小鼠金属硫蛋白-I的表达对HeLa细胞耐药性的影响
作者：李侠 吕文英 殷慎敏 李令媛 茹炳根
单位：北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系，北京 100871
关键词：金属硫蛋白；HeLa细胞；顺铂；阿霉素；耐药性
卫生研究000403 摘要：HpSV2-neo质粒作为载体，在EcoRI酶切位点上插入小鼠金属硫蛋白(MT-I)基因，然后用DNA-磷酸钙介导的基因转移法将重组质粒转染HeLa细胞，经筛选得到表达MT-I的抗性细胞克隆。经检测，G418抗性细胞内有MT的特异性表达，表达量是未转染细胞的2.6倍。用不同浓度顺铂、阿霉素处理细胞，观察MT-I基因的表达与HeLa细胞耐药性的关系。结果表明：0.1μmol/ml顺铂作用细胞72h后，顺铂对转染和未转染MT细胞的生长抑制率分别为34%和82%(P<0.05)；半数细胞生长抑制浓度(IC50)分别为0.144和0.061μmol/ml，二者相差2.36倍。用0.2μmol/ml阿霉素作用细胞72h后，对转染和未转染细胞的生长抑制率分别为18%和25%，差异无显著性(P>0.05)。结果表明，MT与肿瘤细胞的耐药性有一定相关性。
, 百拇医药
中图分类号：Q513 R730.53 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0199-03
Effects of the expression of mouse metallothionein-I
gene in human HeLa cell line on drug resistance
Li Xia, Lü Wenying, Yin Shenmin, Li Lingyuan, et al.
(Department of Molecular Biology, College of Life Sciences, Peking University,) Beijing 100871,China
, http://www.100md.com
Abstract：Metallothionein-I(MT-I) gene was inserted into EcoRI site by using pSV2-neo plasmid vector. Recombiant plasmid was transfected into HeLa cells by DNA-calcium phosphate precipitation technique. MT-I expression colones were growing in medium including G418. The amount of MT-I expression in transfected cells was found 2.6 times higher than that of non-transfected ones. In order to observe the relationship between the expression of MT-I gene in cells and drug resistance, cells were treated with different concentrations of cisplatin and adriamycin respectively. The results indicated that cisplatin(0.1 μmol/ml) inhibited the growth of both transfected and non-transfected cells. The inhibitory rates were 34% and 82% respectively(P<0.05). IC50(50% inhibitory concentration for cell growing) was 0.144μmol/ml and 0.061 μmol/ml and the ratio of them was 2.36: 1 after the treatment of cisplatin 72h later. The cells were treated with adriamycin 72h later, the inhibitory rates of transfected and non-transfected cells were 18% and 25% separately. The rates showed no significant difference (P>0.05). The results indicated that MT was related to drug resistance of tumor cells.
, http://www.100md.com
Key words: metallothionein, HeLa cells, cisplatin, adriamycin, drug resistance
金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。除拮抗电离辐射、清除自由基、对重金属有解毒等生物学功能外，MT在肿瘤细胞病理学、药物的耐药性、减少药物毒性的辅助治疗等方面所起的作用，引起了研究者的关注。然而，有关MT在肿瘤细胞获得性耐药性中的作用的报道，结果极不一致[1，2]。目前肿瘤细胞耐药性问题已经成为制约癌症治疗的关键因素。因此探求MT在此方面的作用，有很大的理论和实践意义。本文采用将小鼠MT-I基因转染HeLa细胞的方法，观察MT基因对细胞抗顺铂、阿霉素药性方面的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料
, 百拇医药
