抗除草剂基因(BAR)转基因水稻的毒性试验
作者：王茵 来伟旗 陈建国 梅松 傅逸根 胡欣 张炜煜
单位：浙江省医学科学院，杭州 310013
关键词：抗除草剂基因(BAR)；转基因水稻；致突变
卫生研究000305 摘要：为了对抗除草剂基因(BAR)转基因水稻进行安全性评价，对该样品进行了急性毒性试验、致突变试验及30天喂养试验。结果大、小鼠经口LD50>21.5g/kgBW，无致突变作用，30天喂养试验16、32、64g/kgBW各剂量组大鼠生长发育、体重、食物利用率、血常规、脏体比及病理组织学观察等指标与阴性对照组比差异均无显著性，无作用剂量为64g/kgBW。提示抗除草剂基因(BAR)转基因水稻食用是安全的。
中图分类号：R155.51 R155.52 TS207.5 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)03-0141-02
Toxicity of anti-herbicide gene (BAR) transgenic rice
Wang Yin， Lai Weiqi， Chen Jianguo， Mei Song， et al.
(Zhejiang Academy of Medical Sciences， Hangzhou 310013， China)
Abstract：In order to evaluate the safety of anti-herbicide gene(BAR) transgenic rice， acute toxicity experiments， mutation experiments and a 30-day feeding test were conducted. The results were as follows:The oral LD50 for mice and rats was larger than 21.5 g/kg BW and no mutation was found. The rats consuming 16，32 and 64 g/kg BW were in good growth and development at the 30-day feeding test. The body weight， food utilization， routine blood tests， the ratio of organ weight to body weight， and patho-histological observations had no obvious change. The none effect dosage for the transgene rice was 64 g/kg.
, 百拇医药
Key words:anti-herbicide gene， transgenic rice， mutation
中国水稻研究所把抗除草剂基因引入杂交水稻，培育了转基因杂交水稻稻种，而除草剂选择性杀灭混入的假杂种和杂草，控制大田杂交稻纯度，经大田试验示范效益显著。转基因食物的安全性评价受到国内外的关注。我们对该转基因稻米进行了急性毒性试验、致突变试验及大鼠30天喂养试验，为转基因食品的安全性评价提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 ICR小鼠、SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
1.1.2 抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米、正常水稻稻米由浙江金穗农业基因工程有限公司提供，实验前碾成粉，80℃2小时烘熟。
, http://www.100md.com
1.1.3 菌株TA97a、TA98、TA100、TA102由上海市劳动卫生与职业病研究所提供，生物学鉴定合格。
1.2 方法
1.2.1 急性毒性试验霍恩氏法。
1.2.2 致突变试验 Ames试验：选用标准平板掺入法在加和不加S9的条件下进行，实验设5个剂量组：5 000、1 000、200、40、8μg/皿；另设阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组，阳性物为9AA、2.7AF、NaN3、2AAF、MMC。实验结果以各剂量组平均回变菌落数的比值(MR)来判断。
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：每组10只小鼠，雌雄各半，受试物设3个剂量组(2.5、5.0、10.0g/kgBW)及阴性(1%羧甲基纤维素)、阳性(CP 80mg/kgBW)对照组。按常规进行实验。
, 百拇医药
小鼠精子畸形试验：每组10只小鼠，受试物设3个剂量组(2.5、5.0、10.0g/kgBW)及阴性(1%羧甲基纤维素)、阳性(MMC 2mg/kgBW)对照组。按常规进行实验。
