应环境。实验前依据体重将其随机分为3组(正常组、中毒1小时组、中毒48小时组)，每组5只。实验时腹腔一次注射染毒，剂量为350mg/kg。对照组腹腔注射等体积无菌生理盐水。
1.2 试剂
乐果购自上海农药厂，原粉浓度98.6%，DMSO溶解，4℃避光保存。兔抗鼠c-fos多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG\,辣根过氧化酶标记的链霉亲和素以及封闭用血清(皆购自北京中山生物工程公司)。c-fos PCR forward primer:5′-ACC AGC CCA GAC CTG CAG TGG-3′，PCR reverse primer:5′-CCG GCA CTT GGC TGC AGC CAT-3′(由美国赛百盛公司合成)。
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1.3 动物肌无力模型评价
采用(1)倾斜板法(Inclined plane method)[2]：将大鼠放在一平滑的木板上，头向持板者。将板逐渐抬高，10秒钟抬高90°，直到动物滑下，重复5次。肌无力程度以抬高的角度来表示。(2)攀网法(traction test)[2]：将大白鼠放于水平金属网上(金属丝2mm),然后将网垂直放置，如3秒钟动物跌落，则判定为肌无力。(3)参照De Bleeker的标准对大鼠急性乐果中毒后的肌无力症状评分[3]。
1.4 RT-PCR检测c-fos mRNA表达
异硫氰酸胍热酚法提取腓肠肌总RNA。取5μg总RNA中加入125ng oliga d(T)15，70℃水浴5min之后迅速置于冰浴中。加入M-MLV缓冲液15μl(含250mmol/L Tris-HCl,pH8.3；375mmol/L KCl;15mmol/L MgCl2;50mmol/L DTT)，dNTP 0.5mmol/L,Rnasin 75μmol/min,M-MLV逆转录酶600μmol/min,加入双蒸水至75μl。42℃水浴1小时，所得cDNA样品保存于-20℃。将所得cDNA按一定比例稀释后进行PCR反应。其中cDNA 15μl,引物0.1μmol/L，缓冲液20mmol/L,dNTP 0.2mmol/L,Taq聚合酶2μmol/min,3μl MgCl2，加双蒸水至50μl。之后按下列程序进行PCR循环：95℃预变性5min；94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,2个循环后将退火温度改为63℃、60℃、58℃各进行2个循环，之后退火温度设定为55℃循环22次。72℃再延伸10min。同时设空白对照。实验前进行预试验使PCR扩增在指数增长期。PCR产物直接进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外透射反射仪拍照。
, 百拇医药
1.5 Western Dot Blot分析c-fos
Western Dot Blot定量参照文献[4]，并作适当改进。将裂解缓冲液(500mmol/L Tris-HCl,0.1%SDS，0.2mmol/L PMSF,10mmol/L DTT，4%巯基乙醇，10%甘油，pH7.4)加入组织中，冰浴20分钟后匀浆。于4℃，15000 r/min离心10min，取上清液，考马斯亮兰法测定蛋白含量。每个样品取20μg总蛋白，加入等体积样品缓冲液(4mol/L脲，50mmol/L Tris-HCl,pH7.2)，37℃振摇4小时。样品抽滤点样于硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入1∶250稀释的兔抗鼠c-fos多克隆抗体，37℃温育2小时，PBS洗膜，加入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶250)，37℃下温育振荡1小时，PBS洗膜。加入辣根过氧化酶标记的链霉亲和素，37℃温育振荡1小时，PBS洗膜，DAB显色。
2 结果
, 百拇医药
2.1 c-fos的RT-PCR扩增
凝胶电泳结果显示，本研究所选用引物特异性很好，所得PCR产物单一，长度为267bp。乐果染毒后1小时PCR扩增产物经电泳可见一明显条带，中毒48小时，PCR扩增产物量与正常对照组未见差异(图1)。
图1 c-fos的RT-PCR扩增结果
图2 Western Dot Blot检测c-fos蛋白表达水平
2.2 Western Dot Blot测定
结果表明，乐果中毒后1小时，肌无力大鼠肌肉组织中c-fos蛋白表达显著升高，而48小时c-fos表达水平与对照组未见差异(图2)。
, 百拇医药
3 讨论
哺乳动物细胞的信号传导和基因表达与IEG关系密切[1，5]。c-fos作为细胞早期快速反应基因家族的重要成员，在受到外界刺激后，其产物c-fos蛋白作为第三信使，调控着下游基因即慢速反应基因的表达。因而c-fos在细胞的正常生长中有重要的作用，它偶联细胞外信息与细胞内靶基因的转录。乐果是我国生产量大，使用面广的一种有机磷农药，文献报道乐果中毒与肌无力发生密切相关，因而本研究选择乐果作为受试物，在整体水平初步探讨了乐果对肌无力大鼠骨骼肌IEG基因表达的影响。RT-PCR以及Western Dot Blot结果均显示，乐果作用1小时即可引起c-fos表达升高，而后这一作用减弱，至48小时，与对照组差别消失。结果表明，有机磷农药的刺激可以快速诱导c-fos的表达。