限制性内切酶、培养基分别购自Biolab和OXOID公司；RPMI1640培养基为美国Life Technol公司产品；顺铂(顺式二氯二氨铂930909)由齐鲁制药厂生产：盐酸阿霉素(930406)是中日合资汕头华明制药公司的产品；其他试剂均为分析纯。pSV2-neo质粒由中国科学院动物研究所沈孝宇教授惠赠；含小鼠基因的pSV2-dhfr-MT-I质粒由本室提供。
1.2 pSV2-neo-MT-I质粒的重组与鉴定
参照酶切图谱，分别用EcoRI、EcoRI+HindIII、EcoRI+BamHI酶切pSV2-neo质粒进行质粒鉴定。质粒构建如附图。将质粒与目的基因(MT)片段按1∶10混合，进行连接。用连接产物转化E.Coli DH 5α菌。在含50μg/ml氨苄青霉素的SOB固体培养基上进行重组质粒的筛选：挑选单个阳性生长菌扩增并提取质粒DNA，据酶切图谱鉴定重组质粒中目的基因表达产物的插入方向。
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附图 pSV2-neo-MT-I重组质粒图谱
1.3 pSV2-neo-MT-I重组质粒转染及基因表达产物的检测
采用DNA-磷酸钙介导基因转移法，将正向插入pSV2-neo-MT-I纯化质粒DNA(20μg/106 cells)转染HeLa细胞，经克隆化建立抗性细胞克隆。将细胞克隆扩大培养，收集细胞。用银饱和原子分光光度法及酶联免疫吸附(ELISA)检测MT的含量[3，4]。
1.4 MT-I基因外源性表达对HeLa细胞抗顺铂药性的影响
将表达小鼠MT-I基因的G418(20μg/ml)抗性细胞，按5×104 /ml加入到24孔培养板中。细胞生长于含有15%牛血清的RPMI1640培养基内，37℃、5% CO2常规培养24小时后，分别换以含有终浓度0.05、0.10、0.20 μmol/ml顺铂及相同浓度的阿霉素培养基。药物作用2小时后，换正常培养基，继续培养24、48、72小时收集细胞，计数。取3个培养孔的细胞数均值做为每个剂量组的细胞数，同时设立阴性对照。继续培养72小时的细胞生长抑制率，公式如下：
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2 结果
pSV2-neo质粒图谱及pSV2-neo-MT-I重组质粒图谱如附图所示，将筛选获得的重组质粒用KpnI和BamHI混合酶切，反向插入MT基因的重组体的酶切片段为6.1和3.4kb两个片段；正向插入重组质粒为7.6和1.9个片段，本实验选用正向插入重组质粒A转染HeLa细胞。
实验中用2种方法检测MT的含量。银-血红蛋白饱和法测试结果显示：抗性细胞MT含量为1.88μg/106 cells,未转染细胞MT含量为0.67μg/106 cells,两者相差2.8倍。ELISA检测结果显示：抗性细胞和未转染细胞中MT含量分别为1.26μg/106cells和0.48μg/106 cells，相差2.6倍。两种方法测定结果一致。转染细胞中MT高表达。
转染细胞中高表达的MT-I基因对顺铂、阿霉素的耐药性研究结果如表1和表2所示：当顺铂的浓度为0.05μmol/ml，继续培养72小时时，转染细胞能正常生长，而未转染细胞生长速度明显下降，生长抑制率为41%；当顺铂的浓度为0.1μmol/ml时，转染和未转染细胞的生长均被顺铂所抑制，但被抑制的程度不同，转染细胞的生长抑制率为34%，未转染细胞为82%，二者差异具有显著性(P<0.05)；0.20μmol/ml顺铂作用细胞后，继续培养72小时，未转染细胞全部死亡，转染细胞有33%存活。从生长抑制曲线查出抑制50%细胞生长所需药物浓度(IC50)，转染细胞为0.144μmol/ml，未转染细胞为0.061μmol/ml，两者相差2.36倍，提示MT与HeLa细胞抗顺铂药性有相关性。用0.05～0.10μmol/ml阿霉素处理细胞，细胞生长受到不同程度的抑制。0.20μmol/ml阿霉素处理细胞24小时后，转染细胞生长抑制率为18%，未转染细胞为25%，略高于转染细胞，但差异无显著性。表1 小鼠MT-I基因 在HeLa细胞中的表达对顺铂药物毒作用的影响 顺铂
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(μmol/ml)
未转染细胞数(×104)
生长抑
制率(%)
转染细胞数(×104)
生长抑
制率(%)
0h
24h
48h
72h(1)
0h
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24h
48h
72h(1)
—
8.6
14.3
21.5
26.9
—
8.8
14.5
21.5
26.6
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—
0.05
8.8
7.9
11.0
15.9
41
8.5
14.0
21.0
26.8
—
0.10
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8.6
5.2
4.0
4.8
82
8.5
7.9
14.1
17.5
34
0.20
8.5
1.9
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0.3
0
100
8.5
4.6
5.4
8.7
67
注：(1)药物作用细胞后继续培养时间表2 小鼠MT-I基因在HeLa细胞中的表达对阿霉素药物毒作用的影响 阿霉素(μmol/ml)
未转染细胞数(×104)
生长抑
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制率(%)
转染细胞数(×104)
生长抑
制率(%)
0h
24h
48h
h72(1)
0h
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48h