1.2.3 大鼠30天喂养试验[2] 动物随机分成5组，每组20只，雌雄各半，受试物设3个剂量组(16、32、64g/kgBW)另设阴性对照组和基础对照组(基础饲料)。每笼饲养大鼠2只，自由进食饮水。连续观察30天，每周记录体重和进食量，并计算食物利用率，实验期末断头取血、处死，对每只大鼠进行脏器大体观察，同时取肝、肾称重并计算脏体比，每组随机取10只雌雄大鼠进行血常规、血生化检查，并取肝、肾、胃、肠进行病理组织学检查。血常规按临床常规检验方法，血生化检查取血清用OLYMPUS 1000型生化自动分析仪进行测定，脏器石蜡切片，HE染色。
基础饲料配方：玉米粉34%、豆饼粉25%、面粉25%、麸皮5%、鱼粉5%、酵母1%、食盐1%、食用油2%、鱼肝油1%、VB21%。
, 百拇医药
阴性对照饲料配方：豆饼粉25%、鱼粉5%、酵母1%、食盐1%、食用油2%、鱼肝油1%、VB240mg/kg、复合维生素0.2%、复合矿物质1%、米粉64%。5组饲料蛋白质、脂肪测定结果均符合大鼠生长的营养要求(蛋白质≥18%，脂肪≥3%)。
2 结果
2.1 急性毒性试验
2种动物各组无异常体征出现。LD50≥21.5g/kgBW，按急性毒性分级标准属无毒级。
2.2 致突变试验
2.2.1 Ames试验 抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米各剂量组回变菌落数(MR)均未超过自发回变数的2倍，而阳性对照组的回变菌落数均显著增加(MR≥2)。未见抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米的诱变作用。
, http://www.100md.com
2.2.2 小鼠骨髓嗜多染色细胞微核试验 结果显示阳性对照组微核率高达3.36%～3.38%，而剂量组的微核率在0.14%～0.20%，与阴性对照组(0.14%～0.16%)相比差异无显著性(P>0.05)，提示抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米对小鼠骨髓细胞无明显断裂效应。
2.2.3 小鼠精子畸形试验 结果显示各剂量组的精子畸形率在1.28%～1.82%，与阴性对照组(1.82%)相近，而阳性对照组的精子畸形率高达5.52%，提示抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米对小鼠精子形态无影响。
2.3 大鼠30天喂养试验
2.3.1 生长发育 试验期间，低剂量组1只雄鼠死于肺部感染，其余大鼠生长良好，均无异常症状和体征。各剂量组动物的体重、进食量、食物利用率与阴性对照组比差异无显著性；阴性对照组与基础对照组比，经t检验，雄鼠增重差异有极显著性(P<0.01)，雌、雄鼠食物利用率差异有显著性(P<0.05)，结果见附表。
, 百拇医药
2.3.2 血常规及生化检查 血常规检查显示白细胞[雌：(12.6～14.1)×109/L，雄：(14.6～15.8)×109/L]、血色素[雌：(98～109)g/L，雄：(105～121)g/L]均在正常范围。生化指标：谷丙转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、清蛋白/白蛋白(A/G)、胆固醇(Chol)、血糖(Glu)、尿素氮(BUN)均在正常范围内。
附表 抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米对大鼠增
重、食物利用率及血生化指标的测定(n=10，
±s) 组 别
增重
(g)
食物利用率
, http://www.100md.com
(%)
ALT
(IU/L)
TP
(g/L)
ALB
(g/L)
A/G
Chol
(mmol/L)
Glu
(mmol/L)
BUN
, 百拇医药
(mmol/L)
雌性
基础对照组
95.0±17.6
24.1±3.7
71.4±14.05
74.8±2.77
35.6±0.89
0.88
2.28±0.29
6.05±0.72
7.92±0.69
, 百拇医药
阴性对照组
99.5±15.9
27.6±3.4(1)
48.2± 9.34
75.8±3.11
36.6±1.14
0.92
1.79±0.24
6.49±0.70
6.98±0.53
BAR 16g/kg
, 百拇医药 95.1±35.5
28.7±4.7
51.6±10.04
75.4±2.61
36.0±1.58
0.92
1.84±0.19
6.95±0.59
7.06±0.58
BAR 32g/kg
97.6±10.7
26.6±3.1
, http://www.100md.com
53.8±10.26
77.6±1.52
37.0±1.87
0.92
1.88±0.20
7.23±0.76
7.16±0.53
BAR 64g/kg
99.1±13.1
27.1±3.0
54.4± 6.95
77.8±1.64
, 百拇医药
36.6±1.34
0.88
1.74±0.13
7.26±0.80
6.26±0.61
雄性
基础对照组
149.2±19.9
34.1±4.7
91.2±22.64
71.2±4.32
33.8±2.05
, 百拇医药
0.90
1.56±0.15
6.93±1.96
7.50±0.38
阴性对照组
181.2±15.5(2)
38.7±3.2(1)
66.0± 5.83
71.6±3.36
34.6±1.67
0.94
, 百拇医药
1.63±0.10
5.58±1.55
6.42±0.40
