食品中分离的李斯特氏菌的致病基因分析*
作者：付萍 冉陆 李志刚 姚景慧 赵熙 杨瑞馥 郭兆彪
单位：卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021
关键词：李斯持氏菌；内化素基因；李氏溶血素基因
卫生研究\990417 摘要 1996—1997年作者对全国12个省市的7类食品共3746份进行了李斯特氏菌的污染调查，共分离出李斯特氏菌165株。用PCR技术对分离菌株中李斯特氏菌的2种主要致病因子李氏溶血素O和内化素的基因进行了检测，其中57株仅有内化素基因，27株同时具有内化素基因和李氏溶血素O基因。两种致病基因均未检出的共有81株。本研究说明判断单增李氏菌的主要指标是小鼠毒力试验阳性而不是其溶血反应，同时检测溶血素O和内化素2种基因对单增李氏菌有鉴别意义。
中图分类号 R155.31 Q319.3
, 百拇医药
Pathogenic gene analysis of Listeria isolated from foods
Fu Ping,Ran Lu,Li Zhigang,Yao Jinghui,Zhao Xi.et al.
Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China
In 1996～1997,Listeria in foods from 12 provinces of China were detected by using the national standard examination method GB 4789.30-94(routine traditional methods).Twenty four strains Listeria monocytogenes and 141 strains Listeria were identified by biochemical procedures and animal toxicity experiment.Polymerase Chain Reaction(PCR) was used to amplify two specific DNA fragments(719bp and 446bp) of listeriolysin O and internalin genes with two pares of primer—Hly1-2 and Inl1-2,respectively.The experiment results showed that 57 strains contained only internalin,27 strains contained both internalin and listeriolysin O from the pathogenic genes of isolated strains.
, 百拇医药
Key words: Listeria, Internalin genes, Listeriolysin O genes
单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes简称单增李斯特氏菌，L.m)是重要的食源性疾病的病原菌，可引起人类菌血症，脑膜炎等症状。该菌在自然界分布广泛，不易被寒冷日晒等强烈因素所杀灭，多种食品均受到不同程度的污染。美国在1979～1985年间发生的三次大的食物中毒，均因该菌污染低温杀菌全脂牛奶、生蔬菜和奶制品引起，中毒者死亡率在30%左右[1]，我国虽然未见报道L.m食物中毒，但从冰淇淋、熟肉制品中曾检出L.m，说明存在发生食物中毒的潜在危险[2]。
单增李斯特氏菌已知的致病因子有多种：李氏溶血素O(Listeriolysin O)、内化素(Internalin)、增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等[7]。本文对从3746份食品中分离的165株李斯特氏菌做了李氏溶血素O和内化素两种致病基因的检测分析，并与小鼠毒力试验、协同溶血试验的结果进行了比较。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 李斯特氏菌的分离鉴定
样品来源：我国12省市售的生肉、熟肉制品、乳、乳制品、冷饮、水产品和蔬菜共计3746份，按国际方法检验[3]。在三糖铁产酸不产气，SIM半固体上呈伞状，尿素酶、甘露醇、木糖、硝酸盐还原均为阴性，过氧化氢、鼠李糖、七叶苷、甲基红、VP阳性的菌株共165株。
1.2 菌株的协同溶血试验(cAMP)和小鼠毒力试验
按GB4789.30—94[5]。
1.3 致病基因检测
内化素引物：Inl1-2，李氏溶血素O引物Hly1-2(由军事医学科院微生物流行病研究所惠赠)，TaqDNA聚合酶、dNTPS购自华美生物工程公司。
, 百拇医药