72h(1)
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—
8.5
14.2
21.7
26.7
—
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14.2
21.4
26.1
—
0.05
8.6
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14.5
21.5
26.8
0
8.5
14.1
22.0
26.1
0
0.10
8.5
13.6
21.0
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25.9
3.0
8.6
13.9
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25.5
2.3
0.20
8.5
10.9
17.1
20.0
25
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8.7
11.6
18.4
21.4
18
注：(1)药物作用细胞后继续培养时间3 讨论
肿瘤细胞的抗药性是肿瘤化疗中最大的障碍之一。已有研究表明，肿瘤细胞抗药性的产生是多机制的。如多药抗性基因的作用、谷胱甘肽的增多、DNA修复作用的增强、DNA拓扑异构酶II降低以及药物活化作用等，都与肿瘤细胞抗药性有关[4，5]。近年来，人们研究发现，MT在肿瘤细胞抗药性中的作用不可忽视。然而研究的角度和方式各不相同，得出的结论也各异。本文用pSV2-neo作为载体质粒，选择正向插入重组质粒转染HeLa细胞，使G418抗性细胞MT基因表达量是未转染的2.8倍。Akaboshi等人认为当MT合成量增加1.5～3.5倍时，可作为研究癌细胞抗药性的模型[6]。因此，本实验采取的研究方法是可行的。
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顺铂杀伤肿瘤细胞的机制是通过与DNA交联来抑制DNA的合成。当1000个碱基对平均结合2.5个铂原子时，立即可见到顺铂对DNA的损伤作用[7]。而又有研究表明，DNA损伤修复是细胞产生抗顺铂表型的机制之一[8]。本实验结果显示G418抗性细胞MT含量较对照增加2.8倍，顺铂抗性增加了2.36倍。已知MT参与DNA复制的调节过程[9]，由于MT在细胞中表达量的增加，可能增加了肿瘤细胞损伤修复能力。然而，同样转染MT的细胞对阿霉素的抗性却未发生显著变化。用0.20μmol/ml阿霉素处理细胞后，培养72小时，转染和未转染细胞的生长抑制率分别为18%和25%。未转染细胞的抑制率是转染细胞的1.38倍。Webber对前列腺癌细胞系的研究发现，抗Cd细胞的MT合成速度增加2.5倍时，阿霉素的IC50仅增加1.5～1.7倍。这可能与阿霉素本身可以抑制MT合成及阿霉素、顺铂杀伤肿瘤细胞的机理不同有关[10]。肿瘤细胞抗性问题是一个极其复杂的遗传表型变化过程，它与多因素多环节有关，然而多具有可逆性[2]。进一步研究MT在肿瘤细胞抗药性中的作用可能成为解决这一问题的重要途径。
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作者简介：李侠，女，博士后
参考文献
1，Schilder RJ, Hall L, Monks A.Metallothionein gene expression and resistance to cisplatinium in human ovarian carcinoma. Inter J Cancer,1990,45：416—422
2，Kasahara K, Yasuhiro F, Kazoto N. Metallothionein content correlated with the sensitivity of human small cell lung cancer lines to cisplatin. Cancer Res,1991, 51:3237—3242
3，Schenhammer AM, Cherian MG. Quantification of metallothioneins by a silver-saturation method. Toxicol Applied Pharmacol,1986,82：417—425
, http://www.100md.com
4，Haris AL, Hochhauser D. Mechanism of multidrug resistance in cancer treatment. Aata Oncol, 1992,31：205—213
5，Eastman A. Mechanism of resistance to cis-platin. Cancer Treat Res, 1991,57：233—249
6，Akaboshi M, Kawai K, Maki M. The number of platinum atoms binding to DNA, RNA and protein molecules of Hela cells treated with cisplatin at its mean lethal concentration. Jpn J Cancer Res, 1992,83(5)：522—526
, 百拇医药
7，Koropatnick J, Pearson J. Altered cisplatin and cadmium resistance and cell survial in CHO cells expressing mouse metallothionein. Mol Pharmacol,1993,44:45—50