BAR 16g/kg
163.7±24.6
38.4±5.9
54.8±10.52
71.0±1.58
34.2±1.30
0.92
1.87±0.34
6.10±1.40
, 百拇医药
6.78±1.81
BAR 32g/kg
162.7±27.4
37.1±5.8
55.0±10.12
69.8±1.79
33.2±1.30
0.92
1.66±0.10
7.66±1.40
6.00±0.25
BAR 64g/kg
, 百拇医药
168.6±33.1
37.9±6.3
58.4± 7.83
69.2±0.84
33.6±0.55
0.94
1.70±0.19
6.83±0.73
6.38±0.42
注：与基础对照组比 (1)P<0.05 (2)P<0.01
2.3.3 病理组织学检查 解剖时大体观察未见异常，脏器系数各剂量组与阴性对照组比较差异无显著性。镜下观察对照组和各剂量组动物的肝、肾、胃、十二指肠均未见有意义的病理改变。
, 百拇医药
3 讨论
由于人对稻米的摄入量较大，30天喂养试验受试物的加入量一般不超过饲料的5%[2]。既要考虑安全倍数，又要考虑动物营养需要，本实验设计增加基础饲料对照和阴性对照，阴性对照调整了基础饲料配方，基础配方中的玉米粉、面粉、麸皮用米粉代替，而其它成分都保留，同时添加0.2%复合维生素和1%复合矿物元素，调整后各剂量组的饲料符合动物生长的营养要求。受试物掺入饲料的量，按体重的10%折算，抗除草剂(BAR)转基因水稻稻米的最高剂量只能达到64g/kgBW。
研究结果表明，抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米未见毒性作用和致突变作用。30天喂养试验各组大鼠生长发育良好，血常规、血生化、脏器系数及病理组织学观察等各项指标均在正常范围内。各剂量组大鼠体重及食物利用率与阴性对照组相比差异无显著性(P>0.05)，而雄鼠阴性对照与基础对照比差异则有显著性(P<0.01，P<0.05)。虽然基础饲料的蛋白质、脂肪含量较高，但出现这种结果可能是阴性对照添加了0.2%复合维生素及1%复合矿物元素之故。因此本实验的阴性对照组的饲料配比及实验设计是可行的。该结果为进一步深入研究转基因稻米安全性提供了科学根据。
作者简介：王茵，女，大学，副研究员
参考文献
1，秦椿华，杨磊，蒋芸，等.化学物致突变致癌检测技术.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1996，59-78，89—96
2，GB15193-94 食品安全性毒理学评价程序和方法
(1999-10-21收稿), 百拇医药
单位：浙江省医学科学院，杭州 310013
关键词：抗除草剂基因(BAR)；转基因水稻；致突变
卫生研究000305 摘要：为了对抗除草剂基因(BAR)转基因水稻进行安全性评价，对该样品进行了急性毒性试验、致突变试验及30天喂养试验。结果大、小鼠经口LD50>21.5g/kgBW，无致突变作用，30天喂养试验16、32、64g/kgBW各剂量组大鼠生长发育、体重、食物利用率、血常规、脏体比及病理组织学观察等指标与阴性对照组比差异均无显著性，无作用剂量为64g/kgBW。提示抗除草剂基因(BAR)转基因水稻食用是安全的。
中图分类号：R155.51 R155.52 TS207.5 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)03-0141-02
Toxicity of anti-herbicide gene (BAR) transgenic rice
Wang Yin， Lai Weiqi， Chen Jianguo， Mei Song， et al.
(Zhejiang Academy of Medical Sciences， Hangzhou 310013， China)
Abstract：In order to evaluate the safety of anti-herbicide gene(BAR) transgenic rice， acute toxicity experiments， mutation experiments and a 30-day feeding test were conducted. The results were as follows:The oral LD50 for mice and rats was larger than 21.5 g/kg BW and no mutation was found. The rats consuming 16，32 and 64 g/kg BW were in good growth and development at the 30-day feeding test. The body weight， food utilization， routine blood tests， the ratio of organ weight to body weight， and patho-histological observations had no obvious change. The none effect dosage for the transgene rice was 64 g/kg.