乐果中毒乐可导致大鼠肌无力，研究表明这种作用主要是由于神经肌接头突触后传导阻滞所致[6]。烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)是突触后膜的主要受体，文献报道乐果可以直接阻断nAChR通道[7]。因而乐果中毒后肌无力的产生是否与nAChR的结构与功能改变有关?nAChR的表达及其功能改变是否受c-fos基因的调控?c-fos表达的机制是什么?其与nAChR表达有何关联?这些均有待实验的进一步研究。
, http://www.100md.com
* 国家九五科技攻关资助项目(96-906-04-11)
作者简介：杨东仁，男，博士
参考文献
[1] 吴希如，陈清棠编.神经系统疾病的分子生物学基础.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995 89—95
[2] 徐叔云编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1994.641—644
[3] DE Bleeker JL,Wilems J,DE Reuck J,et al.Histological and histochemical study of paraoxon myopathy in the rat.Acta Neurol Belg,1991,91:255—270
, 百拇医药
[4] 龚鹏飞，张国高，吴植恩，等.石英尘作用下肺泡巨噬细胞HSP70及其mRNA水平的变化.中华劳动卫生职业病杂志，1996，6：344—346
[5] 徐策智，蒋星红.快反应基因在神经科学研究中的进展与动态.生理科学进展，1997，28：49—51
[6] He FS,Xu HB,Qin F,et al.Intermediate myasthenia syndrome following acute organo phosphate poisoning-an analysis of 21 cases.Hum Exper Toxicol,1998,17:40—45
[7] 徐海滨，贺锡雯，谢佐平，等.有机磷杀虫剂对乙酰胆碱受体通道的阻断作用.卫生研究，1997，(26)3：154—158
(1998-06-15收稿), http://www.100md.com
单位：中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050
关键词：骨骼肌；即刻早期基因；聚合酶链式反应；乐果
卫生研究/990203
摘要 采用RT-PCR、Western Blot技术，检测了有机磷农药乐果对大鼠骨骼肌细胞中即刻早期反应基因c-fos表达的影响。结果表明，在乐果作用下，骨骼肌细胞c-fos基因表达在mRNA以及蛋白质水平均明显增高。然而骨骼肌细胞c-fos的表达是否与毒物刺激有关，其在农药中毒机制上的生物学意义有待深入研究。
中图分类号 Q593.9 R595.4
Effect of dimethoate on the expression of c-fos gene in skeletal muscle
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Yang Dongren,Niu Yong,He Fengsheng
Institute of Occupational Medicine,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China
To elucidate the effect of organophosphate pesticides on the expression of immediate early gene in skeletal muscle,the concentrations of c-fos mRNA and protein were measured by RT-PCR and western dot blot techniques.The result showed that c-fos mRNA and protein were significantly increased in skeletal muscle of rat after dosing with dimethoate.These results indicated that c-fos might act as transcription factor and regulate other gene expression during the early period of organophosphate intoxication.