模板DNA的提取：采用载体快速吸附法[4]
PCR扩增：30μl PCR反应体系含Tris-HCl(pH8.4),Taq酶，引物，dNTPS及模板DNA，循环参数为94℃预变性5′，94℃变性1′，55℃复性1′，72℃延伸1′，35次循环，72℃延伸5′。将扩增产物于加入EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳。
2 结果
2.1 样品中部分典型菌株的PCR产物分析电泳图
A行为内化素引物(446bp)扩增的片段，B行为李氏溶血素O引物(719bp)扩增的片段，1、3、6、8号分别是从生猪肉、生牛奶、水产品和蔬菜中分离出的仅含内化基因的菌株，2、4、5、7、9号分别是从生鸡肉、熟猪肉、生牛奶、冰淇淋和生猪肉中分离出的含内化素基因及李氏溶血素O基因菌株；10号为标志物。
, http://www.100md.com
附图 分离菌株的PCR扩增电泳图
2.2 从食品中分离到的165株李斯特氏菌的致病基因分析
仅有内化素基因者57株，内化素基因和李氏溶血素O基因两者同时阳性的27株，两者同时阴性的81株，见表1。
表1 食品中分离的李斯特氏菌的致病基因分析结果 样品
种类
样品
数量
阳性
样品数
Inl+
Hly-
, http://www.100md.com
Inl+
Hly+
Inl-
Hly-
生肉
784
90
30
11
49
冷饮
359
21
, 百拇医药 6
6
9
熟肉制品
639
11
0
4
7
乳
692
15
4
4
, 百拇医药
7
蔬菜
548
10
6
0
4
水产品
532
16
11
1
4
乳制品
, 百拇医药
192
2
0
1
1
合计
3746
165
57
27
81
2.3 协同溶血(cAMP)试验和小鼠毒力试验与致病基因的相关关系
内化素基因和李氏溶血素O基因同时阴性的81株菌，其协同溶血(cAMP)及小鼠毒力试验全部阴性。内化素基因阳性，李氏溶血素O基因阴性的57株菌中，cAMP均为阴性，除2株小鼠毒力试验阳性外，其它均为阴性。同时含内化素基因和李氏溶血素O基因的27株菌中，13株cAMP阳性，并致小鼠死亡；12株cAMP阴性，也致小鼠死亡；2株cAMP和小鼠毒力均为阴性。
, http://www.100md.com
表2 165株李斯特氏菌的协同溶血和小鼠毒力与致病基因的关系 菌株数
基因型分析
Inl Hly
小鼠毒力
(死亡或发病)
cAMP(协同溶血)
S(1)
R(2)
13
+
+
+
, http://www.100md.com
+
-
12
+
+
+
-
-
2
+
+
-
-
-
, 百拇医药
2
+
-
+
-
-
55
+
-
-
-
-
81
-
, 百拇医药
-
-
-
注：(1)为β溶血金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，(2)为马红球菌(Rhodococcus equi)
3 讨论
1974年李斯特氏菌属包括4个种，到1986年增加到7个种，L.m被定义为“人和多种动物的致病菌”，可分为溶血性和非溶血性两种[5，6]。原L.m中不致病的部分被列为L.innocua英诺克李斯特氏菌(也有人称其为不致病单增李斯特氏菌)。L.innocua与L.m生化反应完全相同，唯一区别为对人和动物没有致病力。我国国家标准检验方法中，将小鼠毒力试验作为这2个种的鉴别指标[5]。李氏溶血素O与内化素是单增李斯特氏菌最主要的致病因子与侵袭性因子，这两个致病基因的位点均在染色体内，两者缺一均无致病性[7]。本研究共分离出生化反应符合L.innocua或L.m的李斯特氏菌165株，李氏溶血素O与内化素二种基因同时阳性的菌株27株，其中小鼠毒力试验亦为阳性的有25株。还有2株仅有内化素基因阳性的菌株，小鼠毒力试验阳性。
, 百拇医药
李氏溶血素O与内化素二种基因同时为阳性的2株菌株，其小鼠毒力试验为阴性的原因也许是致病基因未能很好表达，仅有内化素基因阳性的2株表现出了小鼠毒力。可能与李斯特氏菌的其它的毒力因子，如：增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等有关[4]。细菌为了生存的需要，可以通过表型甚至基因型的改变去适应环境变化，致病菌的致病作用也与此有关。陈清等从体外试验中证明培养液、pH、渗透压、培养时的温度及气体成分均可影响产毒性大肠杆菌(ETEC)肠毒素的表达[6]。李斯特氏菌各毒力因子的作用及表达毒力所需的条件尚不清楚。
小鼠毒力试验阳性菌株中，同时含有李氏溶血素O与内化素2种基因的比例最高，占92.6%(25/27)，仅有内化素基因阳性的57株菌，只有2株表现出了小鼠毒力，2种基因皆为阴性的81株菌，小鼠毒力试验全部为阴性。从本文的结果可以认为小鼠毒力试验阳性是判定单增李斯特氏菌最直观的指标，同时检测李氏溶血素O与内化素2种基因对单增李斯特氏菌有鉴别意义。需特别指出的是，不能仅以内化素基因阳性即判定被检菌株为单增李斯特氏菌。