, 百拇医药
Key words:anti-herbicide gene， transgenic rice， mutation
中国水稻研究所把抗除草剂基因引入杂交水稻，培育了转基因杂交水稻稻种，而除草剂选择性杀灭混入的假杂种和杂草，控制大田杂交稻纯度，经大田试验示范效益显著。转基因食物的安全性评价受到国内外的关注。我们对该转基因稻米进行了急性毒性试验、致突变试验及大鼠30天喂养试验，为转基因食品的安全性评价提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 ICR小鼠、SD大鼠由浙江省实验动物中心提供。
1.1.2 抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米、正常水稻稻米由浙江金穗农业基因工程有限公司提供，实验前碾成粉，80℃2小时烘熟。
, http://www.100md.com
1.1.3 菌株TA97a、TA98、TA100、TA102由上海市劳动卫生与职业病研究所提供，生物学鉴定合格。
1.2 方法
1.2.1 急性毒性试验霍恩氏法。
1.2.2 致突变试验 Ames试验：选用标准平板掺入法在加和不加S9的条件下进行，实验设5个剂量组：5 000、1 000、200、40、8μg/皿；另设阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组，阳性物为9AA、2.7AF、NaN3、2AAF、MMC。实验结果以各剂量组平均回变菌落数的比值(MR)来判断。
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验：每组10只小鼠，雌雄各半，受试物设3个剂量组(2.5、5.0、10.0g/kgBW)及阴性(1%羧甲基纤维素)、阳性(CP 80mg/kgBW)对照组。按常规进行实验。
, 百拇医药
小鼠精子畸形试验：每组10只小鼠，受试物设3个剂量组(2.5、5.0、10.0g/kgBW)及阴性(1%羧甲基纤维素)、阳性(MMC 2mg/kgBW)对照组。按常规进行实验。
1.2.3 大鼠30天喂养试验[2] 动物随机分成5组，每组20只，雌雄各半，受试物设3个剂量组(16、32、64g/kgBW)另设阴性对照组和基础对照组(基础饲料)。每笼饲养大鼠2只，自由进食饮水。连续观察30天，每周记录体重和进食量，并计算食物利用率，实验期末断头取血、处死，对每只大鼠进行脏器大体观察，同时取肝、肾称重并计算脏体比，每组随机取10只雌雄大鼠进行血常规、血生化检查，并取肝、肾、胃、肠进行病理组织学检查。血常规按临床常规检验方法，血生化检查取血清用OLYMPUS 1000型生化自动分析仪进行测定，脏器石蜡切片，HE染色。
基础饲料配方：玉米粉34%、豆饼粉25%、面粉25%、麸皮5%、鱼粉5%、酵母1%、食盐1%、食用油2%、鱼肝油1%、VB21%。
, 百拇医药
阴性对照饲料配方：豆饼粉25%、鱼粉5%、酵母1%、食盐1%、食用油2%、鱼肝油1%、VB240mg/kg、复合维生素0.2%、复合矿物质1%、米粉64%。5组饲料蛋白质、脂肪测定结果均符合大鼠生长的营养要求(蛋白质≥18%，脂肪≥3%)。
2 结果
2.1 急性毒性试验
2种动物各组无异常体征出现。LD50≥21.5g/kgBW，按急性毒性分级标准属无毒级。
2.2 致突变试验
2.2.1 Ames试验 抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米各剂量组回变菌落数(MR)均未超过自发回变数的2倍，而阳性对照组的回变菌落数均显著增加(MR≥2)。未见抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米的诱变作用。
, http://www.100md.com
2.2.2 小鼠骨髓嗜多染色细胞微核试验 结果显示阳性对照组微核率高达3.36%～3.38%，而剂量组的微核率在0.14%～0.20%，与阴性对照组(0.14%～0.16%)相比差异无显著性(P>0.05)，提示抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米对小鼠骨髓细胞无明显断裂效应。
2.2.3 小鼠精子畸形试验 结果显示各剂量组的精子畸形率在1.28%～1.82%，与阴性对照组(1.82%)相近，而阳性对照组的精子畸形率高达5.52%，提示抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米对小鼠精子形态无影响。
2.3 大鼠30天喂养试验
2.3.1 生长发育 试验期间，低剂量组1只雄鼠死于肺部感染，其余大鼠生长良好，均无异常症状和体征。各剂量组动物的体重、进食量、食物利用率与阴性对照组比差异无显著性；阴性对照组与基础对照组比，经t检验，雄鼠增重差异有极显著性(P<0.01)，雌、雄鼠食物利用率差异有显著性(P<0.05)，结果见附表。
, 百拇医药