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Key words:immediate early gene, skeletal muscle, polymerase, chain reaction, dimethoate
即刻早期反应基因(IEG)是原核及真核细胞中的一类进化上高度保守的基因。在生理状态下，基因的开放与正常的生理需要有关，控制着细胞生长或分化信号；而在应激状态下，这些基因表达的蛋白在生物体耐受性及应激能力的提高上具有重要的作用[1]。c-fos作为细胞早期快速反应基因家族的重要成员，在受到外界刺激后，其产物c-fos蛋白作为第三信使，调控着下游基因即慢速反应基因的表达，从而产生细胞效应。有机磷农药是世界上广泛使用的一类农药，关于其毒作用机制已有较多研究。为研究在农药作用下，骨骼肌即刻早期反应基因c-fos表达的改变，本研究采用RT-PCR、Western Blot技术，在整体水平上观察了农药对这类基因表达的影响。
1 材料与方法
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1.1 动物与分组
健康、雄性Wistar大鼠，体重200～250g，由中国医学科学院实验动物中心提供。常规饲养一周，以适应环境。实验前依据体重将其随机分为3组(正常组、中毒1小时组、中毒48小时组)，每组5只。实验时腹腔一次注射染毒，剂量为350mg/kg。对照组腹腔注射等体积无菌生理盐水。
1.2 试剂
乐果购自上海农药厂，原粉浓度98.6%，DMSO溶解，4℃避光保存。兔抗鼠c-fos多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG\,辣根过氧化酶标记的链霉亲和素以及封闭用血清(皆购自北京中山生物工程公司)。c-fos PCR forward primer:5′-ACC AGC CCA GAC CTG CAG TGG-3′，PCR reverse primer:5′-CCG GCA CTT GGC TGC AGC CAT-3′(由美国赛百盛公司合成)。
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1.3 动物肌无力模型评价
采用(1)倾斜板法(Inclined plane method)[2]：将大鼠放在一平滑的木板上，头向持板者。将板逐渐抬高，10秒钟抬高90°，直到动物滑下，重复5次。肌无力程度以抬高的角度来表示。(2)攀网法(traction test)[2]：将大白鼠放于水平金属网上(金属丝2mm),然后将网垂直放置，如3秒钟动物跌落，则判定为肌无力。(3)参照De Bleeker的标准对大鼠急性乐果中毒后的肌无力症状评分[3]。
1.4 RT-PCR检测c-fos mRNA表达
异硫氰酸胍热酚法提取腓肠肌总RNA。取5μg总RNA中加入125ng oliga d(T)15，70℃水浴5min之后迅速置于冰浴中。加入M-MLV缓冲液15μl(含250mmol/L Tris-HCl,pH8.3；375mmol/L KCl;15mmol/L MgCl2;50mmol/L DTT)，dNTP 0.5mmol/L,Rnasin 75μmol/min,M-MLV逆转录酶600μmol/min,加入双蒸水至75μl。42℃水浴1小时，所得cDNA样品保存于-20℃。将所得cDNA按一定比例稀释后进行PCR反应。其中cDNA 15μl,引物0.1μmol/L，缓冲液20mmol/L,dNTP 0.2mmol/L,Taq聚合酶2μmol/min,3μl MgCl2，加双蒸水至50μl。之后按下列程序进行PCR循环：95℃预变性5min；94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,2个循环后将退火温度改为63℃、60℃、58℃各进行2个循环，之后退火温度设定为55℃循环22次。72℃再延伸10min。同时设空白对照。实验前进行预试验使PCR扩增在指数增长期。PCR产物直接进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外透射反射仪拍照。
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1.5 Western Dot Blot分析c-fos