8，Chao CCK, Lee YL, Cheng PW. Enhanced host cell reactivation of damaged plasmid DNA in HeLa cells resistant to cis-diammined-chloroplatinum(II) . Cancer Res,1991,51：601—605
9，茹炳根.金属硫蛋白.生物化学与生物物理进展，1991，18：254—259
10，Webber MM,Rehman SMM, Gordon TJ. Metallothionein induction and deinduction in human sensitivity to carcinoma cells:relationship with resistance and sensitivity to adriamycin. Cancer Res,1990,48：4503—4508
(1999-09-09收稿), http://www.100md.com
单位：北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系，北京 100871
关键词：金属硫蛋白；HeLa细胞；顺铂；阿霉素；耐药性
卫生研究000403 摘要：HpSV2-neo质粒作为载体，在EcoRI酶切位点上插入小鼠金属硫蛋白(MT-I)基因，然后用DNA-磷酸钙介导的基因转移法将重组质粒转染HeLa细胞，经筛选得到表达MT-I的抗性细胞克隆。经检测，G418抗性细胞内有MT的特异性表达，表达量是未转染细胞的2.6倍。用不同浓度顺铂、阿霉素处理细胞，观察MT-I基因的表达与HeLa细胞耐药性的关系。结果表明：0.1μmol/ml顺铂作用细胞72h后，顺铂对转染和未转染MT细胞的生长抑制率分别为34%和82%(P<0.05)；半数细胞生长抑制浓度(IC50)分别为0.144和0.061μmol/ml，二者相差2.36倍。用0.2μmol/ml阿霉素作用细胞72h后，对转染和未转染细胞的生长抑制率分别为18%和25%，差异无显著性(P>0.05)。结果表明，MT与肿瘤细胞的耐药性有一定相关性。
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中图分类号：Q513 R730.53 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0199-03
Effects of the expression of mouse metallothionein-I
gene in human HeLa cell line on drug resistance
Li Xia, Lü Wenying, Yin Shenmin, Li Lingyuan, et al.
(Department of Molecular Biology, College of Life Sciences, Peking University,) Beijing 100871,China
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Abstract：Metallothionein-I(MT-I) gene was inserted into EcoRI site by using pSV2-neo plasmid vector. Recombiant plasmid was transfected into HeLa cells by DNA-calcium phosphate precipitation technique. MT-I expression colones were growing in medium including G418. The amount of MT-I expression in transfected cells was found 2.6 times higher than that of non-transfected ones. In order to observe the relationship between the expression of MT-I gene in cells and drug resistance, cells were treated with different concentrations of cisplatin and adriamycin respectively. The results indicated that cisplatin(0.1 μmol/ml) inhibited the growth of both transfected and non-transfected cells. The inhibitory rates were 34% and 82% respectively(P<0.05). IC50(50% inhibitory concentration for cell growing) was 0.144μmol/ml and 0.061 μmol/ml and the ratio of them was 2.36: 1 after the treatment of cisplatin 72h later. The cells were treated with adriamycin 72h later, the inhibitory rates of transfected and non-transfected cells were 18% and 25% separately. The rates showed no significant difference (P>0.05). The results indicated that MT was related to drug resistance of tumor cells.