2.3.2 血常规及生化检查 血常规检查显示白细胞[雌：(12.6～14.1)×109/L，雄：(14.6～15.8)×109/L]、血色素[雌：(98～109)g/L，雄：(105～121)g/L]均在正常范围。生化指标：谷丙转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、清蛋白/白蛋白(A/G)、胆固醇(Chol)、血糖(Glu)、尿素氮(BUN)均在正常范围内。
附表 抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米对大鼠增
重、食物利用率及血生化指标的测定(n=10，
±s) 组 别增重
(g)
食物利用率
, http://www.100md.com
(%)
ALT
(IU/L)
TP
(g/L)
ALB
(g/L)
A/G
Chol
(mmol/L)
Glu
(mmol/L)
BUN
, 百拇医药
(mmol/L)
雌性
基础对照组
95.0±17.6
24.1±3.7
71.4±14.05
74.8±2.77
35.6±0.89
0.88
2.28±0.29
6.05±0.72
7.92±0.69
, 百拇医药
阴性对照组
99.5±15.9
27.6±3.4(1)
48.2± 9.34
75.8±3.11
36.6±1.14
0.92
1.79±0.24
6.49±0.70
6.98±0.53
BAR 16g/kg
, 百拇医药 95.1±35.5
28.7±4.7
51.6±10.04
75.4±2.61
36.0±1.58
0.92
1.84±0.19
6.95±0.59
7.06±0.58
BAR 32g/kg
97.6±10.7
26.6±3.1
, http://www.100md.com
53.8±10.26
77.6±1.52
37.0±1.87
0.92
1.88±0.20
7.23±0.76
7.16±0.53
BAR 64g/kg
99.1±13.1
27.1±3.0
54.4± 6.95
77.8±1.64
, 百拇医药
36.6±1.34
0.88
1.74±0.13
7.26±0.80
6.26±0.61
雄性
基础对照组
149.2±19.9
34.1±4.7
91.2±22.64
71.2±4.32
33.8±2.05
, 百拇医药
0.90
1.56±0.15
6.93±1.96
7.50±0.38
阴性对照组
181.2±15.5(2)
38.7±3.2(1)
66.0± 5.83
71.6±3.36
34.6±1.67
0.94
, 百拇医药
1.63±0.10
5.58±1.55
6.42±0.40
BAR 16g/kg
163.7±24.6
38.4±5.9
54.8±10.52
71.0±1.58
34.2±1.30
0.92
1.87±0.34
6.10±1.40
, 百拇医药
6.78±1.81
BAR 32g/kg
162.7±27.4
37.1±5.8
55.0±10.12
69.8±1.79
33.2±1.30
0.92
1.66±0.10
7.66±1.40
6.00±0.25
BAR 64g/kg
, 百拇医药
168.6±33.1
37.9±6.3
58.4± 7.83
69.2±0.84
33.6±0.55
0.94
1.70±0.19
6.83±0.73
6.38±0.42
注：与基础对照组比 (1)P<0.05 (2)P<0.01
2.3.3 病理组织学检查 解剖时大体观察未见异常，脏器系数各剂量组与阴性对照组比较差异无显著性。镜下观察对照组和各剂量组动物的肝、肾、胃、十二指肠均未见有意义的病理改变。
, 百拇医药
3 讨论
由于人对稻米的摄入量较大，30天喂养试验受试物的加入量一般不超过饲料的5%[2]。既要考虑安全倍数，又要考虑动物营养需要，本实验设计增加基础饲料对照和阴性对照，阴性对照调整了基础饲料配方，基础配方中的玉米粉、面粉、麸皮用米粉代替，而其它成分都保留，同时添加0.2%复合维生素和1%复合矿物元素，调整后各剂量组的饲料符合动物生长的营养要求。受试物掺入饲料的量，按体重的10%折算，抗除草剂(BAR)转基因水稻稻米的最高剂量只能达到64g/kgBW。
研究结果表明，抗除草剂基因(BAR)转基因水稻稻米未见毒性作用和致突变作用。30天喂养试验各组大鼠生长发育良好，血常规、血生化、脏器系数及病理组织学观察等各项指标均在正常范围内。各剂量组大鼠体重及食物利用率与阴性对照组相比差异无显著性(P>0.05)，而雄鼠阴性对照与基础对照比差异则有显著性(P<0.01，P<0.05)。虽然基础饲料的蛋白质、脂肪含量较高，但出现这种结果可能是阴性对照添加了0.2%复合维生素及1%复合矿物元素之故。因此本实验的阴性对照组的饲料配比及实验设计是可行的。该结果为进一步深入研究转基因稻米安全性提供了科学根据。
作者简介：王茵，女，大学，副研究员
参考文献
1，秦椿华，杨磊，蒋芸，等.化学物致突变致癌检测技术.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1996，59-78，89—96
2，GB15193-94 食品安全性毒理学评价程序和方法
(1999-10-21收稿), 百拇医药