Western Dot Blot定量参照文献[4]，并作适当改进。将裂解缓冲液(500mmol/L Tris-HCl,0.1%SDS，0.2mmol/L PMSF,10mmol/L DTT，4%巯基乙醇，10%甘油，pH7.4)加入组织中，冰浴20分钟后匀浆。于4℃，15000 r/min离心10min，取上清液，考马斯亮兰法测定蛋白含量。每个样品取20μg总蛋白，加入等体积样品缓冲液(4mol/L脲，50mmol/L Tris-HCl,pH7.2)，37℃振摇4小时。样品抽滤点样于硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，加入1∶250稀释的兔抗鼠c-fos多克隆抗体，37℃温育2小时，PBS洗膜，加入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶250)，37℃下温育振荡1小时，PBS洗膜。加入辣根过氧化酶标记的链霉亲和素，37℃温育振荡1小时，PBS洗膜，DAB显色。
2 结果
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2.1 c-fos的RT-PCR扩增
凝胶电泳结果显示，本研究所选用引物特异性很好，所得PCR产物单一，长度为267bp。乐果染毒后1小时PCR扩增产物经电泳可见一明显条带，中毒48小时，PCR扩增产物量与正常对照组未见差异(图1)。
图1 c-fos的RT-PCR扩增结果
图2 Western Dot Blot检测c-fos蛋白表达水平
2.2 Western Dot Blot测定
结果表明，乐果中毒后1小时，肌无力大鼠肌肉组织中c-fos蛋白表达显著升高，而48小时c-fos表达水平与对照组未见差异(图2)。
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3 讨论
哺乳动物细胞的信号传导和基因表达与IEG关系密切[1，5]。c-fos作为细胞早期快速反应基因家族的重要成员，在受到外界刺激后，其产物c-fos蛋白作为第三信使，调控着下游基因即慢速反应基因的表达。因而c-fos在细胞的正常生长中有重要的作用，它偶联细胞外信息与细胞内靶基因的转录。乐果是我国生产量大，使用面广的一种有机磷农药，文献报道乐果中毒与肌无力发生密切相关，因而本研究选择乐果作为受试物，在整体水平初步探讨了乐果对肌无力大鼠骨骼肌IEG基因表达的影响。RT-PCR以及Western Dot Blot结果均显示，乐果作用1小时即可引起c-fos表达升高，而后这一作用减弱，至48小时，与对照组差别消失。结果表明，有机磷农药的刺激可以快速诱导c-fos的表达。
乐果中毒乐可导致大鼠肌无力，研究表明这种作用主要是由于神经肌接头突触后传导阻滞所致[6]。烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)是突触后膜的主要受体，文献报道乐果可以直接阻断nAChR通道[7]。因而乐果中毒后肌无力的产生是否与nAChR的结构与功能改变有关?nAChR的表达及其功能改变是否受c-fos基因的调控?c-fos表达的机制是什么?其与nAChR表达有何关联?这些均有待实验的进一步研究。
, http://www.100md.com
* 国家九五科技攻关资助项目(96-906-04-11)
作者简介：杨东仁，男，博士
参考文献
[1] 吴希如，陈清棠编.神经系统疾病的分子生物学基础.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995 89—95
[2] 徐叔云编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1994.641—644
[3] DE Bleeker JL,Wilems J,DE Reuck J,et al.Histological and histochemical study of paraoxon myopathy in the rat.Acta Neurol Belg,1991,91:255—270
, 百拇医药
[4] 龚鹏飞，张国高，吴植恩，等.石英尘作用下肺泡巨噬细胞HSP70及其mRNA水平的变化.中华劳动卫生职业病杂志，1996，6：344—346
[5] 徐策智，蒋星红.快反应基因在神经科学研究中的进展与动态.生理科学进展，1997，28：49—51
[6] He FS,Xu HB,Qin F,et al.Intermediate myasthenia syndrome following acute organo phosphate poisoning-an analysis of 21 cases.Hum Exper Toxicol,1998,17:40—45
[7] 徐海滨，贺锡雯，谢佐平，等.有机磷杀虫剂对乙酰胆碱受体通道的阻断作用.卫生研究，1997，(26)3：154—158
(1998-06-15收稿), http://www.100md.com