, 百拇医药
小鼠毒力试验阳性的27株单增李斯特氏菌的溶血反应有阴性也有阳性，与文献报道相符[7]。溶血反应不能作为单增李斯特氏菌的鉴定依据。
(参加实验工作的有：钟平华、封幼玲、李春玲、王为黎、陈伟伟、陈玉珍、高丽云、何洛平、金振韬、余淑冰、廖兴广、张秀丽、陈洪、谢茂慧等为本试验提供菌株，一并致谢。)
* 中国预防医学科学院基金资助课题
作者简介：付萍，女，大学，副研究员
杨瑞馥 郭兆彪 中国军事医学科学院微生物流行病研究所
参考文献
1.Fleming,D W,et al.,Pasteurized milk as a vehicle of infection in an outbreak of listeriosis.New Engl J Med 1985,312:404—407
, http://www.100md.com
2.付萍，冉FDA2，李志刚，等.我国7类食品中单增李斯特氏菌的污染状况调查.卫生研究，1999，28(2)：106—107
3.GB 4789.30-94单核细胞增生性李斯特菌检验
4.Room R C, et al.Rapid and simply method for purification nucleic acid.Clin Microbiol.1990,28:495—502
5.Gaillard J L et al.Entry of L.monocytogenes into cells is mediated by internalin,a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. cell,1991,65:1127—1141
6.陈清，俞守义，王雅贤.环境对产毒性大肠杆菌肠毒素表达的影响.中国微生态学杂志，1998，10(5)：266—270
7.雷祚荣主编.细菌毒毒分子生物学，北京：中国科学技术出版社，1993，190—202
1998-12-14收稿, http://www.100md.com
单位：卫生部食品卫生监督检验所，北京 100021
关键词：李斯持氏菌；内化素基因；李氏溶血素基因
卫生研究\990417 摘要 1996—1997年作者对全国12个省市的7类食品共3746份进行了李斯特氏菌的污染调查，共分离出李斯特氏菌165株。用PCR技术对分离菌株中李斯特氏菌的2种主要致病因子李氏溶血素O和内化素的基因进行了检测，其中57株仅有内化素基因，27株同时具有内化素基因和李氏溶血素O基因。两种致病基因均未检出的共有81株。本研究说明判断单增李氏菌的主要指标是小鼠毒力试验阳性而不是其溶血反应，同时检测溶血素O和内化素2种基因对单增李氏菌有鉴别意义。
中图分类号 R155.31 Q319.3
, 百拇医药
Pathogenic gene analysis of Listeria isolated from foods
Fu Ping,Ran Lu,Li Zhigang,Yao Jinghui,Zhao Xi.et al.
Institute of Food Safety Control and Inspection,Ministry of Health,Beijing 100021,China
In 1996～1997,Listeria in foods from 12 provinces of China were detected by using the national standard examination method GB 4789.30-94(routine traditional methods).Twenty four strains Listeria monocytogenes and 141 strains Listeria were identified by biochemical procedures and animal toxicity experiment.Polymerase Chain Reaction(PCR) was used to amplify two specific DNA fragments(719bp and 446bp) of listeriolysin O and internalin genes with two pares of primer—Hly1-2 and Inl1-2,respectively.The experiment results showed that 57 strains contained only internalin,27 strains contained both internalin and listeriolysin O from the pathogenic genes of isolated strains.