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Key words: metallothionein, HeLa cells, cisplatin, adriamycin, drug resistance
金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。除拮抗电离辐射、清除自由基、对重金属有解毒等生物学功能外，MT在肿瘤细胞病理学、药物的耐药性、减少药物毒性的辅助治疗等方面所起的作用，引起了研究者的关注。然而，有关MT在肿瘤细胞获得性耐药性中的作用的报道，结果极不一致[1，2]。目前肿瘤细胞耐药性问题已经成为制约癌症治疗的关键因素。因此探求MT在此方面的作用，有很大的理论和实践意义。本文采用将小鼠MT-I基因转染HeLa细胞的方法，观察MT基因对细胞抗顺铂、阿霉素药性方面的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料
, 百拇医药
限制性内切酶、培养基分别购自Biolab和OXOID公司；RPMI1640培养基为美国Life Technol公司产品；顺铂(顺式二氯二氨铂930909)由齐鲁制药厂生产：盐酸阿霉素(930406)是中日合资汕头华明制药公司的产品；其他试剂均为分析纯。pSV2-neo质粒由中国科学院动物研究所沈孝宇教授惠赠；含小鼠基因的pSV2-dhfr-MT-I质粒由本室提供。
1.2 pSV2-neo-MT-I质粒的重组与鉴定
参照酶切图谱，分别用EcoRI、EcoRI+HindIII、EcoRI+BamHI酶切pSV2-neo质粒进行质粒鉴定。质粒构建如附图。将质粒与目的基因(MT)片段按1∶10混合，进行连接。用连接产物转化E.Coli DH 5α菌。在含50μg/ml氨苄青霉素的SOB固体培养基上进行重组质粒的筛选：挑选单个阳性生长菌扩增并提取质粒DNA，据酶切图谱鉴定重组质粒中目的基因表达产物的插入方向。
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附图 pSV2-neo-MT-I重组质粒图谱
1.3 pSV2-neo-MT-I重组质粒转染及基因表达产物的检测
采用DNA-磷酸钙介导基因转移法，将正向插入pSV2-neo-MT-I纯化质粒DNA(20μg/106 cells)转染HeLa细胞，经克隆化建立抗性细胞克隆。将细胞克隆扩大培养，收集细胞。用银饱和原子分光光度法及酶联免疫吸附(ELISA)检测MT的含量[3，4]。
1.4 MT-I基因外源性表达对HeLa细胞抗顺铂药性的影响
将表达小鼠MT-I基因的G418(20μg/ml)抗性细胞，按5×104 /ml加入到24孔培养板中。细胞生长于含有15%牛血清的RPMI1640培养基内，37℃、5% CO2常规培养24小时后，分别换以含有终浓度0.05、0.10、0.20 μmol/ml顺铂及相同浓度的阿霉素培养基。药物作用2小时后，换正常培养基，继续培养24、48、72小时收集细胞，计数。取3个培养孔的细胞数均值做为每个剂量组的细胞数，同时设立阴性对照。继续培养72小时的细胞生长抑制率，公式如下：
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2 结果
pSV2-neo质粒图谱及pSV2-neo-MT-I重组质粒图谱如附图所示，将筛选获得的重组质粒用KpnI和BamHI混合酶切，反向插入MT基因的重组体的酶切片段为6.1和3.4kb两个片段；正向插入重组质粒为7.6和1.9个片段，本实验选用正向插入重组质粒A转染HeLa细胞。
实验中用2种方法检测MT的含量。银-血红蛋白饱和法测试结果显示：抗性细胞MT含量为1.88μg/106 cells,未转染细胞MT含量为0.67μg/106 cells,两者相差2.8倍。ELISA检测结果显示：抗性细胞和未转染细胞中MT含量分别为1.26μg/106cells和0.48μg/106 cells，相差2.6倍。两种方法测定结果一致。转染细胞中MT高表达。
转染细胞中高表达的MT-I基因对顺铂、阿霉素的耐药性研究结果如表1和表2所示：当顺铂的浓度为0.05μmol/ml，继续培养72小时时，转染细胞能正常生长，而未转染细胞生长速度明显下降，生长抑制率为41%；当顺铂的浓度为0.1μmol/ml时，转染和未转染细胞的生长均被顺铂所抑制，但被抑制的程度不同，转染细胞的生长抑制率为34%，未转染细胞为82%，二者差异具有显著性(P<0.05)；0.20μmol/ml顺铂作用细胞后，继续培养72小时，未转染细胞全部死亡，转染细胞有33%存活。从生长抑制曲线查出抑制50%细胞生长所需药物浓度(IC50)，转染细胞为0.144μmol/ml，未转染细胞为0.061μmol/ml，两者相差2.36倍，提示MT与HeLa细胞抗顺铂药性有相关性。用0.05～0.10μmol/ml阿霉素处理细胞，细胞生长受到不同程度的抑制。0.20μmol/ml阿霉素处理细胞24小时后，转染细胞生长抑制率为18%，未转染细胞为25%，略高于转染细胞，但差异无显著性。表1 小鼠MT-I基因 在HeLa细胞中的表达对顺铂药物毒作用的影响 顺铂
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(μmol/ml)
未转染细胞数(×104)
生长抑
制率(%)
转染细胞数(×104)
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0h
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注：(1)药物作用细胞后继续培养时间表2 小鼠MT-I基因在HeLa细胞中的表达对阿霉素药物毒作用的影响 阿霉素(μmol/ml)
未转染细胞数(×104)
生长抑