, 百拇医药
Key words: Listeria, Internalin genes, Listeriolysin O genes
单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes简称单增李斯特氏菌，L.m)是重要的食源性疾病的病原菌，可引起人类菌血症，脑膜炎等症状。该菌在自然界分布广泛，不易被寒冷日晒等强烈因素所杀灭，多种食品均受到不同程度的污染。美国在1979～1985年间发生的三次大的食物中毒，均因该菌污染低温杀菌全脂牛奶、生蔬菜和奶制品引起，中毒者死亡率在30%左右[1]，我国虽然未见报道L.m食物中毒，但从冰淇淋、熟肉制品中曾检出L.m，说明存在发生食物中毒的潜在危险[2]。
单增李斯特氏菌已知的致病因子有多种：李氏溶血素O(Listeriolysin O)、内化素(Internalin)、增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等[7]。本文对从3746份食品中分离的165株李斯特氏菌做了李氏溶血素O和内化素两种致病基因的检测分析，并与小鼠毒力试验、协同溶血试验的结果进行了比较。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 李斯特氏菌的分离鉴定
样品来源：我国12省市售的生肉、熟肉制品、乳、乳制品、冷饮、水产品和蔬菜共计3746份，按国际方法检验[3]。在三糖铁产酸不产气，SIM半固体上呈伞状，尿素酶、甘露醇、木糖、硝酸盐还原均为阴性，过氧化氢、鼠李糖、七叶苷、甲基红、VP阳性的菌株共165株。
1.2 菌株的协同溶血试验(cAMP)和小鼠毒力试验
按GB4789.30—94[5]。
1.3 致病基因检测
内化素引物：Inl1-2，李氏溶血素O引物Hly1-2(由军事医学科院微生物流行病研究所惠赠)，TaqDNA聚合酶、dNTPS购自华美生物工程公司。
, 百拇医药
模板DNA的提取：采用载体快速吸附法[4]
PCR扩增：30μl PCR反应体系含Tris-HCl(pH8.4),Taq酶，引物，dNTPS及模板DNA，循环参数为94℃预变性5′，94℃变性1′，55℃复性1′，72℃延伸1′，35次循环，72℃延伸5′。将扩增产物于加入EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳。
2 结果
2.1 样品中部分典型菌株的PCR产物分析电泳图
A行为内化素引物(446bp)扩增的片段，B行为李氏溶血素O引物(719bp)扩增的片段，1、3、6、8号分别是从生猪肉、生牛奶、水产品和蔬菜中分离出的仅含内化基因的菌株，2、4、5、7、9号分别是从生鸡肉、熟猪肉、生牛奶、冰淇淋和生猪肉中分离出的含内化素基因及李氏溶血素O基因菌株；10号为标志物。
, http://www.100md.com
附图 分离菌株的PCR扩增电泳图
2.2 从食品中分离到的165株李斯特氏菌的致病基因分析
仅有内化素基因者57株，内化素基因和李氏溶血素O基因两者同时阳性的27株，两者同时阴性的81株，见表1。
表1 食品中分离的李斯特氏菌的致病基因分析结果 样品
种类
样品
数量
阳性
样品数
Inl+
Hly-
, http://www.100md.com
Inl+
Hly+
Inl-
Hly-
生肉
784
90
30
11
49
冷饮
359
21
, 百拇医药 6
6
9
熟肉制品
639
11
0
4
7
乳
692
15
4
4
, 百拇医药
7
蔬菜
548
10
6
0
4
水产品
532
16
11
1
4
乳制品
, 百拇医药
192
2
0
1
1
合计
3746
165
57
27
81
2.3 协同溶血(cAMP)试验和小鼠毒力试验与致病基因的相关关系
内化素基因和李氏溶血素O基因同时阴性的81株菌，其协同溶血(cAMP)及小鼠毒力试验全部阴性。内化素基因阳性，李氏溶血素O基因阴性的57株菌中，cAMP均为阴性，除2株小鼠毒力试验阳性外，其它均为阴性。同时含内化素基因和李氏溶血素O基因的27株菌中，13株cAMP阳性，并致小鼠死亡；12株cAMP阴性，也致小鼠死亡；2株cAMP和小鼠毒力均为阴性。
, http://www.100md.com
表2 165株李斯特氏菌的协同溶血和小鼠毒力与致病基因的关系 菌株数
基因型分析
Inl Hly
小鼠毒力
(死亡或发病)
cAMP(协同溶血)
S(1)
R(2)
13
+
+
+
, http://www.100md.com
+
-
12
+
+
+
-
-
2
+
+
-
-
-
, 百拇医药
2
+
-
+
-
-
55
+
-
-
-
-
81
-
, 百拇医药
-
-
-
注：(1)为β溶血金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，(2)为马红球菌(Rhodococcus equi)
3 讨论
1974年李斯特氏菌属包括4个种，到1986年增加到7个种，L.m被定义为“人和多种动物的致病菌”，可分为溶血性和非溶血性两种[5，6]。原L.m中不致病的部分被列为L.innocua英诺克李斯特氏菌(也有人称其为不致病单增李斯特氏菌)。L.innocua与L.m生化反应完全相同，唯一区别为对人和动物没有致病力。我国国家标准检验方法中，将小鼠毒力试验作为这2个种的鉴别指标[5]。李氏溶血素O与内化素是单增李斯特氏菌最主要的致病因子与侵袭性因子，这两个致病基因的位点均在染色体内，两者缺一均无致病性[7]。本研究共分离出生化反应符合L.innocua或L.m的李斯特氏菌165株，李氏溶血素O与内化素二种基因同时阳性的菌株27株，其中小鼠毒力试验亦为阳性的有25株。还有2株仅有内化素基因阳性的菌株，小鼠毒力试验阳性。
, 百拇医药
李氏溶血素O与内化素二种基因同时为阳性的2株菌株，其小鼠毒力试验为阴性的原因也许是致病基因未能很好表达，仅有内化素基因阳性的2株表现出了小鼠毒力。可能与李斯特氏菌的其它的毒力因子，如：增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等有关[4]。细菌为了生存的需要，可以通过表型甚至基因型的改变去适应环境变化，致病菌的致病作用也与此有关。陈清等从体外试验中证明培养液、pH、渗透压、培养时的温度及气体成分均可影响产毒性大肠杆菌(ETEC)肠毒素的表达[6]。李斯特氏菌各毒力因子的作用及表达毒力所需的条件尚不清楚。
小鼠毒力试验阳性菌株中，同时含有李氏溶血素O与内化素2种基因的比例最高，占92.6%(25/27)，仅有内化素基因阳性的57株菌，只有2株表现出了小鼠毒力，2种基因皆为阴性的81株菌，小鼠毒力试验全部为阴性。从本文的结果可以认为小鼠毒力试验阳性是判定单增李斯特氏菌最直观的指标，同时检测李氏溶血素O与内化素2种基因对单增李斯特氏菌有鉴别意义。需特别指出的是，不能仅以内化素基因阳性即判定被检菌株为单增李斯特氏菌。
, 百拇医药
小鼠毒力试验阳性的27株单增李斯特氏菌的溶血反应有阴性也有阳性，与文献报道相符[7]。溶血反应不能作为单增李斯特氏菌的鉴定依据。
(参加实验工作的有：钟平华、封幼玲、李春玲、王为黎、陈伟伟、陈玉珍、高丽云、何洛平、金振韬、余淑冰、廖兴广、张秀丽、陈洪、谢茂慧等为本试验提供菌株，一并致谢。)
* 中国预防医学科学院基金资助课题
作者简介：付萍，女，大学，副研究员
杨瑞馥 郭兆彪 中国军事医学科学院微生物流行病研究所
参考文献
1.Fleming,D W,et al.,Pasteurized milk as a vehicle of infection in an outbreak of listeriosis.New Engl J Med 1985,312:404—407
, http://www.100md.com
2.付萍，冉FDA2，李志刚，等.我国7类食品中单增李斯特氏菌的污染状况调查.卫生研究，1999，28(2)：106—107
3.GB 4789.30-94单核细胞增生性李斯特菌检验
4.Room R C, et al.Rapid and simply method for purification nucleic acid.Clin Microbiol.1990,28:495—502
5.Gaillard J L et al.Entry of L.monocytogenes into cells is mediated by internalin,a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. cell,1991,65:1127—1141
6.陈清，俞守义，王雅贤.环境对产毒性大肠杆菌肠毒素表达的影响.中国微生态学杂志，1998，10(5)：266—270
7.雷祚荣主编.细菌毒毒分子生物学，北京：中国科学技术出版社，1993，190—202
1998-12-14收稿, http://www.100md.com