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制率(%)
转染细胞数(×104)
生长抑
制率(%)
0h
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注：(1)药物作用细胞后继续培养时间3 讨论
肿瘤细胞的抗药性是肿瘤化疗中最大的障碍之一。已有研究表明，肿瘤细胞抗药性的产生是多机制的。如多药抗性基因的作用、谷胱甘肽的增多、DNA修复作用的增强、DNA拓扑异构酶II降低以及药物活化作用等，都与肿瘤细胞抗药性有关[4，5]。近年来，人们研究发现，MT在肿瘤细胞抗药性中的作用不可忽视。然而研究的角度和方式各不相同，得出的结论也各异。本文用pSV2-neo作为载体质粒，选择正向插入重组质粒转染HeLa细胞，使G418抗性细胞MT基因表达量是未转染的2.8倍。Akaboshi等人认为当MT合成量增加1.5～3.5倍时，可作为研究癌细胞抗药性的模型[6]。因此，本实验采取的研究方法是可行的。
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顺铂杀伤肿瘤细胞的机制是通过与DNA交联来抑制DNA的合成。当1000个碱基对平均结合2.5个铂原子时，立即可见到顺铂对DNA的损伤作用[7]。而又有研究表明，DNA损伤修复是细胞产生抗顺铂表型的机制之一[8]。本实验结果显示G418抗性细胞MT含量较对照增加2.8倍，顺铂抗性增加了2.36倍。已知MT参与DNA复制的调节过程[9]，由于MT在细胞中表达量的增加，可能增加了肿瘤细胞损伤修复能力。然而，同样转染MT的细胞对阿霉素的抗性却未发生显著变化。用0.20μmol/ml阿霉素处理细胞后，培养72小时，转染和未转染细胞的生长抑制率分别为18%和25%。未转染细胞的抑制率是转染细胞的1.38倍。Webber对前列腺癌细胞系的研究发现，抗Cd细胞的MT合成速度增加2.5倍时，阿霉素的IC50仅增加1.5～1.7倍。这可能与阿霉素本身可以抑制MT合成及阿霉素、顺铂杀伤肿瘤细胞的机理不同有关[10]。肿瘤细胞抗性问题是一个极其复杂的遗传表型变化过程，它与多因素多环节有关，然而多具有可逆性[2]。进一步研究MT在肿瘤细胞抗药性中的作用可能成为解决这一问题的重要途径。
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作者简介：李侠，女，博士后
参考文献
1，Schilder RJ, Hall L, Monks A.Metallothionein gene expression and resistance to cisplatinium in human ovarian carcinoma. Inter J Cancer,1990,45：416—422
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3，Schenhammer AM, Cherian MG. Quantification of metallothioneins by a silver-saturation method. Toxicol Applied Pharmacol,1986,82：417—425
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4，Haris AL, Hochhauser D. Mechanism of multidrug resistance in cancer treatment. Aata Oncol, 1992,31：205—213
5，Eastman A. Mechanism of resistance to cis-platin. Cancer Treat Res, 1991,57：233—249
6，Akaboshi M, Kawai K, Maki M. The number of platinum atoms binding to DNA, RNA and protein molecules of Hela cells treated with cisplatin at its mean lethal concentration. Jpn J Cancer Res, 1992,83(5)：522—526
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7，Koropatnick J, Pearson J. Altered cisplatin and cadmium resistance and cell survial in CHO cells expressing mouse metallothionein. Mol Pharmacol,1993,44:45—50
8，Chao CCK, Lee YL, Cheng PW. Enhanced host cell reactivation of damaged plasmid DNA in HeLa cells resistant to cis-diammined-chloroplatinum(II) . Cancer Res,1991,51：601—605
9，茹炳根.金属硫蛋白.生物化学与生物物理进展，1991，18：254—259
10，Webber MM,Rehman SMM, Gordon TJ. Metallothionein induction and deinduction in human sensitivity to carcinoma cells:relationship with resistance and sensitivity to adriamycin. Cancer Res,1990,48：4503—4508
(1999-09-09收稿), http://www.100md.com